Новый контрастный агент на основе магнитных наночастиц для определения холестерина как биомаркера болезни Альцгеймера

Фон

Несколько исследований показали, что присутствие необходимого количества холестерина (СНО) в плазматической мембране нейронов играет ключевую роль в защите нервных клеток от токсичности β-амилоидного белка при болезни Альцгеймера (БА), противодействуя чрезмерной выработке этого белка. [1,2,3]; нейроны, обогащенные СНО, более устойчивы к окислительному стрессу и токсичности β-амилоидного белка [4, 5].

Таким образом, можно предположить, что количество СНО, присутствующее в плазматической мембране нейронов, а не только его уровни в плазме, может играть роль в патогенезе нейродегенеративных заболеваний [6]. Фактически, экспериментальные данные подтверждают идею о том, что оптимальное количество СНО в клеточных мембранах необходимо для создания защитного барьера от токсичных агентов. Уменьшение количества клеточного СНО в плазматической мембране изменяет этот защитный барьер, снижая защиту от токсических агентов, включая β-амилоидный белок [7]. Интересно, что нейроны коры головного мозга трансгенных мышей AD содержат меньше СНО в плазматической мембране, чем нейроны мышей дикого типа [8].

Mori et al. [9] показали, что как у людей, так и у мышей с трансгенным белком-предшественником амилоида (APP) СНО аномально накапливается в зрелых амилоидных бляшках, но не в диффузных или незрелых бляшках, предполагая, что СНО может играть роль в образовании и прогрессировании сенильных бляшек. Другие последующие исследования показали, что СНО и аполипопротеин E присутствовали в сердцевине фибриллярных бляшек, но не в диффузных бляшках на ранней стадии. На более поздних стадиях заболевания описано большее количество фибриллярных бляшек, иммунопозитивных по холестериноксидазе [10]. Количество свободного СНО на сенильную бляшку, определенное с помощью масс-спектрометрии, было сходным с нагрузкой β-амилоидным белком [8]. Это взаимное увеличение концентрации СНО и старческих бляшек при БА может указывать на новый патогенетический механизм заболевания [11]. Более того, в тканях мозга пациентов с БА липидные отложения, локализующиеся вместе с фибриллярными старческими бляшками, были описаны с использованием антистоксова комбинационного рассеяния и 2-фотонной флуоресцентной микроскопии в образцах, окрашенных тиофлавином-S [10]. Можно наблюдать две морфологии липидов:ламеллярные структуры и сливающиеся макроагрегаты субмикронных размеров. Поскольку липидный состав / организация варьируется в разных бляшках, есть четкие доказательства тесного взаимодействия амилоида и липидов в фибриллярных сенильных бляшках, что делает их более динамичными, чем считалось ранее [12].

Кроме того, для выявления биомаркеров БА на ранних стадиях заболевания в нескольких исследованиях было предложено использовать функционализированные наночастицы магнитного оксида железа (МНЧ) в качестве специфических контрастных агентов для магнитно-резонансной томографии (МРТ) старческих бляшек [13,14, 15] и белка ферритина [16]. Гипоинтенсивный эффект, проявляемый этими частицами в последовательностях, взвешенных по Т2 и Т2 *, обеспечивает больший контраст в изображениях МРТ. Таким образом, использование МНЧ в качестве контрастного вещества для МРТ является многообещающим методом ранней диагностики БА.

В настоящей работе представлена ​​гипотеза использования нового контраста на основе биофункциональных МНЧ для обнаружения с помощью МРТ аномальных скоплений СНО в сенильных бляшках, что может быть использовано в качестве потенциального биомаркера БА.

В настоящей работе впервые, насколько нам известно, разработан новый контрастный агент на основе биофункциональных МНЧ для обнаружения с помощью МРТ аномальных скоплений СНО в сенильных бляшках, который может быть использован в качестве потенциального биомаркера БА. .

Гипотеза

Из-за высокой заболеваемости БА среди мирового населения на протяжении многих лет [17] и связанных с этим затрат на патологию в медицинском и социальном плане для стран [17], крайне необходимо разработать неинвазивные инструменты, позволяющие обнаруживать ранние биомаркеры для диагностика и развитие болезни.

В рамках методов ранней диагностики особенно полезной становится разработка контрастных веществ для молекулярной визуализации (МИ). MI сочетает в себе традиционные технологии визуализации с молекулярными зондами, которые предназначены для выявления аспектов биохимии и клеточной биологии, лежащих в основе прогрессирования заболевания и ответа на лечение [18,19,20].

