Формо-зависимая цитотоксичность и клеточное поглощение наночастиц золота, синтезированных с использованием экстракта зеленого чая

Введение

Растения содержат естественные первичные и вторичные метаболиты, включая флавоноиды, сапонины, алкалоиды, стероиды, кумарины, дубильные вещества, фенолы, терпеноиды, углеводы, белки и аминокислоты. В последнее время растительные экстракты стали использовать для синтеза наноматериалов, в частности металлических наночастиц, таких как золото, серебро, оксид титана, медь, палладий, оксид цинка и наночастицы платины [1]. Различные фитохимические вещества активно участвуют в превращении солей металлов в металлические наночастицы в качестве восстановителей. Кроме того, растительные экстракты играют роль стабилизаторов для поддержания коллоидной стабильности металлических наночастиц в растворе. Химические восстановители обычно ядовиты и токсичны для живых организмов. Напротив, использование растительных экстрактов в синтезе металлических наночастиц является экологически чистым, экологически чистым и устойчивым. Различные части растений, такие как стебли, плоды, семена, листья и цветы, используются для синтеза металлических наночастиц [1, 2]. Обширные обзоры посвящены зеленому синтезу наночастиц золота (AuNP) с использованием экстрактов растений в качестве восстановителей [2,3,4]. Используя эту зеленую стратегию, этап синтеза выполняется за один этап и в один горшок. Кроме того, этот процесс прост, легок, экономичен и экологичен. Размер, форма и топография AuNP зависят от концентрации солей и экстрактов золота, времени реакции, температуры реакции и pH раствора. Спектроскопические и микроскопические методы используются для характеристики AuNP, включая УФ-видимую спектрофотометрию, дифракцию рентгеновских лучей, инфракрасную спектроскопию с преобразованием Фурье (FT-IR), просвечивающую электронную микроскопию (TEM), атомно-силовую микроскопию (AFM), сканирующую электронную микроскопию ( SEM), а также измерения гидродинамического размера и дзета-потенциала. Эти зеленые AuNP применяются в качестве катализаторов, антиоксидантов, противомикробных и противораковых агентов [5,6,7,8].

В лаборатории авторов экстракты растений ( Artemisia capillaris , Leonurus japonicus , Polygala tenuifolia , Caesalpinia sappan , Bupleurum falcatum и гарциния мангустана ) были использованы в качестве восстановителей для зеленого синтеза как AuNP, так и наночастиц серебра (AgNP) [9,10,11,12,13,14,15,16,17,18]. Надземная часть А. капилляры был извлечен и использован для синтеза AgNPs и AuNPs [9, 15, 16]. Приготовленные AgNP проявляли отличную антибактериальную активность против Escherichia coli . , Enterobacter cloacae , синегнойная палочка , Klebsiella aerogenes , и Klebsiella oxytoca по сравнению с одним экстрактом [15]. Этот результат показал, что синергетический эффект объединения AgNP и экстракта способствует усилению антибактериальной активности. Интересно, что AgNP синтезировали с использованием A. капилляры в присутствии бромида цетилтриметиламмония проявляет антибактериальную активность против метициллин-резистентного Staphylococcus aureus [16]. Более того, AuNP синтезированы с использованием A. капилляры показали каталитическую активность по отношению к реакции восстановления 4-нитрофенола [9]. Л. japonicus экстракт был использован для синтеза AgNPs, демонстрирующих значительное усиление антибактериальной активности [10]. Мы заметили, что антибактериальная активность по отношению к грамотрицательным бактериям была выше, чем против грамположительных бактерий. Экстракт корня P. тенуифолия был также использован для синтеза AuNPs и AgNPs [11, 17]. Повышенная антикоагулянтная активность и антибактериальная активность наблюдались в AuNP и AgNP, соответственно, синтезированных с использованием P. тенуифолия извлекать. Самое интересное, что AgNP синтезировали с использованием C. саппан Экстракт показал эффективную антибактериальную активность против метициллин-резистентных S. золотистый [18]. Выписка из Г. мангустана продуцировали асимметричные AgNP в форме гантелей с апоптотическими эффектами [14].

