Композитные наночастицы на основе полидофамина с редокс-лабильными полимерными оболочками для контролируемого высвобождения лекарств и усиленной химиофотермической терапии

Введение

Фототермическая терапия (ФТТ), неинвазивное местное лечение рака, привлекает большое внимание в терапии рака благодаря своей высокой селективности и минимальным побочным эффектам [1]. В режиме PTT воздействие лазера в ближней инфракрасной области (NIR) поглощается агентами фототермического преобразования (PTC) и преобразуется в локальную гипертермию, что приводит к абляции опухоли [2,3,4]. Эффект PTC был обнаружен у различных наноматериалов, таких как наноструктуры золота [5,6,7], наноматериалы на основе углерода [8,9,10,11,12], Fe ₃ О ₄ нанокластеры [13,14,15], нанокристаллы CuS [16] и природный меланин [17], все из которых обладают сильным оптическим поглощением в оптическом окне ткани в ближнем ИК-диапазоне. Среди этих агентов PTC полидофамин (PDA), имитатор адгезионных белков, обнаруженных в мидиях, демонстрирует сильное поглощение NIR, высокую эффективность PTC (40%), отличную биосовместимость и биоразлагаемость, которые широко исследовались при применении PTT [ 18, 19]. Однако однократное использование PTT демонстрирует ограниченную клиническую эффективность из-за недостаточной доставки тепла в целевую область без повреждения окружающих нормальных тканей [20]. Чтобы решить эту проблему, многие исследователи использовали химиофотермическую терапию с комбинацией гипертермии и химиотерапевтических агентов, поскольку ее синергетический эффект обусловлен ускоренной доставкой лекарств в опухоли и повышенной токсичностью лекарств за счет гипертермии [21, 22].

Для достижения оптимального лечебного эффекта текущая работа посвящена разработке новой терапевтической наночастицы с высокоэффективным фототермическим преобразованием, отличной способностью загружать лекарство и контролируемым высвобождением лекарства. В нашу систему был введен «умный» полимерный слой, сшитый расщепляемым линкером, чтобы обеспечить возможность разложения и контролируемое высвобождение лекарства из носителей инициированным образом. Дисульфидная связь, которая может расщепляться свободными тиолами, является многообещающим кандидатом в качестве расщепляемого линкера из-за его чувствительной реакции на окислительно-восстановительное состояние, высокой стабильности в кровообращении и хорошей биосовместимости [23]. Носители лекарств, содержащие дисульфидные связи, могут подвергаться избирательной деградации при попадании в опухолевые клетки, в которых концентрация восстанавливающего глутатиона (GSH) (примерно 2–10 мМ) намного выше, чем во внеклеточных жидкостях [24,25,26]. Здесь был приготовлен новый тип композитных наночастиц, состоящий из сфер PDA в качестве ядра и сшитого дисульфидной связью поли (метакриловой кислоты) (PMAA) в качестве оболочки, обозначенный как PDA @ PMAA, который поддерживает эффективность PTC ядра PDA и редокс-лабильность полимерной оболочки. Структура, свойства и характер высвобождения лекарственного средства композитных наночастиц PDA @ PMAA были изучены, а химиофотермический терапевтический эффект был дополнительно продемонстрирован с помощью анализа MTT.

Методы / экспериментальные

Материалы

Гидрохлорид допамина (DA-HCl), метакрилоилхлорид и глутатион (GSH) были получены от Aladdin Reagent Corporation, Шанхай, Китай. Метакриловая кислота (MAA) и N, N ’ -бис (акрилоил) цистамин (ВАС) был приобретен у Sigma-Aldrich. 2,2-азобисизобутиронитрил (AIBN) был получен от Sinopharm Chemical Reagent Company и перекристаллизован из этанола. Водный раствор аммиака (NH ₃ • H ₂ O, 30%), ацетонитрил и безводный этанол были приобретены у Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Company. Доксорубицин (DOX) в форме гидрохлоридной соли был получен от Beijing Huafeng United Technology Company. Анализ МТТ (3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолийбромид) и другие биологические реагенты были приобретены у Invitrogen Corp. Кальцеин-AM был приобретен у Bojin Biotech, Inc. (Сиань) . Все химические реагенты были аналитической чистоты или выше и использовались без дополнительной очистки, за исключением случаев, указанных выше.

