Усиленные проапоптотические эффекты водных комплексов химиотерапевтических препаратов на основе 4-тиазолидинона с ПЭГ-содержащим полимерным наноносителем

Введение

Химиотерапия является основным методом лечения многих опухолей, а химиотерапевтические препараты выбираются в качестве последнего варианта, особенно в случаях, когда рак уже распространился [1]. Однако серьезные отрицательные побочные эффекты снижают клиническую эффективность многих современных противоопухолевых препаратов. Следовательно, существует постоянная и острая необходимость в разработке альтернативных или синергических противоопухолевых препаратов с уменьшенными или минимальными побочными эффектами [2].

Низкая растворимость в воде противоопухолевых препаратов была распространенной и серьезной проблемой, которая препятствовала их разработке и клиническому применению, и многие высокоактивные и многообещающие химиотерапевтические препараты были исключены из-за их низкой растворимости в воде [3]. Поверхностно-активные вещества и сорастворители используются в высоких концентрациях для растворения нерастворимых в воде противораковых агентов; однако эти вещества также могут вызывать побочные эффекты, что ограничивает использование многих противоопухолевых препаратов [4].

Большой проблемой при разработке фармацевтических препаратов является устранение или, по крайней мере, уменьшение негативных побочных эффектов высокоактивных лекарств, особенно противоопухолевых агентов, проявляющих общую токсичность для организма, что значительно ограничивает их использование [5,6,7,8,9 ]. Эффективный способ преодоления этой проблемы - использование многофункционального наноносителя лекарства, который позволит токсичным противоопухолевым агентам связываться в месте их доставки к клеткам-мишеням в определенных органах или тканях [8, 10, 11]. Небольшой размер, контролируемая специфическая структура, большая площадь поверхности и форма наночастиц обеспечивают им ряд преимуществ по сравнению с другими материалами [5, 8, 9]. Используя наночастицы, можно оптимизировать эффективность, минимизировать негативные побочные эффекты и улучшить терапию рака [12, 13]. Таким образом, препараты, которые ранее не работали из-за высокой общей токсичности, теперь могут получить вторую возможность клинического использования благодаря их включению в систему доставки, которая имеет улучшенную биодоступность и контролируемое высвобождение. Такие комплексы лекарство-носитель легче проникают через естественные барьеры, такие как гематоэнцефалический барьер или мембраны отдельных клеток. Большая площадь поверхности наночастиц позволяет им образовывать комплексы со специфическими векторными биомолекулами, которые способствуют доставке лекарств к целевому органу, приводят к значительному снижению или даже полному устранению негативных побочных эффектов, позволяют увеличить минимальную эффективную дозу. при однократном приеме препарата усиливают эффективность действия препарата и дают новый стимул для развития персонализированной фармакотерапии. Кроме того, наночастицы могут инкапсулировать молекулы, которые улучшают растворимость, стабильность и абсорбцию некоторых лекарств [11, 13, 14, 15]. Системы доставки лекарств могут обеспечивать длительную циркуляцию лекарства в крови, способность лекарства накапливаться во время патофизиологического процесса и способность эффективно переносить молекулу активного вещества в клетки и органеллы клеток. Наночастицы должны быть стабильными, сохранять свою химическую структуру в течение определенного периода времени и в то же время быть способными к биоразложению [16, 17].

Для оценки новых противоопухолевых препаратов важно измерить их цитотоксическую активность и эффективность с использованием различных целевых линий раковых клеток человека и экспериментальных моделей опухолей in vivo . Химиотерапия часто терпит неудачу из-за недостаточности процесса апоптоза, который играет ключевую роль в вызванной лекарством гибели клеток, возникающей вследствие или в результате изменения онкогенеза [18,19,20,21].

Поскольку многие злокачественные клетки могут избежать апоптотической гибели, следует использовать рациональный подход при разработке новых противоопухолевых препаратов. Основные цели создания новых противоопухолевых препаратов:(1) найти способы преодоления мутаций отдельных раковых клеток, влияющих на независимые механизмы действия лекарств; и (2) разработать схемы химиотерапии, способные одновременно воздействовать на независимые пути. Лучшее понимание взаимосвязи между генетикой рака и чувствительностью к лечению является ключевым вопросом для разработки новых эффективных противоопухолевых препаратов [22].

В предыдущих исследованиях мы продемонстрировали, что синтетические производные 4-тиазолидинона (Les-3288, Les-3833 и Les-3882), вероятно, используют другие механизмы действия, чем другие противораковые агенты, для уничтожения клеток глиомы C6 крысы и глиобластомы человека U251 in vitro, наоборот. доксорубицину (Dox). Les-3288 существенно не влиял на уровень активных форм кислорода (АФК) в обработанных клетках [23, 24]. Следует подчеркнуть, что эти сильнодействующие противоопухолевые средства показали меньшую общую токсичность в организме экспериментальных животных, о чем свидетельствуют измеренные биохимические параметры их токсического действия на опухолевые клетки и животных, по сравнению с таковыми Докса [7, 8]. Таким образом, связывание противоопухолевого препарата с полимерным наноносителем (ПНН) и нанесение препарата в виде стабильной системы доставки воды может снизить токсические эффекты в органах животных по сравнению с действием этих веществ в свободной форме [ 7, 8].

Целью данной работы было изучение индукции апоптоза в клетках глиомы крысы линии C6 in vitro и in vivo с помощью водных составов комплексов производных 4-тиазолидинона с PEG-содержащими PNC и сравнение индукции апоптоза с использованием этих производных. в свободной форме.