В предыдущих отчетах изучался зеленый синтез AuNP и AgNP с использованием экстракта чайного листа [19,20,21,22,23]. Kamal и соавторы сообщили об успешном синтезе 25 нм-AgNPs [19]. В другом сообщении сферические AgNP размером от 20 до 90 нм были синтезированы с использованием экстракта чайного листа [20]. Синтезированные AgNP показали небольшую антибактериальную активность против E. coli . Сферические AgNP размером 3,42 ~ 4,06 нм были также получены Лоо и соавторами с использованием экстракта чайного листа [21]. Vaseeharan с соавторами синтезировали антибактериальные AgNP с использованием экстракта чайного листа [22]. Синтезированные AgNP были эффективны против патогенного Vibrio harveyi инфекционное заболевание. Бегум с соавторами использовали экстракт листьев черного чая для синтеза как AuNP, так и AgNP [23]. На сегодняшний день с использованием экстракта чайного листа синтезированы в основном сферические AgNP.

В настоящем отчете хитозан использовался в качестве кэпирующего агента для AuNP. Хитозан исследовался как средство доставки лекарств / генов из-за его высокой биосовместимости, низкой аллергенности, биоразлагаемости и низкой токсичности [24,25,26]. Хитозан происходит из хитина, которого много в экзоскелете насекомых и ракообразных, таких как крабы, омары и креветки. Хитин - это полисахарид, состоящий из N -ацетил-D-глюкозамин, связанный β (1-4) гликозидными связями. Хитозан можно получить из хитина гетерогенным N -процесс деацетилирования. Сам хитозан обладает антибактериальной, противогрибковой, противоопухолевой и антиоксидантной активностью [25]. В качестве кэпирующего агента хитозан напрямую связывается с AuNP посредством электростерического механизма [26]. Наночастицы хитозана влияют на механизм клеточного поглощения клетками A549 без изменения цитотоксичности [24]. Кроме того, степень деацетилирования хитозана больше влияет на поглощение клетками и цитотоксичность, чем молекулярная масса [24].

Большинство исследований было сосредоточено на синтезе сферических AgNP с использованием экстракта чайного листа. При этом экстракт листьев зеленого чая был использован для синтеза золотых наносфер и нанозвезд. Наносферы использовались в качестве затравки для опосредованного затравкой синтеза нанозвезд. Для сравнения наностержни были синтезированы общепринятым методом [27]. Три различных формы AuNP (наносферы, нанозвезды и наностержни) были покрыты хитозаном для повышения их биосовместимости и коллоидной стабильности. Эти AuNP были охарактеризованы с помощью УФ-видимой спектрофотометрии, просвечивающей электронной микроскопии высокого разрешения (HR-TEM) и FT-IR. Измерения гидродинамических размеров, выполненные с помощью динамического рассеяния света (DLS), и измерения дзета-потенциала проводились до и после покрытия хитозаном. Коллоидную стабильность оценивали в солевых растворах, буфере и среде для культивирования клеток. Для измерения цитотоксичности анализ 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолийбромида (МТТ) был применен к четырем раковым клеткам:AGS (клетки аденокарциномы желудка человека), HeLa (аденокарцинома эпителия шейки матки человека). клетки), HepG2 (клетки карциномы гепатоцитов человека) и HT29 (клетки колоректальной аденокарциномы человека). Поглощение AuNP клетками HepG2 было количественно измерено с помощью оптической эмиссионной спектроскопии с индуктивно связанной плазмой (ICP-OES) и масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой с лазерной абляцией (LA-ICP-MS).

Материалы и методы

Материалы и инструменты

Тригидрат хлороазиатной кислоты (HAuCl ₄ · 3H ₂ O), бромид цетилтриметиламмония (CTAB), хитозан (из панцирей креветок, ≥75% деацетилированный) и бромид 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолия были приобретены у Sigma-Aldrich (St Луис, Миссури, США). Все остальные реагенты были аналитической чистоты. Спектрофотометр Shimadzu UV-1800 или UV-2600 использовали для получения спектров УФ-видимого света в кварцевой кювете (Shimadzu Corporation, Киото, Япония). Измерения гидродинамических размеров, выполненные методом DLS, и измерения дзета-потенциала проводили с использованием NanoBrook 90Plus Zeta (Brookhaven Instruments Corporation, Нью-Йорк, США). Для регистрации ИК-Фурье спектров использовали Varian 640 IR (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния, США); Измеряемый образец был приготовлен методом диска из KBr. Изображения HR-TEM были получены с использованием JEM-3010, работающего при 300 кВ (JEOL, Токио, Япония); образец загружали на покрытую углеродом медную сетку (углерод типа B, 300 меш, Ted Pella, Redding, CA, USA) и оставляли сушиться в печи при 37 ° C в течение 24 часов. Для обработки ультразвуком использовали модель WUC-A22H (Daihan Scientific Co. LTD., Сеул, Республика Корея). Центрифугу 5424R (Eppendorf AG, Гамбург, Германия) и FD8518 (IlshinBioBase Co. LTD., Gyeonggi, Республика Корея) использовали для центрифугирования и сублимационной сушки соответственно. Для поглощения AuNP клетками использовали Optima 8300 ICP-OES (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) и J200 Tandem LA-ICP-MS (Applied Spectra, Fremont, CA, USA).