Характеристика

Изображения, полученные с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), наблюдали на просвечивающем электронном микроскопе Tecnai G2 20 TWIN (FEI, США). Гидродинамические диаметры и дзета-потенциалы частиц определяли с помощью анализатора размера частиц с динамическим светорассеянием (DLS) (Malvern Nano-ZS90) при угле рассеяния 90 °. УФ-видимые спектры снимали на спектрофотометре Perkin-Elmer Lambda 750 при комнатной температуре. Инфракрасные спектры с преобразованием Фурье (FT-IR) записывали с использованием пластин, прессованных с KBr, на спектроскопии FTIR Nicolet 6700. Эффекты NIR-нагрева наночастиц PDA и PDA @ PMAA были охарактеризованы с использованием непрерывного инфракрасного лазера с длиной волны 808 нм (Changchun New Industries Optoelectronics Technology, Чанчунь, Китай; размер пятна:6 мм × 7 мм) с лазерным облучением при мощности плотность 5 Вт см ⁻² на 300 с. Температуры до и после освещения измерялись термопарой с точностью до 0,1 ^° . C. Изображения клеток были получены с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа (CLSM, Leica TCS SP8 STED 3X).

Композитные наночастицы КПК @ PMAA

Синтез сфер PDA проводили в смешанном растворе деионизированной воды (90 мл), этанола (40 мл) и NH ₃ . • H ₂ O (3 мл), добавляя 0,5 г гидрохлорида допамина. Раствор перемешивали при 30 ^° . C в течение 24 ч, продукт центрифугировали и промывали. Оболочка из ПМАК была синтезирована методом дистилляционно-осаждающей полимеризации согласно нашей предыдущей работе. MAA (100 мг), BAC (10 мг) и AIBN (3 мг) растворяли в 25 мл ацетонитрила с последующим добавлением 50 мг предварительно приготовленных сфер PDA. Затем смесь нагревали до 100 ^° . C перемешивали в течение 2 ч, продукт центрифугировали и промывали. Массовое соотношение PDA и MAA варьировалось от 0,5 до 6 для настройки толщины оболочки PMAA, а подробности рецепта были перечислены в таблице 1.

Фототермические эффекты КПК @ PMAA

Водная дисперсия PDA @ PMAA (50 мкг мл ^-1 ), помещенный в 96-луночный планшет для клеток (100 мкл на лунку), освещали 808-нм NIR-лазером (5 Вт см ^-2 ), а также были измерены температуры до и после освещения.

Загрузка и выдача лекарств

DOX был выбран в качестве модельного лекарственного средства для исследования нагрузки лекарственного средства и контролируемого высвобождения наночастиц PDA или PDA @ PMAA. Конкретные шаги относятся к нашей предыдущей работе [27, 28]. Вкратце, 10 мг наночастиц PDA или PDA @ PMAA-1 были диспергированы в 1 мл водного раствора DOX (1 мг / мл ^-1 ), pH которого предварительно доводили до 8,0. После осторожного перемешивания в течение 24 часов при комнатной температуре дисперсию центрифугировали для сбора нагруженных DOX наночастиц PDA @ PMAA (12000 об / мин, 10 мин), а затем дважды промывали деионизированной водой для удаления ненагруженного DOX. Были измерены УФ-спектры поглощения супернатанта, и интенсивность при 480 нм была использована для анализа загрузки и высвобождения DOX. Содержание загруженного лекарственного средства (LC) и эффективность инкапсуляции (EE) выражали по следующим формулам:LC (%) =(масса загруженного лекарственного средства) / (общая масса наночастиц); EE (%) =(вес загруженного лекарства) / (вес первоначально добавленного лекарства).

