Использование положительно заряженных магнитных наночастиц для захвата бактерий при сверхнизкой концентрации

Фон

Инфекционные заболевания - одна из самых серьезных проблем в области здравоохранения в мире. Микробное заражение водных ресурсов представляет собой серьезную угрозу для здоровья населения. кишечная палочка ( E. coli ), грамотрицательная бактерия, очень часто встречается в загрязненной воде и пище. Некоторые штаммы E. coli может даже вызвать серьезные бактериальные инфекции. Бактерии в низких концентрациях трудно обнаружить, и обычно перед дальнейшим анализом требуется процесс предварительного обогащения. Микробиологические методы, основанные на культуре, трудоемки и могут занять несколько дней. Кроме того, некоторые бактериальные штаммы могут перейти в жизнеспособное, но не культивируемое состояние, когда они жизнеспособны, но не культивируются на обычном агаре, что затрудняет их обнаружение методами, основанными на культуре [1]. И наоборот, быстрое улавливание и обеззараживание бактериальных патогенов может обеспечить результаты в реальном времени для смягчения вспышек инфекционных заболеваний.

Разработаны различные материалы для быстрого улавливания и удаления бактерий из источника заражения. Углеродные нанотрубки и связанные смолой олигоациллизиновые шарики были использованы для удаления бактерий из воды [2, 3]. Магнитные наночастицы, которые можно удобно отделить от различных ресурсов с помощью магнитного процесса, широко использовались для обнаружения и обеззараживания бактерий после функционализации органическими молекулами [4,5,6]. Магнитные методы обладают преимуществами захвата цели за счет экономии времени (общее время разделения в пределах 1 часа), высокой степени извлечения, возможной автоматизации и масштабного разделения [7]. Эффективность и селективность магнитной сепарации во многом зависит от лигандов, но иногда бывает трудно получить лиганд с высоким сродством и специфичностью к мишени. Следовательно, необходимо разработать систему захвата бактерий с магнитными наночастицами, не зависящими от лиганда, для захвата бактерий, особенно при низких концентрациях.

Многие ученые исследовали природу электрического заряда бактерий. Беххольд (1904) первым обнаружил, что бактериальные клетки несут отрицательный заряд [8]. Хотя уже было известно, что большие популяции бактериальных клеток имеют тенденцию поддерживать отрицательный заряд, мало что известно об электрофизиологии бактерий на уровне отдельных клеток. В 2011 году Коэн и др. обнаружил электрический всплеск в E. coli с частотой до 1 Гц с использованием флуоресцентного белка, указывающего напряжение [9]. Поскольку многие виды бактериальных клеточных стенок заряжены отрицательно, положительно заряженные наночастицы могут сильно взаимодействовать с широким спектром бактерий посредством электростатических взаимодействий.

Чтобы воспользоваться преимуществами магнитных наночастиц и отрицательного заряда отдельных бактерий для быстрого обнаружения патогенов, мы разработали систему для улавливания бактерий в низких концентрациях. Положительно заряженные магнитные наночастицы были изготовлены из полиэтиленимина (PEI), который состоит из множества аминогрупп. Затем мы исследовали сродство функционализированных наночастиц PEI к E. coli . Этот инновационный метод обеспечивает эффективное связывание бактерий за счет электростатического взаимодействия.

Материалы и методы

Наноматериалы

Гидрат хлорида железа (III) (FeCl ₃ · 6H ₂ O), гидроксид аммония (NH ₄ OH, 28 мас.%), Соляная кислота (37 мас.% Водный раствор), этиленгликоль и ацетат натрия были приобретены у Shanghai (China) Reagent Company. Тетраэтилортосиликат (TEOS), (3-аминопропил) триэтоксисилан (APTES) и флуоресцеинтетраметилродамин (TRITC) были приобретены у Sigma-Aldrich (США). Разветвленный поли (этиленимин) (PEI, 99%, Mw =10 000) был куплен у Альфа Эсар. Все растворы были приготовлены с использованием деионизированной воды Milli-Q (18,2 МОм · см при удельном сопротивлении 25 ° C).