Приготовление экстракта зеленого чая

Институт зеленого чая Хадонг (Хадонг, Кённам, Республика Корея) любезно предоставил в подарок сушеные листья зеленого чая. Для приготовления порошков из сушеных листьев использовали блендер. Экстракцию проводили путем смешивания деионизированной воды (2 л) и измельченных листьев (200 г). Экстракции позволяли продолжаться в течение 1 ч обработкой ультразвуком при температуре окружающей среды с тремя повторениями. Бумажные фильтры Whatman использовались для фильтрации водных фракций с целью удаления нерастворимых материалов. Затем фильтрат центрифугировали (3000 g сила, 18 ° C, 25 мин), и супернатант собирали. Собранный супернатант фильтровали с помощью шприца и фильтрат сушили вымораживанием. Лиофилизированный материал растворяли в деионизированной воде для создания исходного раствора с конечной концентрацией 2% ( вес / объем ) для зеленого синтеза, описанного в следующем разделе.

Синтез золотых наносфер с использованием экстракта

Процесс синтеза наносфер показан на рис. 1а. Исходный раствор, описанный в предыдущем разделе, использовали для синтеза. В стеклянном флаконе смешивали экстракт (конечная концентрация 0,03%) и тригидрат золотохлористоводородной кислоты (конечная концентрация 0,5 мМ) и добавляли гидроксид натрия (конечная концентрация 1 мМ). Добавляли деионизированную воду до конечного объема 2 мл. Инкубацию в печи проводили в сухом сушильном шкафу при 80 ° C в течение 2 часов. Поверхностный плазмонный резонанс (SPR) наносфер контролировали путем получения УФ-видимых спектров в диапазоне 300 ~ 800 нм. Наносферы также использовались в качестве затравки для синтеза нанозвезд, описанных в следующем разделе.

Синтез золотых наносфер. а Принципиальная схема процесса синтеза и б УФ-видимые спектры наносфер до и после покрытия хитозаном. Цифровая фотография показывает наносферы сразу после синтеза

Синтез золотых нанозвезд

Процесс синтеза нанозвезды проиллюстрирован на рис. 2а. Наносферы (50 мкл), синтезированные, как описано в предыдущем разделе, перемешивали (750 об / мин) с помощью магнитного стержня на горячей плите при температуре окружающей среды. К этому раствору добавляли тригидрат хлороиновой кислоты (0,25 мМ, 5 мл). Через 15 с одновременно добавляли два раствора:нитрат серебра (1 мМ, 50 мкл) и аскорбиновую кислоту (свежеприготовленную, 100 мМ, 25 мкл). Затем смесь перемешивали при 750 об / мин в течение 5 мин. УФ-видимые спектры были получены в диапазоне 300 ~ 1100 нм.

Синтез золотых нанозвезд. а Принципиальная схема процесса синтеза и б УФ-видимые спектры нанозвезд до и после покрытия хитозаном. Цифровая фотография показывает нанозвезды сразу после синтеза

Синтез золотых наностержней

Процесс синтеза наностержней показан на рис. 3а. Для синтеза золотых наностержней, опосредованный затравкой синтез был выполнен в соответствии с предыдущим отчетом с небольшими изменениями [27]. Раствор для роста готовили следующим образом. В стеклянной пробирке на 20 мл смешивали тригидрат хлористоводородной кислоты (10 мМ, 500 мкл) и бромид цетилтриметиламмония (CTAB, 100 мМ, 9,5 мл). Раствор был желтовато-коричневым. Затем добавляли аскорбиновую кислоту (свежеприготовленную, 100 мМ, 55 мкл), и этот раствор перемешивали, пока он не превратился из желтовато-коричневого в бесцветный. Добавляли нитрат серебра (10 мМ, 100 мкл) и встряхивали в течение 10 с. Этот окончательный раствор был назван раствором для выращивания. Затравочный раствор синтезировали следующим образом. В стеклянной пробирке на 20 мл смешивали тригидрат хлористоводородной кислоты (10 мМ, 250 мкл) и CTAB (100 мМ, 9,75 мл). Затем добавляли охлажденный на льду свежеприготовленный боргидрид натрия (10 мМ, 600 мкл) и встряхивали в течение 2 минут. Раствор был назван затравочным раствором. Затравочный раствор (12 мкл) смешивали с ранее синтезированным ростовым раствором. УФ-видимые спектры были получены в диапазоне 400 ~ 900 нм.