Исследование высвобождения in vitro проводили при 37 ° C в фосфатном буфере (pH 7,4 и 5,5) с GSH или без него. Обычно наночастицы PDA @ PMAA, нагруженные DOX, диспергированные в соответствующем буфере, помещали в диализный мешок (отсечка молекулярной массы 14000 Да), а затем погружали в 100 мл высвобождающей среды. Образцы хранили при 37 ^° . C при постоянном встряхивании. В разные моменты времени отбирали 2 мл внешнего буфера для анализа УФ-видимых спектров и добавляли равный объем свежей среды. Все данные о высвобождении DOX были усреднены по трем измерениям, и содержание высвобождения рассчитывалось по формуле:Содержание высвобождения (%) =(количество лекарственного средства в среде высвобождения) / (количество лекарственного средства, загруженного в наночастицы) × 100. Высвобождение лекарственного средства Поведение нагруженных DOX наночастиц PDA @ PMAA при лазерном облучении в фосфатном буфере с pH 7,4 определяли по аналогичной процедуре. Свет в ближнем инфракрасном диапазоне применялся в течение 5 минут в час.

Анализ клеток in vitro

Клетки HEK-293T (клетки эмбриональной почки человека, нормальные клетки) и клетки A549 (эпителиальные клетки аденокарциномы легких человека, раковые клетки) культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% FBS (фетальная бычья сыворотка), пенициллина (100%). U мл ⁻¹ ) и стрептомицин (100 мг мл ^-1 ) во влажной атмосфере с 5% CO ₂ при 37 ° С.

Для наблюдения за клеточным захватом клетки A549 (1 × 10 ⁴ клеток на лунку) высевали в 6-луночный планшет в 1,5 мл среды. Через 24 часа среду заменяли средой, содержащей наночастицы PDA @ PMAA, нагруженные DOX. Через 1 или 4 часа добавляли свежие DMEM и PBS, чтобы смыть свободные наночастицы, не интернализованные клетками, перед наблюдением флуоресценции. Внутриклеточное распределение наночастиц наблюдали с помощью CLSM. Флуоресценцию получали при λ _EX (488 нм) для DOX, а ложный цвет был искусственно установлен как красный.

Цитотоксичность нагруженных DOX и холостых наночастиц PDA @ PMAA в отношении клеток A549 оценивали с помощью стандартного анализа МТТ. Ячейки (с плотностью 10 ⁴ клеток на лунку) инкубировали в 96-луночных планшетах в течение 24 ч для прикрепления клеток. Затем к клеткам добавляли нагруженные DOX и холостые наночастицы PDA @ PMAA и свободный DOX в различных концентрациях. Для групп лазеров БИК лазер ( λ =808 нм) применяли для облучения ячеек с плотностью мощности 5 Вт / см ^-2 в течение 300 с после 1 ч инкубации. Затем, после инкубации в течение 24 часов при 37 ^° C, 20 мкл раствора МТТ (5 мг мл ^-1 в фосфатном буфере) заменяли свежей DMEM, содержащей МТТ (5 мг мл ^-1 ), и клетки инкубировали еще 4 ч. Затем супернатант удаляли и в каждую лунку добавляли 150 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) для растворения формазана. Оптическую плотность контролировали при 570 нм с помощью спектрофотометра после 10 мин инкубации. Каждую точку данных собирали путем усреднения данных по пяти лункам, и необработанные клетки использовали в качестве контроля. Процент жизнеспособности клеток рассчитывали путем сравнения оптической плотности контрольных клеток с оптической плотностью обработанных клеток. Тот же процесс цитотоксичности холостых композитных наночастиц против клеток HEK-293T был выполнен, как указано выше.

Для визуализации противоопухолевых эффектов наночастиц PDA @ PMAA и нагруженных DOX наночастиц PDA @ PMAA с или без облучения лазером NIR, клетки высевали в 6-луночные планшеты с плотностью 3 × 10 ⁴ клеток на лунку. Клетки подвергали воздействию наночастиц PDA @ PMAA-1, нагруженных DOX наночастиц PDA @ PMAA-1 или свободного DOX в течение 24 часов при концентрации наночастиц 100 мкг / мл ^-1 или эквивалентная концентрация DOX 5 мкг / мл ^-1 . Для групп лазеров БИК лазер ( λ =808 нм) применяли для облучения ячеек с плотностью мощности 5 Вт / см ^-2 в течение 300 с после 1 ч инкубации. Затем клетки инкубировали с кальцеином-AM в течение 30 минут, трижды промывали с помощью PBS и наблюдали с помощью CLSM при λ _EX (490 нм).

