Новый магнитоупругий нанобиосенсор для высокочувствительного обнаружения атразина

Введение

С быстрым развитием промышленности и сельского хозяйства все больше и больше загрязнителей окружающей среды выбрасывалось в экологическую среду [1], что вызвало повсеместное беспокойство по поводу соответствующих исследований [2, 3]. В последние годы гербициды используются во все больших количествах для улучшения качества и урожайности на сельскохозяйственных полях, но многие гербициды могут оставаться активными в воде и почве в течение многих лет, вызывая серьезное загрязнение окружающей среды [4]. Загрязнение гербицидами привлекло значительное внимание из-за его экологического загрязнения воды или сельскохозяйственных продуктов [5]. Среди гербицидов атразин (2-хлор-4-этиламино-6-изопропиламино-1,3,5-триазин) наиболее широко используется для борьбы с широколистными растениями и травянистыми сорняками во всем мире [6].

Хотя атразин оказывает определенное ингибирующее действие на некоторые многолетние сорняки, будучи загрязнителем окружающей среды, он очень токсичен [7] и может представлять опасность для здоровья человека и других видов животных [8]. Длительное употребление высоких концентраций атразина может нанести вред здоровью животных или человека, например, рак, врожденные дефекты и повреждение сердца и печени [9, 10]. США, Европейский Союз и Япония включили атразин в список химикатов, нарушающих работу эндокринной системы [11]. В США Агентство по охране окружающей среды (EPA) допускает допустимый предел 3 мкг / л (рекомендуемый уровень здоровья) атразина в питьевой воде [12]. Таким образом, необходимо точно определять количество атразина в низких концентрациях.

Многие традиционные аналитические методы были разработаны для обнаружения атразина, в том числе ЖХ в сочетании с масс-спектрометрией (ЖХ-МС) [13], высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) [14] и газовой хроматографией в сочетании с масс-спектрометрией (ГХ-МС). ) [15], но эти методы также имеют некоторые ограничения, такие как высокая стоимость, необходимость в больших инструментах, плохая селективность и трудоемкость [16].

Магнитоупругий (МЭ) датчик, изготовленный из МЭ материала, как беспроводная массово-чувствительная платформа, получил широкое распространение для различных приложений из-за их важных преимуществ, таких как низкая стоимость, высокая чувствительность, меньший размер и простота использования [17, 18]. В настоящее время ME-датчики обычно изготавливаются из материалов из аморфных ферромагнитных сплавов, таких как Metglas 2826 MB (Fe ₄₀ Ни ₃₈ Пн ₄ В ₁₈ ) [19]. Под воздействием переменного и статического магнитного поля, приложенного извне, МЭ материал продольно колеблется на своей резонансной частоте [20], создавая плотность магнитного потока, которая может быть обнаружена с помощью беспроводной связи с помощью катушки датчика без каких-либо прямых физических соединений [21]. Согласно формуле. (1) [22], основная резонансная частота f ₀ зависит от длины материала L , плотность ρ , модуль упругости E , и коэффициент Пуассона v .

Небольшая дополнительная массовая нагрузка ∆m нанесенный на поверхность МЭ материала массой M ( ∆m ≪ M ) вызывает сдвиг резонансной частоты ( ∆f ), который задается формулой. (2) [23].

Основываясь на вышеупомянутых уникальных свойствах МЭ материала, резонансная частота МЭ материала уменьшается с увеличением дополнительной массовой нагрузки. Таким образом, благодаря их функционализации с помощью сенсорной пленки, МЭ-материалы были разработаны для физического, химического и биологического анализа, такого как определение напряжения / давления [24], температуры / влажности [25], углекислого газа [26], эндотоксин [27], Salmonella typhimurium / Bacillus anthracis споры [28] и Escherichia coli O157:H7 [29]. Однако, насколько нам известно, МЭ-материал не применялся для обнаружения атразина.