Синтез золотых наностержней. а Принципиальная схема процесса синтеза и б УФ-видимые спектры наностержней до и после покрытия хитозаном. Цифровая фотография показывает наностержни сразу после синтеза

Хитозановое покрытие наносфер, нанозвезд и наностержней

Кепирование хитозаном использовали для увеличения коллоидной стабильности и биосовместимости AuNP. Хитозан растворяли в 1% уксусной кислоте, и конечную концентрацию доводили до 0,01%. Затем была проведена обработка ультразвуком для полного растворения хитозана; этот раствор использовали в качестве исходного раствора для блокирования хитозана в следующей процедуре. Как наносферы, так и нанозвезды, которые были синтезированы ранее, были закрыты исходным раствором хитозана (0,01%). Исходный раствор хитозана (30%, об. / Об. ) смешивали с раствором AuNP (70%, об. / об. ). Смесь перемешивали при 900 об / мин в течение 2 ч до полного улавливания хитозана. Для наностержней использовали избыток CTAB, и, таким образом, центрифугирование (14000 об / мин, 15 мин, 25 ° C) было выполнено для удаления CTAB. Наностержни извлекали из гранулы, и покрытие хитозаном проводили, как упомянуто выше. Затем были получены спектры в УФ-видимом диапазоне.

Оценка коллоидной стабильности

Коллоидная стабильность AuNP важна для приложений in vitro и in vivo. Три типа AuNP с хитозановым кэппингом и наносферы без хитозанового кэппинга были оценены на коллоидную стабильность в следующих растворах:деионизированная вода, 5% бычий сывороточный альбумин (BSA), 5% NaCl, PBS (pH 7,4), среда Игла, модифицированная Дульбекко ( DMEM) и полная среда. Полная среда представляла собой среду DMEM, содержащую 10% фетальную бычью сыворотку (FBS). Один миллилитр каждого типа раствора AuNP был смешан с исследуемым раствором, как указано выше (0,5 мл). Смесь инкубировали при 25 ° C в течение 30 минут и снимали УФ-видимые спектры.

Культура клеток и цитотоксичность

Следующие линии раковых клеток были приобретены в Korean Cell Line Bank (Сеул, Республика Корея):AGS, HeLa, HepG2 и HT29. МТТ-анализ проводили для оценки цитотоксичности AuNP in vitro. Использовали DMEM, содержащую пируват натрия. Среда для культивирования клеток содержала 10% фетальной бычьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 1% пенициллин (100 единиц / мл) и стрептомицин (100 единиц / мл). Клетки культивировали в чашках для культивирования 100 мм и поддерживали примерно 70% конфлюэнтности. Перед культивированием клеток AuNP трех различных форм подвергали вакуумному испарению для получения конечной концентрации Au 5 мМ. На 96-луночные планшеты клетки высевали с плотностью 5,0 × 10 ³ . клеток / лунку, и инкубацию проводили в течение 24 часов в печи при 37 ° C в атмосфере CO ₂ (5%) атмосфера. Затем пять различных концентраций AuNP (500 мкМ, 250 мкМ, 125 мкМ, 62,5 мкМ и 31,25 мкМ) обрабатывали и инкубировали в печи в течение еще 24 часов при 37 ° C в атмосфере CO ₂ . (5%) атмосфера. Затем добавляли реагент МТТ (5 мкл, 5% в деионизированной воде) и инкубировали в печи при 37 ° C в атмосфере CO ₂ . (5%) атмосфера в течение дополнительных 3 часов. Поглощение измеряли при 570 нм с использованием флюоресцентного ридера с множеством детектирования (Synergy HT, Bio Tek Instruments, Winooski, VT, USA). Необработанные клетки использовали в качестве контроля.

Использование сотовой связи

Поглощение клетками каждого типа AuNP количественно измеряли с использованием клеток HepG2. На 24-луночные планшеты клетки высевали с плотностью 5,0 × 10 ⁴ . клеток / лунку, и инкубацию проводили в течение 24 часов в печи при 37 ° C в атмосфере CO ₂ (5%) атмосфера. Затем 5 мкМ (конечная концентрация) каждого типа раствора AuNP обрабатывали и инкубировали в печи в течение дополнительных 24 часов при 37 ° C в атмосфере CO ₂ . (5%) атмосфера. После инкубации раствор, содержащий избыток AuNP, удаляли, и клетки обрабатывали трипсином. Концентрацию Au в трипсинизированных клетках количественно измеряли с помощью ICP-OES и LA-ICP-MS, которые обеспечивали концентрацию поглощения Au клетками. Контроль представлял собой 5 мкМ исходного коллоидного раствора каждого типа AuNP, который также был проанализирован с помощью ICP-OES и LA-ICP-MS для определения концентрации Au.