Результаты и обсуждение

Подготовка и характеристика наночастиц PDA @ PMAA

Сфера КПК подготовлена ​​при базовых условиях через растворно-окислительный метод. Химическое покрытие сферы PDA слоем сшитого дисульфидом полимера было достигнуто методом дистилляции-осаждения полимеризации, в котором MAA и BAC используются в качестве мономера и сшивающего агента, соответственно (рис. 1). Эта многофункциональная композитная наночастица обеспечивает множество преимуществ перед другими терапевтическими наночастицами в трех аспектах. Во-первых, сердечник КПК демонстрирует выдающиеся фототермические характеристики при облучении в ближней инфракрасной области. Во-вторых, включение дисульфидной связи обеспечивает избирательную деградацию полимерных оболочек, а также контролируемое высвобождение лекарства при попадании в раковые клетки. В-третьих, оболочка из ПМАК обеспечивает наночастицам превосходную коллоидную стабильность. Толщиной слоя PMAA можно управлять, регулируя массовое соотношение сфер MAA и PDA. На рис. 2 представлены ПЭМ-изображения полученных сфер PDA и наночастиц PDA @ PMAA. Очевидно, что наночастицы как PDA, так и PDA @ PMAA являются монодисперсными и имеют сферическую форму. Сферы PDA имели средний диаметр ~ 100 нм, а размер гибридных наночастиц PDA @ PMAA составлял от 120 ± 5 до 200 ± 10 нм с массовым отношением PDA к MAA от 0,5 до 6. Гидродинамический размер (D _h ) и распределение по размерам наночастиц PDA и PDA @ PMAA также характеризовались динамическим светорассеянием (DLS), как показано в таблице 2. Наночастицы PDA @ PMAA имели узкое распределение по размерам, обычно со значением PI 0,09–0,14. D _h Наночастицы серии PDA @ PMAA имели диапазон от 176 до 349 нм за счет изменения массового отношения PDA к MAA, что соответствовало тенденции роста размера по данным наблюдений с помощью ПЭМ. Примечательно, что D _h Композитные наночастицы были больше, чем размер, определенный с помощью ПЭМ, что позволяет предположить, что композитные наночастицы сильно набухают в водной среде [29]. Ζ-потенциал наночастиц PDA составлял -26,8 мВ из-за катехоловых групп на поверхности PDA. Ζ-потенциал наночастиц PDA @ PMAA изменился с -30,2 до 33,2, указывая на то, что наличие карбоксильных групп происходит из оболочки PMAA.

Схематическое изображение синтеза, фототермического эффекта, нагрузки лекарством и высвобождения лекарственного средства в ответ на стимул наночастиц PDA @ PMAA

ПЭМ-изображения наночастиц PDA @ PMAA (масштабная линейка, 200 нм). а КПК. б [email protected]. c КПК @ PMAA-1. г КПК @ PMAA-2. е КПК @ PMAA-4. е КПК @ PMAA-6

Поскольку MAA чувствителен к pH, можно сделать вывод, что наносферы PDA @ PMAA также обладают чувствительностью к pH. Как показано на рис. 3, наночастицы PDA @ PMAA-1 были взяты в качестве примера для исследования pH-зависимости гидродинамического размера наночастиц, покрытых PMAA. Можно видеть, что в фосфатном буфере с pH 8,5 наночастицы PDA @ PMAA-1 имеют гидродинамический диаметр около 240 нм; в то время как в кислой среде с pH 3,0 их гидродинамический размер значительно сократился до прибл. 150 нм. Поскольку полимерные цепи ПМАК сильно ионизируются при высоком pH, и сильное электростатическое отталкивание между полимерными цепями приводит к увеличению гидродинамического размера, тогда как при низком pH низкая степень ионизации цепей ПМАК приводит к уменьшению размера [30]. PH-чувствительные наночастицы PDA @ PMAA демонстрируют большой потенциал в контролируемом высвобождении лекарства в опухолевых клетках (pH ниже 6,5), поскольку разрушение губчатого полимерного слоя может способствовать высвобождению лекарства. Химическая структура наночастиц PDA @ PMAA была охарактеризована с помощью инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье (FTIR) (рис. 4). В спектрах наночастиц ВАС и PDA @ PMAA появляются полосы при 1650 и 1550 см ⁻¹ , которые приписываются типичным полосам амидов I и II ВАС, продемонстрировали, что сшивающий ВАС был успешно введен в композитную наночастицу [25]. Пик при 1706 см ⁻¹ , который принадлежит к валентному колебанию групп C =O в PMAA, можно ясно увидеть в наночастицах PDA @ PMAA, отличных от наночастиц PDA, что свидетельствует об успешном покрытии слоя PMAA.