Синтез NP

Fe ₃ О ₄ Наночастицы были получены сольвотермической реакцией [10]. Вкратце, 0,081 г FeCl ₃ · 6H ₂ О растворяли в 30 мл этиленгликоля при перемешивании магнитной мешалкой. Затем к этому раствору добавляли 0,3 г полиакриловой кислоты (PAA) и 1,8 г мочевины. После перемешивания в течение 30 минут раствор нагревали при 200 ° C в течение 12 часов, используя автоклав из нержавеющей стали с тефлоновым покрытием. При охлаждении до комнатной температуры черный продукт, а именно ядра магнитных наночастиц, собирался магнитом. После трехкратной промывки этанолом и деионизированной водой Fe ₃ О ₄ наночастицы обрабатывали 0,15 M HCl при ультразвуковой обработке в течение 15 минут, а затем покрывали кремнеземом с помощью гидролиза и TEOS.

Чтобы получить отрицательно заряженные флуоресцентные магнитные наночастицы (NP-), комплекс APTES-TRITC (C33H44N3O6Si) сначала подвергали реакции в темноте в течение ночи в этаноле. Затем комплекс был привит к Fe ₃ О ₄ наночастицы посредством реакции между APTES и гидроксильными группами на Fe ₃ О ₄ @SiO ₂ наночастица. Затем добавляли 30 мкл TEOS, и он реагировал в течение 24 часов в темноте. После трехкратной промывки этанолом и деионизированной водой получали флуоресцентные NP-. Благодаря модификации NP- поликатионным полимером PEI, положительно заряженные магнитные наночастицы (NP +) были обработаны.

Характеристика NP

Исследования с использованием просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) выполнялись на приборе TECNAI F ^{- 30} просвечивающий электронный микроскоп высокого разрешения на 300 кВ. Размер частиц и дзета-потенциал наночастиц определяли с помощью серии Malvern Zeta Sizer Nano (Вестборо, Массачусетс). Флуоресценцию исследовали с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа Carl Zeiss LSM5 EXITER (Zeiss, Jena, Germany).

Подготовка бактерий

Грамотрицательный штамм E. coli BL21 использовали в качестве модельных бактерий. Э. coli культивировали в 100 мл ростовой среды Luria Broth [11]. Бактерии культивировали в термостатическом инкубаторе при 200 об / мин, 37 ° C в течение 16 часов. Затем удаляли 100 мкл бактериальной культуры и разбавляли средой 1 × 10 ⁵ . раз, наносили на агар и культивировали при 37 ° C в течение 24 часов. Подсчитывали количество колониеобразующих единиц. Оставшиеся бактериальные клетки собирали центрифугированием при 5000 об / мин в течение 5 минут, трижды промывали 1 × PBS (10 мМ, pH 7,4) и разбавляли до концентраций приблизительно 1 × 10 ³ колониеобразующая единица (КОЕ) / мл. Из соображений безопасности все образцы бактерий были помещены в автоклав при 121 ° C на 20 минут для уничтожения бактерий перед утилизацией, а вся стеклянная посуда, контактирующая с бактериями, была стерилизована до и после использования.

Эксперимент по улавливанию бактерий

Все исследования по улавливанию партий проводили в стерилизованном буфере 1 × PBS. Сорок микролитров НЧ (1 мкг / мкл) диспергировали в стерилизованном физиологическом растворе при ультразвуковой обработке в течение 10 минут, а затем 1 мл бактериального раствора (примерно 10 ³ КОЕ / мл) добавляли в суспензию. После инкубации в течение 10 минут, NP-связанные бактерии были захвачены с помощью постоянного магнита на стенку флакона, а свободные бактерии были удалены с помощью промывочного раствора. Захваченные бактерии были выпущены путем удаления магнита и ресуспендированы в PBS. Для микроскопического анализа аликвоту бактерий наносили на предметные стекла и окрашивали Hema-3 (Fisher Diagnostics). Для иммунофлуоресцентного анализа аликвоту бактерий наносили на предметные стекла и окрашивали 4'-6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI).

Эффективность бактериального захвата НЧ при различных концентрациях

Один миллилитр бактериальной суспензии (примерно 2 × 10 ² КОЕ / мл) инкубировали с различными количествами (5, 10, 20, 30, 40, 50, 75 и 100 мкг / мл) NP + или NP- в течение 10 мин. После магнитной сепарации наночастицами был взят образец общего раствора и проанализирована концентрация бактерий методом подсчета на планшете. Эффективность бактериального захвата НЧ проверялась путем подсчета количества КОЕ на чашках с LB-агаром.

Способность НЧ улавливать бактерии при низких концентрациях

Сорок микрограммов NP + или NP- инкубировали с 1 мл бактериальной суспензии при очень низких концентрациях (10 и 10 ² КОЕ / мл). После магнитной сепарации наночастицами был взят образец общего раствора и проанализирована концентрация бактерий методом подсчета на планшете. Эффективность бактериального захвата НЧ проверялась путем подсчета количества КОЕ на чашках с LB-агаром.