Результаты и обсуждение

УФ-видимые спектры

УФ-видимые спектры обычно получают для подтверждения синтеза AuNP. Характерный ППР AuNP можно наблюдать в видимом и ближнем инфракрасном диапазоне длин волн. Более того, кэппинг AuNP обычно вызывает либо батохромный (или красный), либо гипсохромный (или синий) сдвиг. Кроме того, гипохромный сдвиг обычно индуцируется вместе с красным и синим сдвигами. Как показано на рис. 1b, УФ-видимые спектры контролировались в диапазоне 300 ~ 800 нм. Наносферы показали характерный SPR 532 нм с глубоким бордовым цветом. После покрытия наносфер хитозаном максимальный SPR сдвигался в красную область до 537 нм вместе с гипохромным сдвигом (рис. 1b). Для нанозвезд наблюдался широкий диапазон длин волн ППР (600 ~ 800 нм) с темно-синим раствором (рис. 2б). Хитозановое покрытие нанозвезды показало гипохромный сдвиг, при котором поглощение было ниже, чем у AuNP без хитозанового покрытия (рис. 2b). Наностержни показали две различные длины волны ППР 514 нм и 815 нм с образованием светло-розового раствора (рис. 3b). Покрытие наностержней хитозаном индуцировало синий сдвиг до 797 нм вместе с гипохромным сдвигом (рис. 3b). Принимая во внимание все эти результаты, покрытие AuNP хитозаном изменяет длину волны ППР и вызывает сдвиги. Тщательное изучение УФ-видимых спектров показало, что три типа AuNP успешно блокируются хитозаном.

Гидродинамический размер и дзета-потенциалы

Затем были измерены гидродинамический размер и дзета-потенциалы; результаты представлены в таблице 1. Без хитозанового покрытия гидродинамические размеры наносфер и нанозвезд были 28,4 и 97,8 нм соответственно. Гидродинамический размер наностержней не измерялся, поскольку гидродинамический размер хорошо согласован со сферической формой наночастиц. Благодаря хитозановому покрытию гидродинамический размер был увеличен до 190,7 нм для наносфер и до 123,9 нм для нанозвезд. Хитозановое покрытие было подтверждено увеличением гидродинамического размера. Изменение дзета-потенциалов также отражало блокировку хитозана на поверхности AuNP. Хитозан - это положительно заряженный полисахарид; таким образом, кэппирование хитозаном приводило к положительным дзета-потенциалам для всех трех типов AuNP. Для наносфер дзета-потенциал был изменен с -12,73 до 42,28 мВ. Дзета-потенциал нанозвезд был изменен с -42,46 до 47,44 нм. В случае наностержней для синтеза был использован CTAB (катионное поверхностно-активное вещество). Таким образом, исходный дзета-потенциал без покрытия составлял 27,96 мВ. Покрытие наностержней хитозаном увеличивало дзета-потенциал до 33,23 нм. Таким образом, изменение дзета-потенциалов с отрицательных на положительные значения для наносфер и нанозвезд ясно указывает на успешное укупоривание хитозаном. Кроме того, дзета-потенциал наностержней увеличился, что позволяет предположить, что поверхность была покрыта хитозаном.

Изображения HR-TEM

Микроскопия имеет решающее значение для исследования наночастиц, поскольку она дает важную информацию о размере и форме наночастиц. Инструменты микроскопии предоставляют широкий спектр подробной информации, такой как состояние дисперсии, двух- и трехмерная морфология и топография, а также относительная мягкость / твердость материалов. Наносферы имели размер 8,7 ± 1,7 нм, исходя из среднего значения 75 случайно выбранных дискретных наночастиц на изображениях HR-TEM (рис. 4). Самый распространенный размер составлял 8 ~ 9 нм (29,3%), за которым следовали 9 ~ 10 нм (12,0%). При использовании хитозанового покрытия форма наносфер сохранялась без каких-либо изменений (рис. 4c, d). Кристаллическая природа частиц четко указывается структурой решетки, показанной на рис. 4d. Измеренное расстояние между соседними решетками составило 0,24 нм (рис. 4г). Кроме того, слой хитозана также был визуализирован, как показано красными стрелками на рис. 4d. Нанозвезды были визуализированы с помощью HR-TEM, как показано на рис. 5. Размер нанозвезд составляет 99,0 ± 47,0 нм, что представляет собой среднее значение для 19 дискретных наночастиц. Структура решетки показана на увеличенном изображении (рис. 5в). Как показано, измеренное расстояние между соседними решетками составило 0,24 нм (рис. 5c). Красные стрелки на рис. 5в указывают на слой хитозана. Наностержни были визуализированы, как показано на фиг. 6. Средняя длина и ширина частиц составляли 60,4 нм и 16,4 нм, соответственно, согласно измерениям, проведенным для 28 частиц. Соотношение сторон, определяемое как длина частицы, разделенная на ширину частицы, составляло 3,7. Структура решетки показана на рис. 6в, что подтверждает кристаллическую структуру наностержней. Измеренное расстояние между соседними решетками составило 0,23 нм (рис. 6в). Красные стрелки указывают на слой хитозана (рис. 6в).