Гидродинамический диаметр наночастиц PDA @ PMAA-1 в фосфатном буфере при различных pH

FTIR-спектры сшивающих агентов ВАС, наночастиц PDA и наночастиц PDA @ PMAA (сверху вниз)

Фототермический эффект наночастиц PDA @ PMAA

Интенсивность поглощения в ближней инфракрасной области является основным фактором, определяющим способность PTC агента. Чтобы исследовать светопоглощающую способность наночастиц PDA @ PMAA, их УФ-видимые спектры суммированы на рис. 5a. Видно, что каждый образец имеет очевидное поглощение в ближней ИК-области от 600 до 1000 нм. По сравнению с PDA @ PMAA, PDA демонстрирует наивысшее поглощение при 808 нм при эквивалентной массовой концентрации. Поглощение наночастиц PDA @ PMAA увеличивалось с уменьшением толщины оболочки PMAA (с PDA @ PMAA-6 до PDA@PMAA-0,5). Сильное оптическое поглощение в ближней ИК-области побудило нас продолжить изучение фототермического эффекта PDA @ PMAA. Как показано на фиг. 5b, фототермический эффект водной дисперсии PDA и PDA @ PMAA был измерен при концентрации 100 мкг мл ^-1 . облучается лазером с длиной волны 808 нм при мощности 5 Вт / см ⁻² на 300 с. Чистая вода использовалась в качестве отрицательного контроля. Повышена температура распыления КПК на 41 ^° . C и выше, чем у всех образцов PDA @ PMAA, что соответствует его максимальному поглощению при 808 нм. Температура, повышенная дисперсиями PDA @ PMAA, может достигать от 17 до 33 ^° . C с уменьшением толщины оболочки PMAA (с PDA @ PMAA-6 до PDA@PMAA-0,5), намного выше, чем вызванное контролем чистой воды (достигает только 3,5 ^° C). Предыдущие исследования показали, что термотерапия с температурой выше 55 ^° C показал большие преимущества при термической абляции солидной опухоли [31]. Сравнивая максимальное повышение температуры серии наночастиц PDA @ PMAA, только PDA@PMAA-0,5 (58 ^° C) и КПК @ PMAA-1 (56 ^° C) может достигать 55 ^° C. Учитывая, что оболочка из PMAA должна иметь определенную толщину, чтобы обеспечить ее способность загружать лекарственные средства, PDA @ PMAA-1 был выбран в качестве репрезентативного для следующих экспериментов.

а УФ-видимые спектры водной дисперсии КПК и КПК @ PMAA при концентрации 100 мкг мл ^-1 . б Фототермический эффект водной дисперсии КПК и КПК @ ПМАК при концентрации 100 мкг мл ^-1 были измерены с помощью лазерного излучения ( λ =808 нм, 5 Вт / см ⁻² )