Статистический анализ

Результаты были выражены в виде среднего значения ± стандартное отклонение (SD), как указано в подписях к рисункам. Двухфакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с соответствующим анализом hoc был рассчитан с использованием программного обеспечения GraphPad Prism с P значения <0,05 считаются статистически значимыми.

Результаты

Характеристика магнитных НЧ

Принципиальная схема приготовления магнитных композитных наночастиц с поверхностным зарядом представлена ​​на рис. 1. Fe ₃ О ₄ наночастицы конъюгированы с APTES с образованием тонкого слоя SiO ₂ оболочка на поверхности наночастиц при реакции с ТЭОС и NH ₄ ОЙ. Для непосредственной визуализации и количественной оценки захваченных клеток сначала проводится реакция комплекса APTES-TRITC с последующей прививкой на поверхность Fe ₃ О ₄ @silica композиты посредством классической золь-гель реакции. Обильные группы SiOH определяют общую поверхность этого продукта, демонстрируя сильный отрицательный поверхностный заряд, а именно отрицательно заряженные магнитные наночастицы (NP-). Для положительно заряженных магнитных наночастиц (NP +) молекулы PEI используются для покрытия и модификации поверхности NP-. Модифицированный продукт показывает сильный положительный поверхностный заряд из-за обильного присутствия аминогрупп.

Дизайн наночастиц. Принципиальная схема, показывающая конструкцию поверхностно-заряженных флуоресцентных суперпарамагнитных композитных наночастиц (НЧ)

Как показано на рис. 2а, ПЭМ продемонстрировала, что магнитные композитные наночастицы имеют диаметр 450 нм, которые состоят из однородного SiO ₂ покрытие (размер 60 нм). Динамическое рассеяние света (DLS) частиц на фиг. 2b показывает узкое распределение по размерам с увеличенным средним диаметром после функционализации поверхности. Максимальные размеры композитных наночастиц с положительным и отрицательным зарядами составляют 620 и 700 нм соответственно. Наночастицы, измеренные с помощью DLS, обычно больше, чем измеренные с помощью ПЭМ. Это связано с тем, что размер, оцениваемый методом DLS, находится под влиянием броуновского движения и зависит от температуры окружающей среды, динамического радиуса наночастицы и степени агломерации наночастиц, вызванной статической средой через возникновение конфликта [12]. На рис. 2с показано распределение дзета-потенциала отрицательных и положительных наночастиц. В деионизированной воде (pH 7,0) дзета-потенциалы NP- и NP + составляют -26,6 мВ и + 28,1 мВ соответственно. Зависимости дзета-потенциалов NP + от pH показаны в Дополнительном файле 1:Рисунок S1. Эти результаты показали, что наночастицы с поверхностным зарядом хорошо диспергированы в водном растворе в нейтральных условиях, что может быть использовано для захвата клеток.

Характеристика наночастиц. а Изображение с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) положительно заряженных наночастиц (NP +) и отрицательно заряженных наночастиц (NP-). б Размер и распределение НЧ при динамическом рассеянии света. c Распределение дзета-потенциала НЧ

Способность магнитных НЧ захватывать E. coli

На рисунке 3 показана общая экспериментальная процедура улавливания бактерий. НЧ смешивали с раствором бактерий и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин. Впоследствии мы использовали постоянный магнит для захвата «намагниченных» бактерий (магнитных наночастиц, связанных с поверхностью клетки) на стенке пробирки. После удаления оставшегося раствора и промывки агрегатов PBS (с магнитом снаружи) мы переносили агрегаты на предметное стекло для микроскопического анализа. Как показано на схеме, NP + обеспечивает достаточную электростатическую чувствительность для быстрого обогащения E. coli . Напротив, бактерии удаляются с помощью промывочного PBS в эксперименте NP-.