ВР-ПЭМ изображения золотых наносфер. Масштабные линейки представляют a 5 нм, b 20 нм, c 20 нм и d 5 нм. Изображения а и b были получены без хитозана, и c и d были получены с хитозановым покрытием. Измеренное расстояние между соседними решетками составило 0,24 нм. Красные стрелки указывают на слой хитозана после укупорки

HR-TEM-изображения золотых нанозвезд. Масштабные линейки представляют a 200 нм, b 50 нм и c 5 нм. г Схематическое изображение нанозвезд со средним размером 99.0 ± 47.0 нм. Изображение а был получен без хитозана, и b и c были получены с хитозановым покрытием. Измеренное расстояние между соседними решетками составило 0,24 нм. Красные стрелки указывают на слой хитозана после укупорки

ВР-ПЭМ изображения золотых наностержней. Масштабные линейки представляют a 100 нм, b 200 нм и c 5 нм. г Схематическое изображение наностержней со средней длиной и шириной 60,4 нм и 16,4 нм соответственно. Изображение а был получен без хитозана, и b и c были получены с хитозановым покрытием. Измеренное расстояние между соседними решетками составило 0,23 нм. Красные стрелки указывают на слой хитозана после укупорки

ИК-Фурье-спектры

Зеленый чай содержит разнообразные первичные и вторичные метаболиты. В частности, основными составляющими зеленого чая являются полифенолы, включая эпигаллокатехин-3-галлат, (-) - эпикатехин-3-галлат, (-) - эпигаллокатехин и (-) - эпикатехин [28]. ИК-Фурье спектры были получены для получения информации о функциональных группах, которые способствовали синтезу AuNP. Мы сравнили ИК-Фурье спектр наносфер со спектром экстракта (рис. 7). Основной функциональной группой, которая, скорее всего, участвует в реакции восстановления солей Au, является –ОН. В экстракте функциональные группы –OH появляются при 3255 см ^-1 . (Рис. 7а). После синтеза этот пик был смещен в сторону более высокого волнового числа на 3300 ~ 3341 см ^-1 . . Этот результат продемонстрировал, что функциональные группы –OH происходят из полифенолов, окисленных до C =O, при восстановлении солей Au до AuNP. Примечательно, что появление функциональных групп C =O при 1716 см ^-1 в наносферах явно подтверждает окисление функциональных групп –OH во время синтеза (рис. 7b).

ИК-Фурье спектры a экстракт зеленого чая, используемый для синтеза и b золотые наносферы

Оценка коллоидной стабильности при различных растворах

Коллоидная стабильность наночастиц - важная проблема для диагностических и терапевтических применений. Шесть различных растворов были протестированы на коллоидную стабильность:(i) деионизированная вода, (ii) NaCl (5%), (iii) PBS (pH 7,4), (iv) BSA (5%), (v) DMEM и (vi) ) полная среда (DMEM с 10% FBS). После смешивания каждого типа AuNP с тестируемым раствором были получены спектры в УФ-видимом диапазоне; результаты показаны в таблице 2 и на рис. 8. Гипохромный сдвиг вместе с небольшим сдвигом в красный или синий цвет наблюдали для всех трех типов AuNP в УФ-видимых спектрах (рис. 8a, c и e). Форма спектров сохранялась, агрегации коллоидного раствора не наблюдалось (рис. 8б, г и е). Этот результат продемонстрировал, что коллоидная стабильность достаточно хорошо сохраняется в вышеупомянутых тестовых растворах.