Материалы и методы

Противораковые препараты

Гетероциклические производные 4-тиазолидинонов (соединения Les-3288 и Les-3833, рис.1) были синтезированы на кафедре фармацевтической, органической и биоорганической химии Львовского национального медицинского университета имени Данила Галицкого, Украина, как описано ранее [25]. / P>

Состав исследуемых соединений - Лес-3288 и Лес-3833

Перед использованием в культуре клеток эти соединения растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО, Артериум, Львов, Украина). Раствор дополнительно выдерживали 5 мин на кипящей водяной бане и разбавляли дистиллированной водой до рабочих концентраций. Конечная концентрация ДМСО в культуральной среде была ниже 0,1%. Докс был куплен в местной аптеке у представителя Pfizer (Италия) в Украине.

Полимерный наноноситель

PNC для доставки лекарств был синтезирован на кафедре органической химии Львовского политехнического национального университета, Украина, по методике, описанной ранее [26, 27]. Синтез поли (ВЭП- co -GMA)-трансплантат-ПЭГ проводили в следующие стадии следующим образом. Поли (ВЭП- co -ГМА) был синтезирован радикальной сополимеризацией 5- трет бутилперокси-5-метил-1-гексен-3-ин (VEP, 0,41 г, 0,5 моль) (пероксидный мономер, синтезированный описанным методом [28]) и глицидилметакрилат (GMA, 7,72 г, 12,2 моль) (Sigma-Aldrich , США) в этилацетате (7,9 мл) (Merck, Дармштадт, Германия) с использованием азоизобутиронитрила (AIBN, 0,129 г, 0,05 моль) (Merck, Дармштадт, Германия) в качестве радикального инициатора. Полимеризацию проводили при 343 К до достижения максимальной конверсии 65%. Поли (ВЭП- co -GMA) использовали в качестве основы для присоединения боковых цепей PEG посредством реакций присоединения метилового эфира полиэтиленгликоля (mPEG) к боковым эпоксидным группам. Эфират трифторида бора (0,027 мл, 0,031 моль) (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) добавляли к раствору сополимера (1,0 г) в диоксане (20 мл; Merck, Дармштадт, Германия) при 313 K и перемешивают 3 часа. мПЭГ (2,5 мг, 3,35 ммоль) (Sigma-Aldrich, США) растворяли в диоксане (15 мл), раствор смешивали с раствором полимера основной цепи и перемешивали в течение 6 ч при 313 К. Непрореагировавший мПЭГ удаляли с помощью диализных мешков. с размером пор порогового значения молекулярной массы (MWCO) 6-8 кДа (Sigma-Aldrich, США). В результате получается гребенчатый поли (VEP- co -GMA) -Профиль-ПЭГ сушили при комнатной температуре в вакууме до постоянного веса. Структура и некоторые характеристики PNC представлены на рис. 2 и были описаны ранее [29].

Схематическая структура PNC - poly (VEP -co- GMA) - прививка -ПЭГ с основной цепью на основе сополимера ненасыщенного пероксида 2- трет -бутилперокси-2-метил-5-гексен-3-in (VEP, обозначается «k») с боковыми цепями из глицидилметакрилата (GMA, обозначается «l») и полиэтиленгликоля (PEG, обозначается «m» )

Для приготовления растворов PNC на водной основе 0,09 г PNC растворяли в 0,9 мл ДМСО. Этот раствор PNC добавляли к 8,0 мл 0,9% раствора NaCl. Затем раствор перемешивали в течение 0,5 ч и обрабатывали ультразвуком в течение 10 с. Водные дисперсии комплексов получали, капая в воду раствор 4-тиазолидинонов и PNC в ДМСО в следующем порядке:0,045 г PNC растворяли в 0,15 мл DMSO (Sigma-Aldrich, США) и 0,0015 г Les -3288 (или Les-3833) растворяли в 0,10 мл ДМСО. Растворы PNC и 4-тиазолидинонов смешивали и добавляли к 4,25 мл 1% водного раствора NaCl и обрабатывали ультразвуком в течение 10 с.

Этот поверхностно-активный PNC содержит гидрофильные цепи PEG, привитые к гидрофобной основной цепи (рис. 2a). В водных растворах амфифильные PNC образуют мицеллоподобные структуры, которые могут солюбилизировать нерастворимые в воде соединения (например, лекарства), или эти соединения могут адсорбироваться на поверхности наночастиц, тем самым повышая их биосовместимость. Методика, разработанная для получения высокостабильных водных дисперсий химиотерапевтических средств на основе 4-тиазолидинона, заключается в зародышеобразовании наноразмерных частиц лекарства, которое происходит, когда разбавленные растворы в ДМСО переносятся в осаждающий солевой раствор, содержащий полимерное поверхностно-активное вещество PNC, которое обеспечивает полимерное покрытие для поверхность наночастиц. В результате за счет агрегации и осаждения комплекс стабилизировался и предотвращалось диспергирование. Кроме того, наноразмерные комплексы производных 4-тиазолидинона защищены от возможных взаимодействий с окружающей биологической микросредой. Эта защита позволяет им дольше оставаться в организме без потери стабильности и накапливаться в целевой ткани или органе, не вызывая отрицательных побочных эффектов. Таким образом, такая модификация обеспечивает повышенную агрегационную и седиментационную стабильность водных дисперсий наночастиц противоракового соединения.