Иллюстрация процедур улавливания бактерий. Э. coli в суспензии соответственно смешивают с NP + и NP- с последующей 10-минутной инкубацией. «Намагниченные» бактерии притягивались к стенке флакона магнитом. После удаления оставшегося раствора бактерии были захвачены НЧ, промыты PBS и подсчитаны по количеству бактериальных колоний

Оптические изображения наночастиц показаны на рис. 4. Оптическое изображение NP− показало монодисперсные и равномерно распределенные частицы. Однако NP + имеет тенденцию к агломерации. Распределение размеров NP + очевидно шире, чем у NP−. Эти результаты продемонстрировали, что NP + и NP- имели совершенно разные паттерны взаимодействия с E. coli . Для дальнейшего изучения бактериального сродства NP + локализация NP + в E. coli исследовали с помощью флуоресцентного анализа. На рисунке 5a показано, что захваченный E. coli положительны как для DAPI (синий цвет), так и для TRITC (красный цвет). Чтобы четко подтвердить сродство NP + к бактериям, была использована технология ТЕМ. На рис. 5b наблюдается агрегация ряда NP + на стенке бактериальной клетки. Эти результаты показали, что NP + обладают сильным сродством к бактериям.

Сравнение E. coli связывающая способность NP + и NP-. Слева изображены фазово-контрастные поля связывания бактерий с NP +. Правые изображения имеют только наночастицы, что свидетельствует о том, что NP- не обладают связывающей способностью с E. coli ячейки

Флуоресцентные и ПЭМ-изображения E. coli связывание с NP +. а На верхних панелях показаны флуоресцентные изображения E. coli связывание клеток с NP +. DAPI используется для окрашивания ядра клетки. TRITC помечен в NP. б Нижние панели представляют собой типичные изображения ПЭМ, показывающие NP + и E. coli комплексы

Обнаружение низких концентраций E. coli

Чтобы дополнительно охарактеризовать динамику бактерий и взаимодействий NP +, мы инкубировали E. coli с постоянным числом (2 × 10 ² КОЕ / мл) с различными концентрациями НЧ от 5 до 100 мкг / мл. Затем связанные с НЧ бактерии были захвачены и разделены с помощью магнитного поля. Графики эффективности магнитного захвата бактерий NP + и NP- показаны на рис. 6. Число E. coli захват NP- составляет всего 12% даже при высокой концентрации 100 мкг / мл. В отличие от NP-, NP + продемонстрировал значительную способность захвата бактерий и достиг 81% эффективности захвата при 40 мкг / мл ( P <0,001). Как видно из чашек с LB-агаром, было продемонстрировано дозозависимое увеличение бактериальных колоний с NP +.

Эффективность захвата E. coli NP + или NP- в различных указанных концентрациях. На левом изображении представлена ​​фотография пластин с LB-агаром, покрытых E. coli захвачены NP + и NP−. Правое изображение показывает эффективность бактериального захвата NP при различных указанных концентрациях. Э. coli (2 × 10 ² КОЕ в 1 мл раствора PBS) без инкубации NP считали за 100% и служили контролем. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001

Чтобы подтвердить сродство NP + к E. coli при сверхнизкой концентрации мы смешали 40 мкг NP с 1 мл раствора PBS, содержащего только 10 и 100 КОЕ E. coli . На рис. 7 показаны фотографии образовавшихся колоний в чашках с агаром для всех образцов. Как и ожидалось, NP + действительно захватил E. coli при сверхнизкой концентрации, в то время как бактериальные колонии не были очевидны в чашках с NP-. Небольшое количество колоний в чашке можно объяснить неспецифическим сродством наночастиц. Дальнейший анализ показал, что эффективность бактериального захвата более 90% была получена при сверхнизкой концентрации (10 и 100 КОЕ / мл) с использованием NP +. Напротив, эффективность захвата составляет менее 4% с NP- при тех же условиях и имеет значительную разницу ( P <0,001). Эти результаты предполагают, что NP + обладают сильным сродством к бактериям, что можно объяснить электростатическим притяжением. Чтобы исследовать способность захвата бактерий широкого спектра, мы использовали три грамположительных бактерии ( Bacillus subtilis , золотистый стафилококк и Lactococcus lactis ) как модели. Как показано в Дополнительном файле 1:Рисунок S2, NP + обладают более высокой адсорбционной способностью в отношении бацилл ( E. coli и Б. subtilis ), чем стафилококки ( S. aureus ) и стрептококки ( L. lactis ). Кроме того, мы также обнаружили, что отрицательно заряженные молекулы, такие как 3-бромпируват (3-BP) и ДНК, могут мешать эффекту бактериального захвата. Мертвый кишечная палочка недействителен для такой системы (Дополнительный файл 1:Рисунок S3).