Оценка коллоидной стабильности. а и b наносферы с хитозановым покрытием, c и d нанозвезды с хитозановым покрытием, е и е наностержни с хитозановым покрытием, г и h наносферы без хитозанового покрытия. DW представляет собой деионизированную воду

В таблице 2 гипохромный сдвиг выражен как процент остаточной абсорбции, при этом абсорбция исходного раствора установлена ​​на 100%. Во всех трех AuNP лучше всего сохранялась коллоидная стабильность в полной среде, которую использовали для последующих экспериментов по цитотоксичности:наносферы (65,3%), нанозвезды (93,4%) и наностержни (80,2%). Белковый раствор БСА (5%) также обеспечивает приемлемую коллоидную стабильность:наносферы (61,8%), нанозвезды (70,2%) и наностержни (72,0%). Эти результаты показали, что белки, покрывающие наночастицы, имеют дополнительные положительные эффекты на коллоидную стабильность AuNP вместе с хитозановым покрытием. Также оценивалась коллоидная стабильность наносфер без хитозанового покрытия (рис. 8g, h). Все растворы вызывали гипохромный сдвиг. Среди протестированных растворов только раствор NaCl (5%) показал большое красное смещение наряду с гипохромным смещением.

Цитотоксичность

Был проведен анализ МТТ для измерения цитотоксичности против четырех типов раковых клеток (фиг. 9):AGS, HeLa, HepG2 и HT29. The cytotoxicity of all three types of AuNPs was dependent on the Au concentration. Among the four cell types, the highest cytotoxicity was observed for HepG2 cells. Furthermore, nanorods showed the highest toxicity against the four cell types, followed by nanostars and finally by nanospheres. Specifically, nanorods showed a very high toxicity; thus, the cytotoxicity of nanorods containing a low range of Au concentrations was also evaluated (Fig. 9e). At concentrations as low as 8 μM Au, nanorods showed concentration-dependent cytotoxicity. Against HepG2 cells, the IC₅₀ value was 127.1 μM Au for nanospheres, 81.8 μM Au for nanostars, and 22.7 μM Au for nanorods. Thus, nanorods were the most cytotoxic, followed by nanostars, and nanospheres were the least cytotoxic against HepG2 cells.

Cytotoxicity assessed by MTT assay (31.25~500 μM Au concentration). а AGS, b HeLa, c HepG2, and d HT29. е Low Au concentrations (8~125 μM) were evaluated on HepG2 cells

It has been reported that the cytotoxicity of AuNPs is affected by size, shape, and surface charge [29, 30]. Favi and co-workers investigated the cytotoxicity of Au nanospheres (61 nm) and Au nanostars (34 nm) against two types of cells (human skin fibroblasts and rat fat pad endothelial cells) [31]. In both cell types, a lethal concentration was observed at 40 μg/mL for nanospheres and at 400 μg/mL for nanostars. Their results suggested that nanospheres were more cytotoxic than nanostars, suggesting that size, shape, and surface chemistry are most likely influential to the cytotoxicity of AuNPs. Woźniak and co-workers reported the cytotoxicity of AuNPs with diverse shapes against both HeLa and HEK293T (human embryonic kidney cells), namely, nanospheres (~ 10 nm), nanoflowers (~ 370 nm), nanorods (~ 41 nm), nanoprisms (~ 160 nm), and nanostars (~ 240 nm) [30]. Interestingly, nanospheres and nanorods were more cytotoxic than nanoflowers, nanoprisms, and nanostars. The authors explained that the small size of the nanoparticles and the aggregation process were the main driving forces for the cytotoxicity of nanospheres and nanorods in their work. Indeed, many studies have addressed the size effect of AuNPs on cytotoxicity [32, 33]. As AuNPs become smaller, their uptake by cells increases. This higher uptake results in a higher concentration of AuNPs in the cell, which leads to higher cytotoxicity against cells. However, a low concentration of AuNPs in the cell also shows high cytotoxicity [34]. The concentration of AuNPs in the cell affects cytotoxicity; however, it is vital to consider and understand the characteristics of AuNPs. The cytotoxicity of AuNPs of two different shapes (nanospheres 43 nm, nanorods 38 × 17 nm) was evaluated in epithelial cells by Tarantola and co-workers [35]. Nanospheres were determined to be more cytotoxic than nanorods. Furthermore, nanospheres induced a dysfunction in epithelial cell membranes, which was measured by electric-cell substrate impedance sensing [35]. As previously discussed, many studies are currently investigating the cytotoxicity of different shapes of AuNPs in various cells. Although the shapes of AuNPs may remain the same, many factors still affect the cytotoxicity of AuNPs. When assessing cytotoxicity, factors including size, shape, physicochemical surface properties, concentration, exposure time, and cell type should also be considered [34, 36,37,38]. In addition to the characteristics of AuNPs, cytotoxic mechanisms including disruption of the cell membrane, oxidative stress, destruction of the cytoskeleton, and loss of mitochondrial function are also important [38, 39]. Currently, autophagy and lysosomal dysfunction are emerging as explanations of the cytotoxicity of nanomaterials [40]. In lysosomes, nanomaterials induce cytotoxicity by lysosomal-iron-mediated oxidative stress and the release of cathepsins and other associated lysosomal hydrolases, which causes mitochondrial dysfunction and cell death. In the current report, nanorods were the most cytotoxic against the four types of cancer cells tested. Thus, our future work will examine the detailed mechanisms of cytotoxicity.