Размеры полимерных мицелл PNC и комплексов PNC с гетероциклическими 4-тиазолидинонами измеряли методом динамического рассеяния света (DLS) с использованием Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments GmbH, Штутгарт, Германия) и DynaPro NanoStar (Wyatt Technology, Санта Барбара, Калифорния, США) и по спектрам корреляции фотонов с использованием технологии неинвазивного обратного рассеяния (NIBS) при 25 ° C. Образцы для измерений DLS готовили, как описано выше, и при необходимости разбавляли бидистиллированной водой, pH 6,5–7,0. Для каждого образца было выполнено от трех до пяти измерений (каждое измерение состояло из 5 циклов, а интервал между измерениями составлял 5 минут). На рисунке 3 показано распределение по размерам мицеллярных структур PNC и наночастиц комплексов PNC с гетероциклическими 4-тиазолидинонами (Les-3833 и Les-3288), проанализированных с помощью DLS. Размер и морфологию мицелл PNC, а также наночастиц 4-тиазолидинона, покрытых PNC, изучали с помощью просвечивающего электронного микроскопа JEM-200А (JEOL, Япония) при ускоряющем напряжении 200 кВ [30, 31]. Образцы готовили, как описано выше, и при необходимости разбавляли бидистиллированной водой. Образцы готовили путем распыления исследуемого раствора на подложку с помощью ультразвукового диспергатора УЗДН-1А (ООО «Укрросприбор», Украина), который способствует равномерному нанесению покрытия на подложку. В качестве подложки использовалась тонкая пленка аморфного углерода, нанесенная на медную сетку. Размеры и морфология мицелл PNC и комплексов с гетероциклическими 4-тиазолидинонами (Les-3288 и Les-3833), исследованные методами DLS и TEM, представлены на рис. 3.

Изображения с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) PNC (слева) и комплекса PNC + Les-3833 (справа)

Исследования DLS и просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) показали, что размер мицелл PNC составлял 50 ± 25 нм, а размер наночастиц, образованных комплексами PNC с гетероциклическими 4-тиазолидинонами Les-3833 и Les-3288, составлял 140 ± 25 нм и 155 нм. ± 30 нм соответственно . Дисперсии комплексов PNC с производными 4-тиазолидинона обладают высокой стабильностью и защищены от агрегации и седиментации адсорбированной оболочкой PNC на поверхности наночастиц тиазолидинона. Как показано на рис. 4, изменения размеров наночастиц, диспергированных в водной системе, незначительны при многократных разбавлениях водой, а также после 6 месяцев старения водных систем комплексов PNC с 4-тиазолидинонами.>

ДЛС исследование гидродинамических диаметров ПНК и комплексов ( а ) и зависимости средних размеров комплексов ПНК-лекарственное средство от разведения дисперсии ( b ):водные дисперсии PNC (1), комплексы Les-3833 + PNC (2) и Les-3288 + PNC (3), а также гидродинамические размеры Les-3833 + PNC (1–3) и Les- 3288 + PNC (4–6) дисперсии после хранения в течение 2 дней (1,4), 4 месяцев (2,5) и 6 месяцев (3,6) ( c )

Культура клеток

Клетки глиомы крысы линии С6 были получены из Коллекции клеточных культур Института молекулярной биологии и генетики НАН Украины (Киев, Украина). Клетки культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM, Sigma, США), с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (Sigma, США). Клетки выращивали в CO ₂ -инкубатор при 37 ° C, 5% CO ₂ и влажностью 95%. Пересев клеток производили в соотношении 1:5 1 раз в 2–3 дня.

Оценка цитотоксического действия исследуемых веществ

Клетки высевали в 24-луночные планшеты при концентрации 100000 клеток / мл в одной лунке. (Greiner Bio-One North America, Inc., Монро, Северная Каролина, США). Исследуемые вещества добавляли в концентрациях 0,1, 0,5 и 1,0 мкМ после 24-часового периода адаптации, который начинался после посева клеток. Подсчет клеток проводился через равные промежутки времени в гемоцитометрической счетной камере с использованием красителя трипанового синего (DV-T10282, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Corp., Уолтем, Массачусетс, США) при конечной концентрации 0,01% через 2 мин после его добавления в суспензию клеток. . Мертвые клетки поглотили этот краситель из-за повреждения их плазматической мембраны.

Проточная цитометрия

Для изучения клеточного цикла и апоптоза клетки C6 обрабатывали Les-3288, Les-3833 и их комплексы с PNC, а также PNC в свободной форме, промывали фосфатно-солевым буфером (PBS, pH 7,4), осаждали центрифугированием. при 1000 об / мин в течение 5 минут при 4 ° C и повторно суспендировали в холодном PBS (2 миллиона клеток на 1 мл PBS). Затем клетки фиксировали добавлением аликвот 4 мл абсолютного этанола, охлажденного до -20 ° C, при осторожном перемешивании. Фиксированные образцы хранили при -20 ° C до использования (не более 1 недели). Для анализа сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS) образцы клеток центрифугировали при 1000 об / мин в течение 5 мин при 4 ° C, супернатант удаляли и осадок клеток повторно суспендировали в 1 мл PBS. К этой суспензии добавляли сто микролитров РНКазы, не содержащей ДНКаз (Sigma, США), и инкубировали образцы при 37 ° C в течение 30 мин. Затем в каждый образец добавляли 100 мкл иодида пропидия (PI) (Sigma, США, 1 мг / мл) и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин. Наконец, образцы переносили в пластиковые пробирки Falcon, и суспензию клеток контролировали с помощью проточного цитометра FACSCalibur (BD Biosciences, Маунтин-Вью, Калифорния, США) и программного обеспечения Summit v3.1 (Cytomation, Inc., Форт-Коллинз, Колорадо, США). США) для измерения параметров клеточного цикла и апоптоза.

Измерение количества клеток, положительных по аннексину V (апоптотических), проводили с использованием анализа FACS. Клетки глиомы С6 крысы обрабатывали PNC, Les-3288, Les-3833 и их полимерными конъюгатами в концентрациях 0,1, 0,5 и 1 мг / мл, как показано под рисунками. В конце эксперимента клетки отделяли от дна чашки раствором трипсин-ЭДТА, дважды промывали PBS и окрашивали аннексином V-FITC с использованием набора для обнаружения апоптоза (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния, США). , согласно инструкции производителя. Промытые клетки инкубировали в течение 15 мин в буфере для связывания аннексина V (BD Pharmingen), содержащем 1/50 объема раствора аннексина V, конъюгированного с FITC. Затем образцы дважды разбавляли подходящим объемом связывающего буфера аннексина V и сразу же измеряли на канале FL1 / FL2 (FITC-PI) проточного цитометра (Becton Dickinson, США). Положительные по аннексину V клетки были классифицированы как апоптотические.