В этом исследовании, используя его превосходные свойства и преимущества, мы сначала предложили беспроводной МЭ нанобиосенсор, использующий МЭ материал в качестве подложки и наночастицы золота (AuNP) в качестве слоя покрытия, для обнаружения атразина на уровне частей на миллиард на основе прямого конкурентного иммуноанализа. процедуры. По сравнению с ковалентно-случайной иммобилизацией антител, стратегия ковалентно-ориентированного действия более эффективна для повышения чувствительности нанобиосенсора. Поскольку белок A представляет собой интересную альтернативу специфическому связыванию с Fc-областью иммуноглобулина антитела, его использовали для ориентированной иммобилизации антитела атразина [30], что дает наивысшую плотность иммобилизации, чтобы продемонстрировать лучшую эффективность связывания антигена и улучшить работу нанобиосенсора. [31]. Прямой конкурентный иммуноанализ атразина был построен путем ориентированной иммобилизации атразинового антитела к белку А, ковалентно модифицированного на поверхности ME материала, покрытого AuNP, с последующей конкурентной реакцией конъюгата атразин-альбумин (Atr-BSA) и атразина с антителом к ​​атразину. Атр-БСА усиливал ответные сигналы, что, в свою очередь, значительно увеличивало чувствительность нанобиосенсора. Эффективность МЭ нанобиосенсора была оценена и продемонстрирована успешная разработка нового МЭ нанобиосенсора для обнаружения следовых концентраций атразина.

Материалы и методы

Материалы

Антитело к атразину, конъюгированный антиген атразин-альбумин (Atr-BSA), атразин и протеин А были приобретены в EastCoast Bio (Мэн, США). Симазин, прометрин и дихлордифенилтрихлорэтан (ДДТ) были получены от Chengdu Huaxia Chemical Reagent Co., Ltd. Цистеамин, гидрохлорид 1-этил-3- (3-диметиламинопропил) карбодиимида (EDC), N -гидроксисульфосукцинимид (NHS), бычий сывороточный альбумин (BSA, 99%) и фосфатно-солевой буфер (буфер PBS, pH =7,4) были приобретены у Sigma-Aldrich Corporation (Сент-Луис, Миссури, США).

Производство нанобиосенсоров ME

Подготовка платформы наносенсора ME

Ленты из материала ME, состоящего из сплава Metglas 2826 (Fe ₄₀ Ни ₃₈ Пн ₄ В ₁₈ ) были приобретены у Honeywell Corporation (Морристаун, Нью-Джерси, США) и разрезаны на 5 мм × 1 мм × 0,028 мм с использованием станка для лазерной резки с компьютерным управлением. Для удаления органической пленки и мусора ленты ME очищали ультразвуком в ацетоне и этаноле каждую в течение 10 мин и промывали в деионизированной воде, а затем сушили в токе азота (рис. 1а). Слой наночастиц хрома толщиной ~ 100 нм был напылен на обе стороны поверхности МЭ-ленты для усиления адгезии между AuNP и поверхностью ленты. Затем обе стороны покрытой хромом поверхности ME-ленты были напылены AuNP для улучшения биосовместимости и защиты ленты от окисления и коррозии. Изображение, полученное с помощью сканирующего электронного микроскопа (СЭМ) на рис. 1, показало, что наночастицы AuNP, нанесенные на МЭ-ленту, имели сферический размер. AuNP и -SH могут легко образовывать связь Au-S. Помимо привлекательных преимуществ, таких как низкая цена, отсутствие коррозии, биосовместимость и нетоксичность [32], AuNP могут обеспечить превосходный интерфейс для химической модификации или модификации элементов биораспознавания [33, 34]. После этого МЭ-ленты отжигали в вакуумной печи при 200 ° C в течение 2 часов для снятия остаточных внутренних напряжений и улучшения адгезии слоя AuNP к МЭ-лентам. Затем платформы ME наносенсоров были закончены и готовы к иммобилизации антител к атразину (рис. 1b).

Схематическое изображение процедур функционализации МЭ нанобиосенсоров:( a ) голая лента ME; ( б ) покрытие AuNPs; ( c ) слой SAM; ( д ) иммобилизация протеина А; ( е ) модификация антитела; ( е ) Блокировка BSA; ( г ) атразин и Atr – BSA, конкурентно сочетающиеся с антителом; СЭМ-изображение поверхности наносенсора, покрытого AuNP

Иммобилизация антител к атразину

Платформы наносенсоров, покрытые AuNP, очищали ультразвуком с использованием ацетона, изопропанола, деионизированной воды и этанола, каждую в течение 5 мин, и сушили в токе азота. Затем платформы наносенсоров были погружены в раствор цистеамина (10 мМ) на 12 ч при комнатной температуре для получения самоорганизующегося монослоя (SAM) (рис. 1c). Белок A (1 мг / мл) активировали 4 мг / мл EDC-4 мг / мл NHS в течение 30 мин при комнатной температуре. После этого активированный белок А инкубировали на наносенсорах, модифицированных SAM, в течение 30 мин при 37 ° C и промывали буфером PBS (рис. 1d). Платформы наносенсоров затем инкубировали с антителом к ​​атразину в течение 50 мин и промывали буфером PBS (рис. 1e). Для предотвращения неспецифической адсорбции наносенсоры, покрытые атразиновым антителом, дополнительно обрабатывали 0,5% BSA в течение 30 минут, а затем промывали буфером PBS для удаления любого несвязанного BSA и сушили в потоке азота. Наконец, были изготовлены ME нанобиосенсоры для обнаружения атразина (рис. 1f).