Cellular uptake on HepG2 cells

HepG2 cells showed the highest cytotoxicity among the four types of cancer cells; accordingly, we selected this cell type for evaluating cellular uptake. Two instruments, ICP-OES and LA-ICP-MS, were used to quantitatively analyze the concentration of Au in cells, and the results are shown in Fig. 10. A Au concentration of 5 μM was used for evaluating cellular uptake because no toxicity was observed at this concentration among the four types of cancer cells. The uptake was the highest for nanospheres (58.0 %), followed by nanorods (52.7 %) and nanostars (41.5 %). As indicated in the previous section, the cytotoxicity was dependent on particle shape (nanorods> nanostars> nanospheres). However, the order of cellular uptake (nanospheres> nanorods> nanostars) did not match the order of cytotoxicity. The cellular uptake of nanospheres was the highest; however, the cytotoxicity of these particles was the lowest. These results suggest that high cellular uptake does not always induce high cytotoxicity. As mentioned previously, diverse factors including size, shape, physicochemical surface properties, concentration, exposure time, and cell type are important in influencing cytotoxicity.

Cellular uptake by HepG2 cells

The different degrees of uptake of the three types of AuNPs (41.5~58.0 %) possibly depend on the competition between wrapping (i.e., how a membrane encloses a nanoparticle) under a thermodynamic driving force and receptor diffusion kinetics [41, 42]. Chithrani and Chan compared the cellular uptake of transferrin-coated Au nanospheres and Au nanorods by HeLa cells [42]. At the same size (i.e., the same value for the nanosphere diameter and nanorod width), nanospheres showed higher uptake than did nanorods. This result is consistent with our observations in the current report of higher uptake of nanospheres compared with nanorods. For nanorod uptake, width is more important than length, and an increasing aspect ratio decreases the uptake rate [42]. The size of the nanostars was 99.0 ± 47.0 nm, making them the largest particles among the three types of AuNPs. For large nanoparticles (> 50 nm), slow receptor diffusion kinetics lead to short wrapping times [42]. Thus, the cellular uptake of large nanoparticles is low, i.e., nanostars in the current report. Chitosan was used for capping the AuNPs to increase their colloidal stability and biocompatibility. Chitosan capping can also play a role in the cellular uptake of AuNPs by interacting with receptors on the cell surface. A detailed mechanistic study is necessary to elucidate this issue.

Conclusion

The continued development of nanotechnology requires elaborate shape and size designs of nanoparticles for successful applications, including as drug delivery carriers or vehicles for biologically active compounds such as anticancer agents. Green tea extract was used as a green reducing agent for the synthesis of Au nanospheres and nanostars. Interestingly, the cytotoxicity of nanorods was higher than that of nanospheres and nanostars, while nanospheres showed the lowest cytotoxicity against four types of cancer cells. Cellular uptake by HepG2 cells was most likely dependent on shape and size; nanospheres showed the highest uptake by the cells, whereas nanostars showed the lowest uptake. The optimization of size and shape together with surface modification and functionalization will lead to the development of nanoparticles for future use in nanomedicine.

Сокращения

AFM:

Атомно-силовая микроскопия

AgNPs:

Silver nanoparticles

AGS:

Human gastric adenocarcinoma cells

AuNPs:

Наночастицы золота

CTAB:

Cetyltrimethylammonium bromide

DLS:

Динамическое рассеяние света

DMEM:

Dulbecco’s modified Eagle’s medium

FBS:

Фетальная бычья сыворотка

FT-IR:

Инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье

HeLa:

Human epithelial cervix adenocarcinoma cells

HepG2:

Human hepatocyte carcinoma cells

HR-TEM:

Просвечивающая электронная микроскопия высокого разрешения

HT29:

Human colorectal adenocarcinoma cells

ICP-OES:

Inductively coupled plasma optical emission spectroscopy

LA-ICP-MS:

Laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry

SEM:

Сканирующая электронная микроскопия

SPR:

Поверхностный плазмонный резонанс