Анализ ДНК-комет

Анализ ДНК-кометы проводили в щелочных условиях. Десять тысяч клеток смешивали с 75 мкл агарозы с низкой температурой плавления (0,5%) на образец. После смешивания образец пипеткой наносили на предметное стекло, которое было предварительно покрыто 1,5% агарозой с нормальной точкой плавления. Образцы инкубировали при 4 ° C в течение 18 ч в растворе для лизиса (2,5 М NaCl, 100 мМ ЭДТА, 10 мМ Трис-основание, 10% ДМСО, 1% Тритон Х-100). Чтобы обеспечить раскручивание ДНК и проявление неустойчивых к щелочам повреждений, слайды инкубировали в растворе щелочи при комнатной температуре в течение 20 мин (проводились в темноте). Для электрофореза (~ 74 В / см в течение 30 мин) предметные стекла переносили в горизонтальную камеру и добавляли 1x буфер для электрофореза (0,3 М NaOH, 1 мМ ЭДТА, pH> 13). Слайды фиксировали в ледяном 100% метаноле и сушили. Слайды окрашивали 80 мкл 1 × бромистого этидия (EtBr) на 5 мин, а затем погружали в охлажденную дистиллированную воду для удаления избытка пятен. ДНК-кометы визуализировали с помощью микроскопа (Carl Zeiss, Германия), а изображения анализировали с помощью программного обеспечения «CASP» (программа Casplab-1.2.3b2, CASPlab, Вроцлав, Польша). Было подсчитано сто комет на выборку. Повреждение ДНК было разделено на пять уровней генотоксичности в зависимости от размера хвоста кометы:0 (повреждение 0–5%), 1 (повреждение 5–25%), 2 (повреждение 25–45%), 3 (повреждение 45–70%). ) и 4 (более 70% повреждений) [32]. Индекс повреждения (DI) рассчитывался, как описано ранее [33].

Анализ интеркаляции ДНК с использованием красителя метилового зеленого

Соединения Les-3288 и Les-3833 были исследованы на способность интеркалировать в молекулу ДНК с помощью анализа метилового зеленого [34]. ДНК спермы лосося (10 мг / мл) инкубировали в течение 1 ч при 37 ° C с 15 мкл раствора метилового зеленого (1 мг / мл в H ₂ О). Соединения добавляли в концентрации 1 мкг / мл и инкубировали при 37 ° C в темноте в течение 2 часов. Общий конечный объем образцов составил 1 мл. Поглощение метилового зеленого измеряли при 630 нм после инкубации образца в течение 2 ч при 37 ° C с использованием многоканального микрофотометра BioTek 76 883 (BioTek, Winooski, VT, USA). EtBr использовали в качестве положительного контроля.

Анализ данных и статистика

Все эксперименты повторяли трижды с тремя параллелями в каждом варианте. Для сравнения групп использовали дисперсионный анализ (ANOVA). Данные о распределении клеток глиомы крысы C6 в различных фазах клеточного цикла анализировали с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим апостериорным множественным сравнительным тестом Тьюки. Все данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. А п значение <0,05 считалось статистически значимым.

Результаты

Цитотоксический эффект (тест исключения трипанового синего) производных 4-тиазолидинона, используемых в свободной форме и в комплексе с полимерным наноносителем

Результаты теста исключения трипанового синего показали, что формы комплексов Les-3288 и Les-3833 на водной основе с PNC обладают повышенной токсичностью в отношении клеток глиомы C6 (обработка 24 и 48 часов) по сравнению с цитотоксичностью, наблюдаемой при использовании свободная форма этих соединений (рис. 5 и 6). Наибольший цитотоксический эффект наблюдался при дозах 0,1 и 0,5 мкМ соединений Les-3288 и Les-3833 в их комплексах с PNC, в то время как при наивысшей дозе (1,0 мкМ) этих соединений было обнаружено усиление комплексообразования с PNC. только в случае Лес-3288 на 24 ч (рис. 5 и 6).

Количество живых клеток глиомы С6 крысы, измеренное с помощью теста исключения трипанового синего, после обработки в течение 24 и 48 часов различными концентрациями (0,1, 0,5 и 1,0 мкМ) только Les-3288 по сравнению с действием его комплекса с полимерным наноносителем ( PNC) * P <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001 ( разница по сравнению с контролем, 100%)

Количество живых клеток глиомы С6 крысы, измеренное с помощью теста исключения трипанового синего, после обработки в течение 24 и 48 часов различными концентрациями (0,1, 0,5 и 1,0 мкМ) только Les-3833 по сравнению с действием его комплекса с полимерным наноносителем ( PNC) * P <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001 (разница по сравнению с контролем, 100%)

Комплексообразование соединений Les-3833 и Les-3288 с полимерным наноносителем усиливает их проапоптотическую активность in vitro в отношении клеток глиомы C6 крысы

Для оценки модулирующего действия PNC на цитотоксический потенциал выбранных производных 4-тиазолидинона были использованы два альтернативных подхода. Во-первых, был проведен анализ клеточного цикла, чтобы изучить влияние комплексов лекарство-PNC на клеточный цикл. Кроме того, двойное окрашивание аннексином V / PI использовалось для определения точного типа гибели клеток, вызванной этими нанокомпозитами.