Выпуск лекарства in vitro

Доксорубицин (DOX) был выбран в качестве модельного лекарственного средства для подтверждения потенциальной способности наночастиц композита PDA @ PMAA-1 высвобождать инкапсулированное лекарственное средство в восстановительных условиях. Загрузка DOX в композитные наночастицы выполнялась при теоретическом содержании загрузки лекарственного средства 9,1 мас.% И концентрации полимера 10 мг / мл ^-1 . , а конечное содержание загрузки лекарственного средства и эффективность инкапсуляции составляли 5,1% и 53,7% соответственно. Это указывает на то, что DOX может быть эффективно загружен в полимерную сеть. Наночастицы PDA, нагруженные DOX, также были приготовлены для сравнения, содержание загрузки DOX в которых составляло 3,7%. Более высокая способность наночастиц PDA @ PMAA-1 загружать лекарство может быть объяснена сильным электростатическим взаимодействием между аминогруппой молекул DOX и карбоксильными группами цепей PMAA [25]. Ввиду того, что оболочка PMAA несет окислительно-восстановительные дисульфидные связи, предварительно загруженные лекарства будут задействованы для эффективного высвобождения предварительно загруженных лекарств в восстанавливающих условиях. Принимая во внимание слабокислое микроокружение опухоли и огромную разницу в концентрации GSH между внутриклеточной (1–10 мМ) и плазмой (20–40 мкМ), эксперименты по высвобождению лекарственного средства in vitro были разработаны и проведены с использованием фосфатных буферов с pH 7,4 и 5,5. с или без 10 мМ GSH для имитации опухолевых клеток и среды кровотока [23, 32, 33]. Как показано на фиг. 6, количество высвобождаемого лекарственного средства составляет только 10,8% в течение 24 часов, что позволяет предположить, что DOX стабильно удерживался в наночастицах PDA @ PMAA-1, когда они были диспергированы в физиологических условиях. В присутствии 10 мМ GSH было обнаружено удивительно быстрое высвобождение лекарственного средства, при этом кумулятивное высвобождение DOX составило примерно 72,8% в течение 24 часов из-за разложения дисульфидно-связанных оболочек PMAA в восстанавливающей среде. Тем не менее, структура ядра КПК сохраняет целостность после окислительно-восстановительной деградации (дополнительный файл 1:рисунок S2). Более того, всплеск высвобождения (примерно 87% в течение 24 часов) DOX наблюдался в фосфатных буферах с pH 5,5 с 10 мМ GSH из-за протонирования карбоксильных групп в PMAA в кислых условиях, что в дальнейшем вызывало коллапс полимера. сети. Эти профили высвобождения подразумевают многообещающую особенность наночастиц PDA @ PMAA для контролируемого высвобождения лекарств, поскольку наночастицы демонстрируют низкую утечку лекарств в плазму, однако быстро высвобождают лекарства при попадании в опухолевые клетки. Кроме того, было обнаружено медленное высвобождение лекарства (примерно 13% в течение 24 часов) для нагруженных DOX наночастиц PDA @ PMAA при БИК-облучении в фосфатных буферах с pH 7,4, что указывает на то, что наночастицы PDA @ PMAA сохраняют структурную целостность при облучении. Характеристики высвобождения наночастиц PDA в присутствии 10 мМ GSH показали замечательное низкое высвобождение лекарств (примерно 30% за 24 часа) по сравнению с наночастицами PDA @ PMAA-1 (дополнительный файл 1:Рисунок S1). Огромная разница в поведении высвобождения наночастиц PDA и PDA @ PMAA предполагает, что введение разлагаемой полимерной оболочки, сшитой дисульфидной связью, привело к эффективному высвобождению лекарств, запускаемому окислительно-восстановительным механизмом.

Профили высвобождения DOX наночастиц PDA @ PMAA-1 при 37 ^° C в фосфатном буфере 7,4 (○), в фосфатном буфере 7,4 с облучением лазером NIR (□, в фосфатном буфере 7,4 с 10 мМ GSH (красный кружок) или в фосфатном буфере 5,5 с 10 мМ GSH (зеленый кружок)

Анализ клеток

Далее было проведено исследование клеточного поглощения и внутриклеточного высвобождения лекарственного средства нагруженных DOX наночастиц PDA @ PMAA против линии клеток A549. Как показано на рис. 7, красная флуоресценция DOX может наблюдаться в цитоплазме клеток после 1 ч инкубации, что указывает на быструю интернализацию наночастиц против опухолевых клеток. После 4 ч инкубации наблюдалась сильная красная флуоресценция по всей цитоплазме и ядру клетки. Было высказано предположение, что большее количество наночастиц подверглось эндоцитозу клетками и эффективно высвободило DOX за счет разрушения полимерных оболочек в восстанавливающей среде опухолевых клеток.

