Беспроводной магнетоэластический нанобиосенсор обеспечивает ультрачувствительное детектирование атразина

Аннотация

Это исследование представляет первый беспроводной магнетоэластический (ME) нанобиосенсор, использующий ME материалы и золотые наночастицы (AuNPs) для детектирования атразина с беспрецедентной чувствительностью через конкурентный иммуноанализ. При воздействии переменного магнитного поля ME подложка вибрирует на резонансной частоте, которая сдвигается пропорционально массовой нагрузке на поверхности. Покрытие ME ленты AuNPs улучшает биосовместимость, стабильность и чувствительность сигнала, в то время как белок А-опосредованная ориентация антител к атразину на слое AuNPs максимизирует эффективность связывания антигена. Атомно-силовая микроскопия подтвердила успешную иммобилизацию антител. Введение атразин-альбуминового конъюгата (Atr-BSA) усилило конкурентное связывание, давая линейный логарифмический ответ в диапазоне 1 нг/мл – 100 мкг/мл, с чувствительностью 3,43 Гц·мл/мкг и пределом детектирования 1 нг/мл — значительно ниже порога US EPA. Сенсор показал высокую специфичность, стабильность и пригодность для быстрого селективного экологического мониторинга.

Введение

Рост промышленной и сельскохозяйственной деятельности ввел множество загрязнителей в экосистемы, вызывая глобальную озабоченность их экологическими и медицинскими воздействиями. Гербициды, в частности, сохраняются в воде и почве годами, представляя значительные риски. Атразин (2-хлор-4-этиламино-6-изопропиламино-1,3,5-триазин) — наиболее широко используемый гербицид для борьбы с листочковыми сорняками и травами по всему миру.

Хотя атразин эффективно подавляет сорняки, он является мощным эндокринным дисруптором и связан с раком, пороками развития и повреждением органов у людей и животных. US EPA ограничивает атразин в питьевой воде 3 мкг/л (уровень пожизненного здоровья). Точное детектирование низких концентраций поэтому критично.

Конвенциональные аналитические методы (LC-MS, HPLC, GC-MS) дают высокую точность, но страдают от высокой стоимости, крупногабаритного оборудования и длительного времени обработки. Платформа магнетоэластического (ME) сенсора, основанная на аморфных ферромагнитных сплавах (например, Metglas 2826 MB), предлагает дешевый, высокочувствительный и миниатюрный альтернативу. ME сенсор вибрирует на резонансной частоте, определяемой размерами и механическими свойствами материала, и любая добавленная масса вызывает измеримый сдвиг частоты, позволяя масс-сенсинг для физических, химических и биологических аналітов. Доселе ни один ME сенсор не сообщался для детектирования атразина.

Здесь мы представляем беспроводной ME нанобиосенсор, интегрирующий ME подложку с AuNPs и белок А-ориентированными антителами к атразину для достижения ppb-уровня детектирования. Система использует прямой конкурентный иммуноанализ, где Atr-BSA конкурирует с свободным атразином за связывание антител, усиливая массовую нагрузку и сдвиг частоты. Оптимизированный сенсор дает линейный ответ в широком концентрационном диапазоне и соответствует нормативным требованиям.

Материалы и методы

Материалы

Антитела к атразину, Atr-BSA, атразин, белок А — EastCoast Bio (Мейн, США). Симазин, промерин, DDT — Chengdu Huaxia Chemical Reagent Co., Ltd. Цистеамин, EDC, NHS, BSA, PBS (pH 7,4) — Sigma-Aldrich.

Фабрикация ME нанобиосенсора

Подготовка ME наносенсорной платформы

ME ленты (Metglas 2826 MB) резали 5 мм × 1 мм × 0,028 мм, ультразвуковые очищали в ацетоне и этаноле, сушили азотом (Рис. 1a). 100-нм хромовый закладочный слой напыляли для адгезии, затем AuNPs на обе стороны. SEM подтвердил сферическое распределение AuNPs. Ленты отжигали при 200 °C 2 ч для снятия напряжений и усиления адгезии AuNPs, давая готовую платформу (Рис. 1b).