Соединения Les-3288 и Les-3833 в низких дозах (0,1 мкг / мл и 0,5 мкг / мл) не оказывали видимого эффекта ни на прогрессирование клеточного цикла, ни на индукцию апоптоза, как показано на рис. 7 и в таблице 1. Однако комплексообразование оба соединения с PNC значительно увеличивали количество клеток в пре-G ₁ фаза (4-кратная для Les-3288 и 6-кратная для Les-3833), что указывает на значительное повышение их проапоптотического потенциала. Следует подчеркнуть, что PNC в свободной форме не влияли на цикл клеток или индукцию апоптоза; таким образом, наблюдаемое появление большой популяции клеток пре-G1 при обработке комплексов тиазолидинон-наноноситель не может быть объяснено простым синергетическим эффектом PNC и экспериментальных препаратов.

Влияние на развитие клеточного цикла производных 4-тиазолидинона Les-3288 и Les-3833 в свободной форме и в комплексе с полимерным наноносителем (PNC) в клетках глиомы крысы C6. Окрашивание иодидом пропидия (PI), проточная цитометрия. R2, до G1; R3, G1; R4, S; Фаза R5, G2. FL2-H, пиковые значения эмиссии второго канала (фильтр 585/40) проточного цитометра

Чтобы подтвердить, что наблюдаемый пик суб-G1 состоит из апоптотических клеток, были проанализированы результаты анализа окрашивания аннексином V / PI. Мы не наблюдали значительной экстернализации фосфатидилсерина (основного маркера раннего апоптоза, определяемого FITC-конъюгированным аннексином V) во время лечения глиомы C6 низкими (0,1 и 0,5 мкг / мл) и высокими дозами Les-3288 (1,0 мкг / мл). , что позволяет предположить, что это соединение является слабым индуктором апоптоза. Вместо этого мы обнаружили увеличение популяции некротических клеток (с 1,2% в контроле до 11,25% для Les-3288, 1,0 мкг / мл), что может указывать на то, что Les-3288, по крайней мере, частично вызывает гибель некротических клеток. Однако комплексообразование Les-3288 с PNC полностью изменило механизм действия этого препарата. Наблюдалось значительное увеличение количества клеток с ранним апоптозом (Аннексин V (+) / PI (-)) и позднего апоптоза (Аннексин V (+) / PI (+)), в то время как общее количество чисто некротических клеток оставалось на уровне уровень контрольных (необработанных) клеток (рис. 8а). Таким образом, связывание Les-3288 с PNC не только сильно усиливает его проапоптотическую активность по отношению к клеткам глиомы, но также снижает его потенциальный механизм про-некротической гибели клеток. Эти данные могут иметь ключевое значение для клинической практики, поскольку про-некротические препараты не рекомендуются для использования из-за массивного индукции воспаления, что неудобно для пациентов.

Сравнение проапоптотической активности Les-3288 ( a ) и Лес-3833 ( б ) соединения и их комплексы с полимерным наноносителем (ПНК) по отношению к клеткам глиомы С6 крысы. Двойное окрашивание аннексином V / PI, проточная цитометрия. PI, иодид пропидия

Удивительно, но мы не наблюдали такого же эффекта для комплекса Les-3833 + PNC. Фактически, проапоптотическая активность комплекса Les-3833 + PNC была ниже по сравнению с Les-3288 в свободной форме при всех испытанных концентрациях (рис. 8b). Столь резкое различие между обоими соединениями можно объяснить особенностями их химической структуры, и мы предполагаем, что в случае Les-3833 структура полимера должна быть оптимизирована для достижения лучших результатов.

Кометный анализ повреждения ДНК в клетках глиомы С6 крысы, вызванного производными 4-тиазолидинона в свободной форме и в комплексе с PNC

Щелочной анализ комет позволяет обнаруживать разрывы одноцепочечной ДНК в щелочно-лабильных участках ДНК. Полученные результаты оценивались с использованием среднего значения момента Olive tail (OTM). Наши данные показали, что обработка клеток глиомы крысы С6 препаратами Les-3288, Les-3833 и PNC (концентрация 0,5 мкг / мл) в течение 3 ч (рис.9 и 10) не вызывала значительного повреждения ДНК (ОТМ =0,7299 ± 0,1276, ОТМ =1,466 ± 0,3086, ОТМ =0,5846 ± 0,1078, соответственно) по сравнению с необработанными клетками в контроле (ОТМ =0,4541 ± 0,07273). Однако обработка клеток комплексом Les-3833 + PNC (ОТМ =2,3880 ± 0,2212) вызвала более значительное повреждение ДНК, чем обработка клеток свободной формой Les-3833. Такого увеличения повреждений не наблюдалось при действии комплекса Les-3288 + PNC (рис. 9 и 10).

Повреждение ДНК оценивали с использованием момента оливкового хвоста в клетках глиомы С6 крысы, обработанных в течение 3 часов экспериментальными противоопухолевыми соединениями, используемыми в концентрации 0,5 мкг / мл. * P ≤ 0,05; ** P ≤ 0,01; *** P ≤ 0,001. PNC, полимерный наноноситель; Докс, доксорубицин (положительный контроль)

Наличие ДНК в кометном хвосте клеток глиомы С6 крысы после обработки в течение 3 ч ( a ) control (untreated cells), Les-3288 (b ), Les-3288+PNC (c ), Les-3833 (d ) Les-3833 + PNC (e ), PNC (f ) and doxorubicin (g ), used at a 0.5 μg/mL concentration

An increase of cell incubation time to 6 h (Figs. 11 and 12) caused greater DNA damage in all experimental groups:Les-3288, Les-3288+PNC, Les-3833, Les-3833+PNC, and Dox (positive control). However, the effects of the Les-3288+PNC and Les-3833+PNC complexes appeared to be lower than the effects of the free forms of Les-3288 and Les-3833. It should be noted that the DNA-damaging effect of the complexes of both derivatives with the PNC was less than such effect from these derivatives used in free form.