Изображения CLSM клеток A549, культивированных с наночастицами PDA @ PMAA, нагруженными DOX, для ( a ) 1 ч и ( b ) 4 ч. В каждом ряду слева направо показаны изображения с дифференциальной интерференционной контрастной микроскопии, флуоресцентные изображения и наложенные изображения. (масштабная линейка, 50 мкм)

Для оценки биосовместимости PDA @ PMAA была выбрана типичная нормальная клетка (клетки HEK-293T) для испытания жизнеспособности клеток с помощью анализа МТТ. Как показано на рис. 8, не было обнаружено явной цитотоксичности холостых наночастиц PDA @ PMAA-1 в широком диапазоне концентраций 0,1–100 мкг / мл ^-1 . , что свидетельствует о хорошей биосовместимости наночастиц PDA @ PMAA-1, что обеспечивает их применение в биомедицинской сфере. Затем была измерена жизнеспособность клеток против клеток A549 (опухолевые клетки) как функция инкубационной концентрации холостых или нагруженных DOX наночастиц PDA @ PMAA-1, и каждая группа была разделена на группы с или без воздействия лазера NIR (рис.9 ). Практически не наблюдалось влияния на жизнеспособность клеток для группы холостых PDA @ PMAA-1 без лазера, что указывает на то, что холостые композитные наночастицы не обладают цитотоксичностью. После 5 Вт см ⁻² Облучение NIR лазером в течение 300 с, жизнеспособность клеток для холостой группы PDA @ PMAA-1, очевидно, снизилась, и ~ 54,3% клеток были убиты при концентрации 100 мкг мл ^-1 . Результаты предполагали, что эти наночастицы PDA @ PMAA-1 были цитотоксичными по отношению к клеткам A549 под действием NIR-излучения, вызывающего гипертермию. Что касается групп, нагруженных DOX, наночастицы PDA @ PMAA-1, нагруженные DOX, демонстрируют снижение жизнеспособности клеток в зависимости от дозы, которые имеют эффективность, аналогичную эффективности свободного DOX, что указывает на полное высвобождение лекарств из сшитого дисульфидными связями PMAA. снаряды. Для клеток, обработанных наночастицами PDA @ PMAA-1, нагруженными DOX, с помощью воздействия лазера NIR, жизнеспособность клеток демонстрирует более глубокое снижение по сравнению с группой без облучения, особенно при высокой дозе лекарства. Например, когда клетки обрабатывали 100 мкг мл ^-1 КПК, нагруженный DOX @ PMAA-1 (содержащий 5 мкг мл ^-1 DOX), жизнеспособность клеток снизилась примерно до 15,7%, что было намного ниже, чем при фототермическом (~ 54,3%) или химиотерапевтическом (~ 38,1%) лечении при той же дозе наночастиц. Примечательно, что ингибирование клеток на 50% (IC ₅₀ ) значение нагруженного DOX КПК @ PMAA-1 при кратковременном воздействии лазером NIR было определено как 2 мкг мл ^-1 , что было намного ниже, чем у свободного DOX (6,3 мкг мл ^-1 ). Это свидетельствует о том, что химиофотермическая терапия наночастиц PDA @ PMAA, нагруженных DOX, продемонстрировала синергетический эффект, который может быть объяснен повышенной цитотоксичностью DOX при более высокой температуре [34, 35]. Напротив, группа свободных DOX с лазером NIR не показывает подобного синергетического эффекта, поскольку отсутствует локальная гипертермия, вызванная облучением лазером NIR. Флуоресцентные изображения клеток, окрашенных кальцеином-AM (зеленые, живые клетки) после обработки, показывают, что количество живых клеток, обработанных нагруженными DOX наночастицами PDA @ PMAA при облучении лазером NIR, было значительно меньше, чем в других группах, что дополнительно подтвердило синергетический противоопухолевый эффект. влияние нагруженных DOX наночастиц PDA @ PMAA при облучении светом в ближней инфракрасной области (рис. 10). Обладая положительным синергетическим эффектом комбинированного химиофотермического лечения, он позволяет снизить дозировку цитотоксических лекарств для достижения того же эффекта уничтожения опухолей, что позволяет избежать серьезных побочных эффектов для нормальных тканей при высоких дозах лекарства. Взятые вместе, приведенные выше данные предполагают, что эти наночастицы PDA @ PMAA могут эффективно высвобождать лекарства в условиях внутриклеточного восстановления и проявлять синергетический эффект уничтожения опухолевых клеток для комбинированной химиофотермической терапии, что продемонстрировало их большой потенциал для лечения рака.