Мы предлагаем синтез контрастного вещества на основе МНЧ, покрытых полиэтиленгликолем (ПЭГ) и функционализированных стрептавидином (рис. 1а), чтобы обеспечить направленное связывание биотинилированного антитела, которое специфически распознает СНО, присутствующее в сенильных бляшках (NANOCHOAD) ( Рис. 1б). Антитело также распознает СНО, присутствующее в клеточной плазматической мембране, тем самым обнаруживая уменьшение СНО в плазматических мембранах нейронов. МНЧ будут покрыты цепями ПЭГ для улучшения коллоидной стабильности наноплатформы, облегчая ее распространение в кровотоке и прохождение через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) [21].

Принципиальная схема разработанной наноплатформы и механизм ее действия. а структура MNP и функционализация антителом против CHO (NANOCHOAD), b стратегии проникновения наноплатформы через BBB, c Механизм прохождения через BBB NANOCHOAD. г наноконъюгат анти-CHO-MNP, нацеленный на отложения CHO на амилоидных бляшках

ГЭБ представляет собой один из наиболее исключительных биологических барьеров, встречающихся при лечении и диагностике неврологических заболеваний, ограничивая доступ большинства диагностических и терапевтических средств к мозгу системным путем [22, 23]. Таким образом, задача диагностики и лечения большого числа заболеваний головного мозга состоит в том, чтобы преодолеть сложность доставки терапевтических и контрастных агентов через ГЭБ к конкретным областям мозга. К счастью, эндотелиальные клетки капилляров головного мозга обнаруживают некоторые специфические рецепторно-опосредованные транспортные механизмы. Документально подтверждено, что большое количество рецепторов трансферрина экспрессируется эндотелиальными клетками капилляров головного мозга, участвующими в рецепторно-опосредованном трансцитозе через ГЭБ [24].

Поэтому, чтобы решить проблему прохождения контрастного вещества через ГЭБ, мы предлагаем три альтернативные стратегии:(i) конъюгировать анти-СНО-МНЧ с трансферрином [25], что позволило бы ему пройти через ГЭБ; (ii) интраназальное введение конъюгата анти-СНО-МНЧ. Неинвазивный интраназальный путь в обход ГЭБ является альтернативным путем доставки наноконъюгатов в мозг [26, 27]; и (iii) приложение внешних магнитных полей для облегчения прохождения наноконъюгатом BBB (рис. 2c). Этот новый метод доставки может доставлять клинически значимую дозу в мозг (обонятельная область, кора, гиппокамп ...) через ГЭБ [28,29,30] (рис. 1c). Кроме того, прохождению наноконъюгата через ГЭБ также будет способствовать как использование МНЧ, покрытых ПЭГ, так и ухудшение ГЭБ из-за самой патологии. Наноконъюгат будет специфически распознавать аномальные отложения СНО в сенильных бляшках по сродству антиген-антитело (рис. 1c, d). Накопление наночастиц в патологических структурах паренхимы головного мозга в виде сенильных бляшек может указывать на изменения локализации СНО в паренхиме мозга при БА. Следовательно, присутствие анти-СНО-МНЧ, связанных со старческими бляшками, будет показывать гипоинтенсивные сигналы на Т2 * -взвешенной МРТ, позволяя обнаруживать СНО, связанные с другими установленными признаками БА, такими как сенильные бляшки, и, таким образом, проводить МРТ. СНО мозга может стать новым биомаркером болезни. Кроме того, ожидаются изменения на МРТ из-за уменьшения плазматической мембраны СНО.

План эксперимента для проверки гипотезы. Во-первых, in vitro ( a ):определение биосовместимости синтезированного наноконъюгата. Тест ex vivo ( b ):тестирование специфичности наноконъюгата анти-CHO-MNP путем инкубации наноплатформы на фиксированных срезах мозга трансгенных мышей 5XFAD. Исследования in vivo ( c ):наноплатформа будет вводиться внутривенно или альтернативными путями в виде интраназальной доставки / приложения внешнего магнитного поля, и ее эффективность (нацеливание) будет оцениваться с помощью МРТ

Удаление контрастного вещества из паренхимы головного мозга может быть достигнуто за счет интернализации MNPs микроглиальными клетками и их последующего лизосомного процессинга, как показано в предыдущих исследованиях [16, 31, 32]. МНЧ удаляются обычными путями, используемыми для метаболизма эндогенного железа. Тем не менее, пути выведения контрастных веществ в зависимости от их размера и поверхностного заряда, а также их потенциальная токсичность будут определены в ходе разработки предлагаемой гипотезы, как подробно описано ниже.