DNA damage was evaluated using the Olive tail moment in rat glioma C6 cells treated for 6 h with experimental antineoplastic compounds used at a 0.5 μg/mL concentration. * P ≤ 0.05; **P ≤ 0.01; ***P ≤ 0.001. PNC, polymeric nanocarrier; Dox, doxorubicin (positive control)

Presence of DNA in comet tail of rat glioma С6 cells after treatment for 6 h with (a ) control (untreated cells), Les-3288 (b ), Les-3288 + PNC (c ), Les-3833 (d ) Les-3833 + PNC (e ), PNC (f ), and doxorubicin (g ), used at a 0.5 μg/mL concentration

The results were evaluated using the mean value of the TailDNA%. The obtained data show that incubation of С6 rat glioblastoma cells with substance Les-3288, Les-3288+PNC, Les-3833, and PNC (all at concentration of 0.5 μg/mL) during 3 h (Fig. 13) does not lead to significant DNA damage (TailDNA% of 4.157 ± 0.682; TailDNA% of 3.530 ± 1,012, 8.807 ± 0.878; 3.298 ± 0.514, respectively) compared with control (TailDNA% =3.638 ± 0.406), but cell treatment with the Les-3833+PNC complex (TailDNA% =19.53 ± 1.48) causes more significant damage of DNA than the free form of Les-3833. An increase in the incubation time up to 6 h (Fig. 14) in all cases leads to greater damage to the DNA. Again, the level of TailDNA% detected from the action of complexes of both derivatives with the PNC was less than the level of that indicator for the action of these derivatives used in free form.

DNA damage evaluated using the % of DNA in comet tail of C6 rat glioma cells treated with experimental antineoplastic compounds during 3 h at a concentration of 0.5 μg/mL. * P ≤ 0.05; **P ≤ 0.01; ***P ≤ 0.001. PNC, polymeric nanocarrier; Dox, doxorubicin (positive control)

DNA damage evaluated using the % of DNA in comet tail of C6 rat glioma cells treated with experimental antineoplastic compounds during 6 h at a concentration of 0.5 μg/mL. * P ≤ 0.05; **P ≤ 0.01; ***P ≤ 0.001. PNC, polymeric nanocarrier; Dox, doxorubicin (positive control)

We also used an alternative, five-category classification system to classify DNA migration and calculated the DI. Table 2 summarizes the percentages of rat glioma C6 cells for each level of genotoxicity during 3 h of treatment. In the control (untreated cells), higher percentages of cells in levels 0 (81.3%) and 1 (18.6%) were detected compared to these levels in Les-3288 and PNC-treated cells. Complexation of Les-3288 with the PNC did not lead to a big change in the distribution pattern of the DNA comets. In contrast, Les-3833-treated cells showed a lower percentage of cells in 0 level (38.6%) and a higher percentage of cells in level 1 (60.0%), while Les-3833 + PNC-treated cells demonstrated a significantly lower percentage of cells in level 0 (8.0%) and much higher percentages of cells with levels 1 (76.0%), 2 (13.3%), and 3 (2.6%). The integrative indicator of DNA damage (DI) in the case of application of both Les-3288 and its complex with the PNC did not differ significantly from that for control or using free PNC, while the DI from using both Les-3833 and its complex with the PNC was even higher than the DI from using Dox.

During this time interval, Les-3833 + PNC-treated cells demonstrated a higher percentage of cells with level 4 (5.3%) DNA damage than cells treated with Les-3288 and the other experimental compounds, but the percentages of cells in levels 2 and 3 were lower (16.0% and 12.0%, respectively) than those from treatment with other compounds (Table 2). Table 3 summarizes the percentages of rat glioma C6 cells with DNA damage after 6 h of treatment. In general, a tendency for the appearance of DNA comets of higher classes was detected when complexes of Les-3833 and Les-3288 were used, compared with a spectrum of DNA comet classes induced by free forms of these agents (Table 3). However, the integrative indicator of DNA damage (DI) calculated for the action of complexes of Les-3833 and Les-3288 was found to be lower than such an indicator for the action of free forms of these agents. A possible explanation could be a very high DI level at 6 h action of studied agents that is even higher than such indicator found for the action of Dox (Table 3). Thus, we observed time dependence of DNA damage caused by complexes of Les-3833 and Les-3288:at 3 h of treatment, there was an increase of the DI in the case of action of Les-3833 complexes, compared to the action of the free form of Les-3833; however, at 6 h of treatment, there was a decrease in DNA damage for the action of complexes of both Les-3833 and Les-3288, compared to such damage observed for the action of the free forms of these agents. There was no significant time dependence for the action of the PNC, while a significant time-dependent (from 3 to 6 h) increase in the DI was observed for the action of Dox (from 41.2 + 0.40 to 185.2 + 0.23).

DNA Intercalation by 4-Thiazolidinone Derivatives—Les-3288 and Les-3833

Les-3288 and Les-3833 compounds demonstrated a certain capability for intercalating DNA molecules with approximately 15% and 10%, respectively, of replacement of methyl green dye. EtBr, a well-known DNA intercalating agent, was used as a positive control, and it was shown to replace the methyl green dye much more efficiently (70%) (Fig. 15). Thus, Les-3288 and Les-3833 are not capable of effectively intercalating in between two complementary base pairs in double-stranded DNA.

Replacement of methyl green dye intercalated into the DNA of salmon sperm by Les-3288 and Les-3833 compounds (1.0 μg/mL) and ethidium bromide (EtBr) used as a positive control

Обсуждение

There are two major problems that impede increasing the efficiency of treatment for cancer patients:(1) non-addressed actions of many anticancer drugs that lead to general toxicity and severe negative side effects due to damage of normal tissues and organs; (2) rapid (6–12 months) development of resistance of tumor cells to applied anticancer drugs that leads to a loss of efficacy of drug action. In addition, there is a third, technical problem of poor water solubility of many anticancer drugs. However, binding these drugs with specific carriers of the nanoscale size can help to solve the solubility problem.