Измерение сигнала

Резонансная частота ME нанобиосенсора была измерена с помощью измерительной катушки, намотанной вокруг флакона, вместе с анализатором векторных цепей (AV3620A, 41-й институт CETC, Циндао, Китай), как схематично показано на рис. магнитного поля анализатор цепей, связанный с катушкой датчика, работал в S ₁₁ режим для подачи частотного сигнала на катушку, и он может контролировать отраженный сигнал от катушки. Кроме того, статическое магнитное поле, создаваемое стержневым магнитом, применялось для улучшения резонансных характеристик. Нанобиосенсоры вертикально и без проводов (без каких-либо проводных соединений с измерительной системой) вставляли во флакон, содержащий 30 мкл раствора образца для тестирования. Все эксперименты проводились при комнатной температуре (25 ± 2 ° C) в системе растворителей PBS (0,1 M, pH 7,4). Резонансная частота нанобиосенсора может быть определена путем измерения S ₁₁ параметр, который отслеживался и записывался каждые 5 мин.

Схематическое изображение беспроводной системы измерения ME нанобиосенсора

Результаты и обсуждение

Характеристика морфологии поверхности нанобиосенсора

С помощью атомно-силового микроскопа (AFM, ND-100, Park System, Корея) наблюдали поверхность нанобиосенсора, чтобы изучить эффект иммобилизации антитела атразина. АСМ-изображения поверхности нанобиосенсора, покрытого AuNPs, и поверхности нанобиосенсора, модифицированного антителами, представлены на рис. 3a, b соответственно. Ясно, что повышенная шероховатость поверхности является результатом ковалентно иммобилизованного антитела против атразина. Всесторонний анализ топографии поперечных сечений АСМ показывает, что нанобиосенсор, покрытый AuNP, имеет изменение высоты 13,421 нм; однако значение увеличилось до 28,425 нм после модификации антитела. Поскольку хорошо известно, что диаметр молекулы антитела составляет около 15 нм, очевидно, что иммобилизация антитела против атразина является успешной.

Снимки АСМ ( a ) AuNPs с покрытием и ( b ) модифицированная антителами поверхность нанобиосенсора

Оптимизация концентрации антитела к атразину

Концентрация иммобилизации антитела имеет важное влияние на чувствительность нанобиосенсора. Следовательно, было необходимо оценить резонансную частотную характеристику нанобиосенсора с различными иммобилизационными концентрациями антитела атразина (25 мкг / мл, 50 мкг / мл, 75 мкг / мл, 100 мкг / мл). Из рис. 4 видно, что сдвиг резонансной частоты достиг максимума при 50 мкг / мл. Когда концентрация антител к атразину повысилась до 75 мкг / мл, ответ начал снижаться из-за стерических затруднений и электростатического отталкивания [35]. То есть антитело к атразину с концентрацией 50 мкг / мл может достигать относительно насыщенной иммобилизации. Таким образом, 50 мкг / мл была оптимальной концентрацией антитела к атразину для иммобилизации.

Частотная характеристика ME нанобиосенсора при различных иммобилизационных концентрациях антитела атразина (0 мкг / мл, 25 мкг / мл, 50 мкг / мл, 75 мкг / мл, 100 мкг / мл)

Оптимизация для концентрации Atr – BSA

В иммунореакции атразин и Atr-BSA конкурировали за ограниченное количество сайтов антител к атразину на поверхности нанобиосенсора. Следовательно, при оптимальной концентрации антитела к атразину для иммобилизации рабочая концентрация Atr-BSA, как важный фактор, влияет на чувствительность нанобиосенсора. Процесс оптимизации был исследован путем определения резонансной частотной характеристики ME нанобиосенсора на Atr-BSA различных концентраций (20 мкг / мл, 40 мкг / мл, 60 мкг / мл, 80 мкг / мл). Как показано на фиг. 5, максимальный ответ наблюдался при 40 мкг / мл. Итак, 40 мкг / мл Atr-BSA использовали в следующем определении.