Эффективность захвата E. coli NP + или NP- при сверхнизких концентрациях. На левом изображении представлена ​​фотография пластин с LB-агаром, покрытых E. coli захвачены NP + и NP−. Правое изображение показывает E. coli эффективность захвата НЧ (40 мкг / мл) при сверхнизких концентрациях бактерий. Э. coli (10 и 100 КОЕ в 1 мл раствора PBS) без инкубации NP считали 100% и служили контролем. *** P <0,001

Обсуждение

Известно, что обе грамотрицательные бактерии (например, E.coli ) и грамположительные бактерии (такие как B. subtilis ) гораздо легче взаимодействуют с положительно заряженными частицами, чем отрицательно заряженные частицы, посредством электростатического притяжения [13, 14]. Это также было обнаружено в нашем исследовании. Одним из преимуществ нашей системы улавливания является то, что наночастицы, функционализированные PEI, имеют больше аминогрупп, которые способны улавливать бактерии при сверхнизких концентрациях. На сегодняшний день существует несколько общих и удовлетворительных анализов, которые могут обнаруживать бактерии при концентрациях менее 10 ² КОЕ / мл без предварительного обогащения бактерий в процессе культивирования. Это исследование продемонстрировало простой анализ, в котором используются электрически магнитные наночастицы для захвата и обнаружения грамотрицательных бактерий (у организмов есть цитоплазматическая мембрана, клеточная стенка и неповрежденная внешняя мембрана) в течение 1 часа при концентрации 10 КОЕ / мл.

В нашем эксперименте мы обнаружили, что поверхностный заряд НЧ может влиять на эффективность бактериального захвата. Здесь влияние заряда на поверхности НЧ на эффективность бактериального захвата изучали с использованием E.coli как модельные бактерии. Когда NP + использовались в анализе захвата, они проявляли эффективную адсорбционную способность бактерий. Эффективность бактериального захвата увеличивалась с дозировкой NP +. TEM-микроскопия показывает макроскопические агрегаты, состоящие из наночастиц и бактериальных клеток. Напротив, NP-, даже при высоких концентрациях, проявлял низкую способность к улавливанию бактерий. В целом, эти наблюдения показали, что NP + имеют значительно более высокую способность захвата, чем NP-.

Хотя грамположительные и грамотрицательные бактерии имеют различия в структуре мембран, большинство из них имеют отрицательный заряд при культивировании при физиологических значениях pH [15, 16]. Заряд клеточной поверхности бактериальных клеток был охарактеризован с помощью хроматографии электростатического взаимодействия (ESIC) [17]. Клеточная стенка грамположительных бактерий в основном состоит из толстого слоя пептидогликана, в который встроена тейхоевая кислота. С другой стороны, грамотрицательные бактерии имеют слой липополисахарида на внешней поверхности, за которым следует тонкий слой пептидогликана. Тейхоевая кислота и липополисахариды придают отрицательный заряд поверхности бактериальных клеток [18]. Ранее положительно заряженные наночастицы серебра (AgNP) проявляли замечательную эффективность против микроорганизмов, включая E. coli [19]. Они обнаружили, что более мелкие частицы обладают большей антибактериальной активностью. Мы считали, что более крупные частицы могут иметь другое преимущество в отношении абсорбции бактерий. Во-первых, более крупные частицы с трудом достигают ядерного содержимого клеток, вызывая токсичность для бактерий. Во-вторых, они могут обеспечить большую площадь поверхности и, следовательно, более сильное взаимодействие с бактериями. Поэтому мы разработали и применили положительно заряженные наночастицы большего размера в качестве «губчатого» агента для улавливания бактерий.

Выводы

В заключение, с помощью магнитных наночастиц PEI мы продемонстрировали простой и быстрый анализ, позволяющий определить E. coli быть захваченным и проанализированным. Существующие архивы оптических и ТЕМ профилей бактерий позволяют легко идентифицировать захваченные бактерии. Высокое извлечение, обеспечиваемое положительно заряженными магнитными наночастицами, позволит обнаруживать другие штаммы бактерий в сверхнизких концентрациях.

Сокращения

APTES:

3-аминопропилтриэтоксисилан

КОЕ:

Колониеобразующий блок

DLS:

Динамическое рассеяние света

E. coli :

кишечная палочка

NP:

Отрицательно заряженные магнитные наночастицы

NP +:

Положительно заряженные магнитные наночастицы

НП:

Наночастицы

PAA:

Полиакриловая кислота

PEI:

Полиэтиленимин

SD:

Стандартное отклонение

ТЕМ:

Просвечивающая электронная микроскопия

TEOS:

Тетраэтилортосиликат

TRITC:

Тетраметилродамин