In this study, we addressed the first and third of the above-mentioned problems by (a) selecting novel synthetic substances (4-thiazolidinone derivatives:Les-3288 and Les-3833) that possess both high anticancer activity and less general toxicity in tumor-bearing animals [7, 8, 23] and (b) applying a novel drug delivery platform that provides stable water-based forms of the complexes of the water-insoluble 4-thiazolidinone derivatives with a PEGylated polymer.

The 4-thiazolidinone derivatives—Les-3288 and Les-3833—are heterocyclic compounds with molecular mass of 400–600 Da. These and other related derivatives were synthesized at Lviv National Medical University (Ukraine), and most of them have been tested under the Developmental Therapeutic Program at the National Cancer Institute in Bethesda, MA, (USA) [35,36,37,38]. Based on these evaluations of their antineoplastic activity, the most promising substances were selected for further study of the mechanisms of their cytotoxic action and anticancer effects [25]. Les-3833 demonstrated high toxicity towards B16F10, WM793, and SK-Mel-28 melanoma cells, and against human lung A549, breast MCF-7, colon HCT116, and ovarian SKOV3 cancer cells and leukemia cells (L1210, Jurkat, HL-60 lines) [23, 25, 39]. Les-3288 and Les-3833 showed high toxicity against mammalian glioma cells (C6, U251, U373 lines) [23, 24].

Earlier, we found that Les-3288 and Les-3833 were the most toxic among the other studied 4-thiazolidinone derivatives towards rat glioma C6 cells and human glioblastoma U251 cells [23, 24], although their application for cell treatment was very complicated due to their absolute insolubility in water. Only using DMSO with additional heating was effective for preparing a soluble form of the derivatives (see the “Materials and Methods” section). Thus, it was reasonable to search for a way of improving the delivery of these derivatives to target cells, and we used a synthetic PNC to accomplish this task. The complexation of the studied derivatives of 4-thiazolidinone with the applied PNC also enhanced the effectiveness of their antineoplastic action. The mechanisms of the pro-apoptotic action of these compounds were demonstrated using western blot and FACS analyses [23, 24]. It should be noted that in healthy experimental animals, Les-3288 and Les-3833 produce much fewer negative side effects such as cardiotoxicity [40], hepatotoxicity [8], and nephrotoxicity [7] than the widely used anticancer chemotherapeutic agent Dox.

In a previous study, we showed that Les-3288 did not induce ROS production during its pro-apoptotic action in vitro and effects in experimental laboratory animals [23], while the action of Les-3833 led to such production; however, it was less than that of Dox. ROS are considered to be the main effectors of negative side effects of anticancer drugs, particularly Dox [41, 42]. Thus, the Les-3288 and Les-3833 compounds could be prospective anticancer drugs because they possess antitumor activity, but do not demonstrate general toxicity at the level characteristic for effective anticancer medicines such as Dox.

A great impediment to promoting Les-3288 and Les-3833 as anticancer drugs is their poor water solubility. This problem also exists for other anticancer medicines, such as taxols [2, 4]. For paclitaxel, this problem was solved by using a special oil for preparing the medicinal formulation [2, 4, 43]. However, specific delivery platforms are considered to be more promising for creating “smart” drugs that possess effective action in the organism [3, 13]. Specific functional polymer surfactants with block, comb-like, and block/branched architectures, including PEG-containing ones, as well as derived water forms have been developed and proposed for application as carriers for the delivery of Dox [26, 27] and the metal chemotherapeutic agent KP-1019 [10] at the Department of Organic Chemistry of Lviv Polytechnic National University.

Since the 4-thiazolidinone derivatives are water-insoluble compounds, DMSO was used to prepare their water-soluble forms. To avoid the negative consequences of using a toxic solvent like DMSO, we complexed these derivatives with the above-noted PNC. Highly dispersed and stable nanoscale water dispersions of these substances were obtained and applied for treatment of rat glioma C6 cells.

The use of complexes of 4-thiazolidinone derivatives with the PNC led to reduced general toxicity of these compounds in experimental animals. Earlier, we found that when experimental antitumor agents (Les-3288, Les-3833, Les-3882) were applied in a complex with a synthetic polymeric carrier, their action was accompanied by much smaller changes in the biochemical parameters in blood serum that are characteristic for cardiotoxicity [40], hepatotoxicity [8], and nephrotoxicity [7], compared to those for Dox. Thus, complexation of these antitumor agents with the PNC and their application in the form of water-soluble stable delivery systems reduces their toxic effects in experimental animals, compared with the action of these substances in a free form [44]. Several systems for paclitaxel delivery have been proposed including polymeric nanoparticles, lipid-based formulations, polymer conjugates, inorganic nanoparticles, carbon nanotubes, nanocrystals, and cyclodextrin nanoparticles [43].

Thus, complexation of Les-3288 with the PNC significantly increased the pro-apoptotic activity of this experimental drug, thereby allowing us to advance it to pre-clinical studies on animal tumor models. Complexation of Les-3833 with the same type of nanocarrier was less efficient, and thus another type of polymer should be used.

The developed water-based forms of the complexes, as well as the free derivatives, were applied for treatment of rat glioma C6 cells. It was found that these water-based forms of the complexes of the PNC with the 4-thiazolidinone derivatives—Les-3288 and Les-3833—enhanced the pro-apoptotic action of these compounds. In another study, we demonstrated that the induction of apoptosis by Les-3288 was not accompanied by ROS induction, opposite to the action of Dox and Les-3833 [23]. Thus, high antitumor activity of Les-3288 together with its low general toxicity when targeting the malignancy in NK/Ly lymphoma-bearing mice suggest great potential for this experimental anticancer compound. The presented data also predict the potential usefulness of Les-3288 and Les-3833 compounds complexed with the PNC for glioma treatment.