Проверка гипотезы

Синтез и характеристика магнитных наночастиц

Синтез наночастиц оксида железа будет осуществляться с использованием метода контролируемого соосаждения путем смешивания иона двухвалентного железа (Fe2 +) и иона трехвалентного железа (Fe3 +) в щелочном растворе в соответствии с работой Predescu et al. [33]. МНЧ будут покрыты оболочкой из ПЭГ в соответствии с протоколом, ранее установленным Liu et al. [34].

Структура, морфология и магнетизм наночастиц железа, покрытых PEG, будут исследованы с помощью рентгеновской дифракции (XRD), сканирующей электронной микроскопии (SEM), просвечивающей электронной микроскопии (TEM), инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье (FTIR) и сверхпроводящее устройство квантовой интерференции (СКВИД) магнитометрия.

После характеризации синтезированного магнитного наноматериала он будет функционализирован (1) белком стрептавидином методом NHS / EDC. После этого он будет связан с биотинилированным антителом против СНО и (2) белком трансферрина. Конъюгация трансферрина будет осуществляться путем связывания карбоксильной группы, присутствующей на поверхности лиганда, и гидроксильной группы, присутствующей на покрытии PEG [35].

Тестирование in vitro

На первом этапе биосовместимость наноплатформы будет проверена in vitro (рис. 2а). Наноконъюгат будет добавлен к совместным культурам нейронов и астроцитов, а также к культурам эндотелиальных клеток [36], чтобы определить совместимость наноконъюгата с типичными клетками мозга. Если цитосовместимость функционализированных MNPs верна, эффективность системы будет проверена на модели заболевания ex vivo (рис. 2b). Выбранная модель представляет собой двойную трансгенную мышь APP / (пресенилин-1) PS1, которая коэкспрессирует пять семейных мутаций AD (5XFAD) и демонстрирует патологию амилоидных бляшек, аналогичную патологии, обнаруженной при AD [37].

Накопление CHO вокруг сенильных бляшек в трансгенной модели 5XFAD будет оцениваться с помощью иммуногистохимии.

Если модель верна, после демонстрации накопления СНО в сенильных бляшках предлагается проверить специфичность синтезированного наноконъюгата. Для этого сначала будут получены фиксированные срезы мозга у трансгенных мышей 5XFAD, а затем на них будет испытано объединение наноконъюгата, инкубируя анти-CHO-MNP на фиксированных срезах мозга мышей 5XFAD. Специфичность наноконъюгата будет определяться путем оценки совместной локализации анти-СНО-МНЧ с отложениями СНО и старческими бляшками, присутствующими в срезах мозга 5XFAD, с выполнением соответствующих контролей. В случае, если не было обнаружено явных накоплений холестерина в 5XFAD, альтернативная шведская мутация на мышиной модели белка-предшественника амилоида (APP _sw ), модель БА у мышей, поскольку в этой модели в гиппокампе описано накопление СНО, явно связанного с амилоидными бляшками [9].

Тестирование in vivo

После того, как специфичность конъюгата будет продемонстрирована, будут выполнены анализы биосовместимости нанококъюгата in vivo. Наноплатформа будет вводиться внутривенно в различных дозах (от 25 до 100 мг / кг [38]) (рис. 2c), а подострая токсичность в ходе исследования будет анализироваться путем наблюдения за смертностью, свидетельствами атрофии. , скопление, воспаление или любые серьезные изменения поведения у мышей. Будет рассчитан весовой коэффициент каждого органа к телу. Почечная токсичность будет определяться уровнями азота мочевины и креатинина в крови. Уровни общего билирубина и щелочной фосфатазы в крови могут быть проверены как мера функции печени и желчи. Кроме того, будут определены уровни мочевой кислоты и гематологические исследования для оценки изменений уровней эритроцитов, лейкоцитов и гемоглобина. Наконец, для более детального поиска возможных токсических эффектов будет выполнено гистологическое исследование различных тканей (почки, печени, селезенки, головного мозга или легких) [39]. Местоположение функционализированных МНЧ в крови, моче и различных органах будет проанализировано через 24 часа, 72 часа, 1 неделю, 2 недели и 1 месяц после инъекции анти-СНО-МНЧ.