Жизнеспособность клеток HEK-293, подвергшихся воздействию пустых наночастиц PDA @ PMAA-1 в течение 24 часов

Жизнеспособность клеток A549, обработанных свободным DOX, наночастицами PDA @ PMAA-1 и нагруженными DOX наночастицами PDA @ PMAA-1 в различных концентрациях без или с облучением лазером NIR ( λ =808 нм, 5 Вт / см ⁻² ) на 300 с

Конфокальные флуоресцентные изображения живых клеток A549, обработанных PBS, наночастицами PDA @ PMAA-1, нагруженными DOX наночастицами PDA @ PMAA-1 и свободным DOX с или без облучения лазером NIR ( λ =808 нм, 5 Вт / см ⁻² ) на 300 с. Живые клетки окрашивали кальцеином-AM (зеленый). Масштабная линейка - 50 мкм

Заключение

Многофункциональные композитные наночастицы ядро-оболочка PDA @ PMAA были синтезированы путем нанесения слоя сшитого дисульфидом PMAA на наночастицы PDA посредством полимеризации с отгонкой-осаждением. Композитные наночастицы продемонстрировали превосходный эффект фототермического преобразования и редокс-лабильную деградацию слоя ПМАК. Для типичного образца КПК @ КПК @ ПМАК-1 температура дисперсий КПК @ ПМАК была увеличена на 31 ^° C при концентрации 100 мкг мл ^-1 облучается лазером с длиной волны 808 нм при мощности 5 Вт / см ⁻² на 300 с. The DOX-loaded PDA@PMAA-1 nanoparticles were stable under the physiological environment with low leakage of DOX (10.8% in 24 h), while a rapid and full release of DOX was triggered in the reducing and weakening acidic condition (pH5.5 + 10 mM GSH). The cell viability of A549 cells treated with PDA@PMAA-1 nanoparticles under NIR irradiation was reduced significantly to about 15.7% at relatively low equivalent drug concentration (5 μg mL ⁻¹ ), which was much lower than photothermal (~ 54.3%) or chemotherapy (~ 38.1%) treatment alone under the same dose of nanoparticles and drugs. So the DOX-loaded composite nanoparticles realized a synergistic inhibition effect against cancer cells by the combination of photothermal therapy and traditional chemotherapy. This work demonstrated the feasibility of such composite nanoparticles to be a powerful platform for controlled drug delivery and could be exploited as combined chemo-photothermal therapy with improved therapeutic efficacy.

Доступность данных и материалов

The datasets generated during and/or analyzed during the current study are available from the corresponding author on request.

Сокращения

AIBN:

2,2-Azobisisobutyronitrile

BAC:

N,N' -bis(acryloyl)cystamine

DA-HCl:

Dopamine hydrochloride

DLS:

Динамическое рассеяние света

DMEM:

Dulbecco’s modified Eagle’s medium

DMSO:

Диметилсульфоксид

DOX:

Doxorubicin

FBS:

Фетальная бычья сыворотка

FT-IR:

Инфракрасное преобразование Фурье

GSH:

Glutathione

MAA:

Methacrylic acid

NIR:

Ближний инфракрасный порт

КПК:

Полидофамин

PMAA:

Poly(methacrylic acid)

PTC:

Photothermal conversion agents

PTT:

Фототермическая терапия

ТЕМ:

Просвечивающая электронная микроскопия