Иммобилизация антител к атразину

AuNPs-покрытые ленты промывали ацетоном, изопропанолом, деионизированной водой, этанолом, сушили. Погружали в 10 мМ цистеамин 12 ч для самосборного монослоя (SAM) (Рис. 1c). Белок А (1 мг/мл) активировали EDC/NHS (4 мг/мл каждый) 30 мин, инкубировали на SAM 30 мин при 37 °C, промывали PBS (Рис. 1d). Антитела к атразину добавляли 50 мин, промывали, блокировали 0,5% BSA 30 мин для снижения неспецифической адсорбции (Рис. 1e-f). Готовые ME нанобиосенсоры готовы к анализу (Рис. 1g).

Измерение сигнала

Резонансная частота измеряли катушкой приема вокруг флакона, возбуждаемой векторным анализатором сетей (AV3620A). Статическое магнитное поле от стержневого магнита усиливало резонанс. Сенсоры беспроводно помещали в 30 мкл тестовых образцов в PBS (pH 7,4) при 25 ± 2 °C. Параметр S₁₁ записывали каждые 5 мин для отслеживания сдвига частоты.

Результаты и обсуждение

Характеризация морфологии поверхности нанобиосенсора

AFM визуализация подтвердила успешную иммобилизацию антител. AuNPs поверхность показывала вариацию высоты 13,4 нм, увеличивавшуюся до 28,4 нм после присоединения антител — согласуясь с ~15 нм диаметром IgG молекул (Рис. 3a-b).

Оптимизация концентрации антител к атразину

Ответ сенсора пиковый при 50 мкг/мл загрузки антител. Высшие концентрации (75 мкг/мл) вызывали стерическое препятствие, снижая чувствительность (Рис. 4). 50 мкг/мл выбрали как оптимальное.

Оптимизация концентрации Atr-BSA

Конкурентное связывание максимизировалось при 40 мкг/мл Atr-BSA (Рис. 5). Эта концентрация давала наибольший сдвиг частоты и использовалась в последующих анализах.

Детектирование атразина

Реальный мониторинг показал четкий обратнопропорциональный сдвиг резонансной частоты с ростом концентрации атразина (0–100 мкг/мл). Сигнал плато после ~50 мин (Рис. 6). Неспецифическая адсорбция пренебрежима, как демонстрировал пустой контроль (<48 Гц сдвиг).

Калибровочная кривая (Рис. 7) линейна с логарифмом концентрации (Δf = 54,717 log C_Atrazine – 442,45, R² = 0,971). Чувствительность 3,43 Гц·мл/мкг, LOD 1 нг/мл — далеко ниже EPA лимита. Прямой конкурентный иммуноанализ с Atr-BSA усилением дает быстрый, одноразовый беспроводной детект.

Специфичность ME нанобиосенсора

Тестирование с 100 мкг/мл промерина, симазина, DDT показало минимальную перекрестную реактивность; сенсор дискриминировал атразин от структурно похожих триазинов и органохлорных инсектицидов (Рис. 8). Подтверждает высокую специфичность.

Стабильность ME нанобиосенсора

Шесть идентичных сенсоров при 4 °C тестировали с 10 нг/мл атразина через день в течение 6 дней. Относительное стандартное отклонение 1,8%, указывая на отличную долговременную стабильность (Рис. 9).

Заключение

Мы спроектировали беспроводной ME нанобиосенсор, обеспечивающий реальное время, высокочувствительное детектирование атразина через белок А-ориентированную компоновку антител и Atr-BSA-опосредованное усиление сигнала. При 50 мкг/мл антител и 40 мкг/мл Atr-BSA сенсор достигает линейного диапазона 1 нг/мл – 100 мкг/мл, чувствительности 3,43 Гц·мл/мкг и LOD 1 нг/мл — значительно ниже нормативных лимитов. AFM валидация подтверждает ориентированную иммобилизацию антител, платформа показывает надежную специфичность и стабильность. Низкая стоимость, одноразовость и беспроводная природа сенсора делают его убедительным инструментом для мониторинга атразина и других экологических загрязнителей в воде.