Частотная характеристика ME нанобиосенсора на Atr – BSA различных концентраций (20 мкг / мл, 40 мкг / мл, 60 мкг / мл, 80 мкг / мл)

Обнаружение атразина

На рисунке 6 представлена ​​частотная характеристика ME нанобиосенсора в режиме реального времени, измеренная в смеси образцов 15 мкл Atr – BSA (40 мкг / мл) и 15 мкл атразина с различными концентрациями (0 нг / мл, 1 нг / мл, 10 нг. / мл, 100 нг / мл, 1000 нг / мл, 10 мкг / мл, 50 мкг / мл, 100 мкг / мл). Как показано на рис. 1g, атразин и Atr-BSA конкурентно сочетаются с антителом, иммобилизованным на поверхности нанобиосенсора, что, в свою очередь, приводит к увеличению массовой нагрузки на поверхность нанобиосенсора, что приводит к снижению резонансной частоты при инкубации. время. Из рис. 6 видно, что установившийся отклик обычно достигается примерно через 50 мин. Концентрация Atr-BSA и количество сайтов антител к атразину были фиксированными, поэтому количество связанного Atr-BSA на нанобиосенсоре было обратно пропорционально концентрации атразина в растворе. Молекулярная масса Atr – BSA больше, чем у атразина. Следовательно, резонансная частота нанобиосенсора изменяется обратно пропорционально концентрации атразина в растворе. Как показано на фиг. 6, скорость и величина сдвига резонансной частоты уменьшались с увеличением концентрации атразина, и более высокая концентрация атразина может вызвать меньший сдвиг резонансной частоты. На рис. 6 кривая * представляет фоновый ответ контрольного сенсора (без иммобилизации атразинового антитела) на Atr-BSA, который примерно на 48 Гц намного меньше сигнала обнаружения, что указывает на то, что неспецифическую адсорбцию можно игнорировать. Таким образом, концентрацию атразина можно определить по сдвигу резонансной частоты беспроводного ME нанобиосенсора с обратно пропорциональной зависимостью.

Частотные характеристики в реальном времени при различных концентрациях атразина в диапазоне от 0 до 100 мкг / мл. * Контрольный ответ (без иммобилизации атразиновых антител) на Atr – BSA

Стандартная калибровочная кривая для обнаружения атразина на МЭ нанобиосенсоре в течение первых 50 мин показана на рис. 7. Для каждой концентрации калибровочные эксперименты нанобиосенсора проводились пять раз в идентичных условиях. Установлено, что сдвиг резонансной частоты линейно зависит от значения логарифма концентраций атразина в диапазоне от 1 нг / мл до 100 мкг / мл, что может быть представлено как ∆f =54,717 log C _{Атразин} - 442,45 ( Р ² =0,971). Расчетная чувствительность составляет 3,43 Гц / мкг мл ^-1 . . Из рисунка 7 видно, что предел обнаружения (LOD) составляет 1 нг / мл, что значительно ниже верхнего допустимого предела для атразина в 3 мкг / л, указанного в US EPA, что соответствует действующему стандарту. Кроме того, предел обнаружения явно ниже, чем у ранее описанных методов [36, 37]. Было продемонстрировано, что недорогой, беспроводной и высокочувствительный нанобиосенсор был успешно разработан для обнаружения атразина в реальном времени.

Калибровочная кривая:50-минутный сдвиг резонансной частоты в зависимости от различных концентраций атразина

Поскольку атразин представляет собой небольшую молекулу, для повышения чувствительности МЭ нанобиосенсора был использован подход прямого конкурентного иммуноанализа. В прямом конкурентном иммуноанализе антитело модифицируется на поверхности сенсора, и сигнальный ответ возникает в результате связывания молекулы Atr – BSA. Напротив, в непрямом конкурентном иммуноанализе Atr-BSA иммобилизуется на поверхности сенсора, и ответ возникает в результате связывания молекулы антитела. Согласно литературным исследованиям [38] и нашим результатам, прямой конкурентный иммуноферментный анализ применим для мониторинга малых молекул. Непрямой конкурентный иммуноанализ очень чувствителен к образцу аналита со следовыми концентрациями [39]. Хотя непрямой конкурентный иммуноанализ имеет более высокую чувствительность [40, 41], он может быть сложным в эксплуатации и трудным для повторного надежного использования [36]. Однако прямой конкурентный иммуноферментный анализ очень быстр, прост в использовании и автономен - дополнительных реагентов не требуется [36]. Таким образом, для будущих разработок прямой конкурентный иммуноферментный анализ может быть наиболее многообещающим методом.