Как только соответствующая концентрация MNPs определена, наноплатформа будет введена контрольным мышам и мышам 5XFAD, и ее эффективность будет оценена с помощью МРТ (рис. 2c). Если антитело с наноплатформы не распознает антиген в системе in vivo, то МНЧ могут быть функционализированы с помощью фенилдиинового холестерина, соединения, которое в предыдущих исследованиях было обнаружено, способно связываться с скоплениями СНО in vivo [40]. . Биосовместимость этого наноконъюгата будет оцениваться, как описано выше для наноконъюгата MNP-CHO. Если внутривенный путь введения не эффективен при пересечении ГЭБ, предлагаются альтернативные пути введения, такие как интраназальная доставка или приложение внешних магнитных полей (рис. 2c).

Следствия гипотезы

Использование биофункциональных МНЧ для выявления БА in vivo с помощью МРТ широко продемонстрировано в многочисленных предыдущих исследованиях путем конъюгирования МНЧ с различными пептидами:Aβ 1-40 [41], Aβ1-30 [42], Aβ1-42 [15]. и антитела против Aβ-1-42 [43]. После внутривенного введения на животных моделях БА с помощью МРТ были обнаружены как сенильные бляшки, так и сосудистые амилоидные отложения (конгофильная ангиопатия). Однако эти наноконъюгаты токсичны сами по себе, поскольку используемые фрагменты амилоидного пептида являются нейротоксичными (Aβ1-40, Aβ 1-42). Кроме того, из-за своего размера они требуют одновременного введения соединений, которые облегчают их прохождение через ГЭБ.

NANOCHOAD будет работать как контрастное вещество, которое позволит одновременно локализовать два биомаркера, специфичных для AD:амилоидные бляшки и потерю CHO в белом веществе мозга [44], избегая токсичности. Из-за присутствия в его структуре ПЭГ он также может облегчить прохождение наноплатформы через ГЭБ [43].

Как видно, большинство исследований этих характеристик ориентировано на обнаружение сенильных бляшек, одного из основных биомаркеров БА, но не единственного. Недавно была опубликована работа, в которой отложения ферритина и, следовательно, железа были обнаружены с помощью наноконъюгатов на основе МНЧ [16]. Однако этот контрастный агент для обнаружения ферритина имеет низкую чувствительность, поскольку он не обнаруживается с помощью МРТ, а только путем количественной оценки в определенных участках мозга. Потеря белого вещества в головном мозге - это массовое явление [44], не локализованное; поэтому считается, что предлагаемый контрастный агент может быть более чувствительным для раннего обнаружения биомаркеров БА. Необходимо способствовать разработке новых контрастных агентов, которые могут эффективно обнаруживать другие биомаркеры, связанные с БА, на ранних стадиях заболевания.

С другой стороны, состав предлагаемого наноконъюгата может решить два основных препятствия на пути преодоления эффективности контрастных агентов, вводимых внутривенно:стабильность коллоида в кровотоке и способность успешно пересекать ГЭБ для достижения цели. Функционализация наноплатформы цепями ПЭГ обеспечит коллоидную стабильность наноконъюгатов в кровотоке [15, 21]. С другой стороны, в качестве стратегии пересечения ГЭБ конъюгация МНЧ с пептидным трансферрином [25] будет способствовать распознаванию трансферрина специфическими рецепторами, расположенными в ГЭБ, позволяя наноконъюгату пересекать ГЭБ и связываться со своей конечной мишенью. . Этот факт в сочетании с уменьшенным размером наносистемы и изменением ГЭБ у пациентов с БА может облегчить прохождение наноконъюгата через ГЭБ.

В связи с новизной в конструкции описанного наноконъюгата необходимо будет глубоко изучить биосовместимость и вводимую дозу наноплатформы, особенно для определения путей выведения контрастного вещества из организма.

Сокращения

AD:

Болезнь Альцгеймера

BBB:

Гематоэнцефалический барьер

CHO:

Холестерин

MI:

Молекулярная визуализация

MNP:

Магнитные наночастицы оксида железа

МРТ:

Магнитно-резонансная томография

PEG:

Полиэтиленгликоль