Cell division, differentiation, and death are principal physiological processes that regulate tissue homeostasis in multicellular organisms. A disruption of genomic integrity and impaired regulation of cell death may both lead to uncontrolled cell growth. A compromised cell death process can also promote genomic instability. It is becoming clear that dysregulation of the cell cycle and cell death processes plays a pivotal role in the development of major disorders such as cancer, cardiovascular disease, infection, inflammation, and neurodegenerative diseases [45].

We have found that some of the 4-thiazolidinone derivatives, namely, Les-3288 and Les-3833, were even more effective than Dox in the induction of apoptosis in rat C6 glioma and human U251 glioblastoma cells in vitro [23, 24]. It should be noted that brain tumors belong to malignancies that are the most resistant to applied chemotherapies, and survival rates in patients with these tumors are extremely low [44].

It has been shown that the complexation with this PNC enhanced the pro-apoptotic action of 4-thiazolidinone derivatives (Les-3288 and Les-3833) [44]. In another study [23], we demonstrated that the induction of apoptosis by Les-3288 was not accompanied by ROS induction, opposite to the action of Dox and partially opposite to that of Les-3833. These data could explain the lower general toxicity of Les-3288 compared with that of Dox [23, 24].

The results of FACS analysis are in agreement with the suggestion that an enhancement of the pro-apoptotic action of the studied 4-thiazolidinone derivatives is due to their complexation with a novel PNC. Such complexation of Les-3288 and Les-3833 increased the ratio of pre-G1 cells in the population of treated rat glioma C6 cells, decreased the ratio of G1 cells, and increased the action of G2/M cells. These data suggest an enhancement of both cytotoxic action (apoptosis) and cytostatic action (block in G2/M phase of cell cycle) of the studied derivatives complexed with the PNC. In general, the apoptosis mechanism of glioma cell killing by the Les-3288 + PNC complex and the Les-3833 + PNC complex was demonstrated by the results of FACS analysis of the appearance of Annexin V single-positive rat glioma C6 cells.

Involvement of the apoptosis mechanisms in the action of the studied 4-thiazolidinone derivatives was also confirmed by the results of the DNA comet assay. It was found that the complexation of Les-3833 with the PNC led to a decrease (compared to free Les-3833) in the ratio of rat glioma C6 cells in “0” DNA comets and sіmultaneous increase in the ratio of “1,” “2,” and “3” comets (3-h treatment of cells). At 6 h of treatment by the Les-3833+PNC complex, there was a large increase (compared to free Les-3833) in the ratio of “1” comets, an increase in the ratio of cells with the most expressed DNA damage (“4” comets), and a decrease in the ratios of “2” and “3” comets. It should be noted that the DNA damaging effects of Les-3288 and Les-3833 measured at 6 h was higher than such effects of complexes of these derivatives with the PNC (see Table 3). A possible explanation here could be a very high level of the DI at 6 h action of studied agents that is even higher than the level of that indicator found for the action of Dox (Table 3). There was no time dependence in the action of the PNC, while a significant time-dependent (from 3 to 6 h) increase (from 41.2 + 0.40 to 185.2 + 0.23) in the DI was detected for the action of Dox.

Thus, a complexation of 4-thiazolidinone derivatives—Les-3288 and Les-3833—with a PNC enhanced the cytotoxic effect of these compounds towards rat glioma C6 cells, and that effect was achieved through the apoptosis mechanisms including DNA damage observed as DNA comets in the electrophoresed cells.

We used the DNA intercalation test to investigate the direct targeting of DNA by the 4-thiazolidinone derivatives and revealed only weak replacement of methyl green dye (15% and 10% replacement for Les-3288 and Les-3833, respectively) that intercalated into the DNA of salmon sperm, compared to the replacement by EtBr, used as a positive control (70%).

Thus, conducting the cytotoxicity experiments in vitro with the 4-thiazolidinone derivatives—Les-3288 and Les-3833—was more convenient due to using the water-based forms of the 4-thiazolidinone derivatives—Les-3288 and Les-3833—complexed with the novel PNC. Besides, we have demonstrated that the novel synthetic 4-thiazolidinone derivatives (Les-3833 and Les-3288) possessed treatment effects i n vivo towards NK/Ly lymphoma grafted to BALB/C mice, and those effects were comparable to such effects of Dox. At the same time, the action of these derivatives led to much fewer negative side effects measured as changes in the number of erythrocytes, neutrophils, and lymphocytes in the animals’ blood and the activity of aspartate and alanine aminotransferases in their blood serum, compared with the action of Dox.

Conclusions

The complexation of Les-3288 and Les-3833 with the PEG-containing PNC enhanced their cytotoxic action towards rat glioma C6 cells. The cytotoxic action was realized by apoptotic mechanisms and confirmed by FACS analysis as the presence of the pre-G1 fraction in the rat glioma C6 cells and of Annexin V-single-positive cells. DNA comet analysis revealed single-strand brakes in the nuclear DNA of treated glioma C6 cells that probably was not caused by the intercalation of the studied compounds into the DNA molecule. The Les-3288 and Les-3833 stabilized by the amphiphilic PEG-containing PNC resulted in the water-based forms and provided enhancement of their antitumor effect in vitro in comparison with the free form of the drugs.

Сокращения

DMSO:

Dimethylsulfoxide

Dox:

Доксорубицин

EtBr:

Ethidium bromide

FACS:

Fluorescence-activated cell sorting

ROS:

Reactive oxygen species

PBS:

Физиологический раствор с фосфатным буфером

PEG:

Полиэтиленгликоль

PI:

Иодид пропидия

PNC:

Polymeric nanocarrier

SEM:

Сканирующая электронная микроскопия

ТЕМ:

Просвечивающая электронная микроскопия

VEP:

2-Tret-butylperoxy-2-methyl-5-hexen-3-in