Специфичность ME нанобиосенсора

Специфичность ME нанобиосенсора к атразину была исследована путем определения реакции нанобиосенсора на некоторые другие пестициды, такие как прометрин, симазин и ДДТ, как показано на рис. 8. Из рис. 8 было очевидно, что ME нанобиосенсор мало реагировал на эти пестициды. помехи из-за неспецифического всасывания, а реакция на прометрин и симазин была немного выше, чем у ДДТ, который имел аналогичный уровень реакции на холостой раствор. Это может быть связано с тем, что и прометрин, и симазин имеют сходные структуры с атразином, относящимся к триазиновым пестицидам; однако ДДТ является разновидностью хлорорганических инсектицидов. Результаты показали, что атразин эффективно распознается и специфически комбинируется с антителом, иммобилизованным на поверхности нанобиосенсора. Таким образом, нанобиосенсор ME показал высокую специфичность для обнаружения атразина.

Резонансная частотная характеристика МЭ нанобиосенсора на другие помехи с концентрацией 100 мкг / мл

Стабильность нанобиосенсора ME

На рис. 9 показана устойчивость МЭ нанобиосенсора к обнаружению атразина. Шесть одинаковых ME нанобиосенсоров были приготовлены и хранились при 4 ° C, каждый из которых тестировался на содержание атразина 10 нг / мл через день в течение 6 дней. Каждый цикл обнаружения проверял только один нанобиосенсор в течение 50 минут. Понятно, что резонансные частотные характеристики нанобиосенсоров остаются почти постоянными, и рассчитанное относительное стандартное отклонение (RSD) составляет 1,8%. Результат демонстрирует, что нанобиосенсор ME демонстрирует превосходную стабильность при обнаружении атразина.

Измерения стабильности 10 нг / мл атразина на ME нанобиосенсоре

Выводы

Беспроводной ME нанобиосенсор на основе ME материалов и AuNP был успешно разработан для высокочувствительного обнаружения атразина в режиме реального времени с использованием конкурентного иммуноанализа. Направленная иммобилизация антитела к атразину через белок А улучшила характеристики нанобиосенсора. Атр – БСА с большой молекулярной массой и атразин конкурентно сочетаются с антителом к ​​атразину на поверхности нанобиосенсора, усиливая ответные сигналы, что, в свою очередь, улучшает чувствительность. Сдвиг резонансной частоты, в основном вызываемый связанным Atr-BSA, обратно пропорционален целевой концентрации атразина. Кроме того, рабочие концентрации антител к атразину и Atr-BSA были оптимизированы до 50 мкг / мл и 40 мкг / мл соответственно. В оптимальных условиях ME нанобиосенсор демонстрирует широкие линейные диапазоны определения атразина от 1 нг / мл до 100 мкг / мл с удовлетворительной чувствительностью 3,43 Гц / мкг · мл ^-1 и предел обнаружения 1 нг / мл, что достаточно для требований законодательства и ниже, чем у других заявленных методов. Изображения АСМ подтвердили, что антитело к атразину было успешно иммобилизовано на поверхности нанобиосенсора ориентированным образом. Результаты экспериментов демонстрируют высокую специфичность и стабильность МЭ нанобиосенсора по отношению к атразину. Благодаря его влиянию на пределы обнаружения, простоте, одноразовым свойствам и беспроводной связи, исследование не только предложило новый метод высокочувствительного обнаружения атразина, но также показало его потенциальную применимость для обнаружения других загрязнителей окружающей среды и мониторинга качества воды.>

Сокращения

AFM:

Атомно-силовой микроскоп

Atr – BSA:

Конъюгированный антиген атразин-альбумин

AuNP:

Наночастицы золота

BSA:

Бычий сывороточный альбумин

DDT:

Дихлордифенилтрихлорэтан

EDC:

1-этил-3- (3-диметиламинопропил) карбодиимид гидрохлорид

ME:

Магнитоупругий

NHS:

N -Гидроксисульфосукцинимид

PBS:

Физиологический раствор с фосфатным буфером

SAM:

Самособирающийся монослой

SEM:

Сканирующий электронный микроскоп

Агентство по охране окружающей среды США:

Агентство по охране окружающей среды США