Фототермическая / pH-система доставки лекарств с двойной реакцией на амино-терминированный HBP-модифицированный rGO и химиофотермическая терапия опухолевых клеток

Введение

Фототермическая терапия (ФТТ) при облучении в ближней инфракрасной области (NIR) привлекла повышенное внимание к ингибированию опухоли из-за небольшого побочного эффекта и минимально инвазивных свойств [1]. БИК-свет (700 ~ 1100 нм) проникает глубже в ткани тела без значительного поглощения, не повреждая здоровые ткани или клетки [2, 3]. Таким образом, при облучении лазером NIR фототермический агент может повышать температуру в месте имплантации за счет своей способности к фототермическому преобразованию. Кроме того, применяемый фототермический агент требует хорошей биосовместимости, эффективности и стабильности фототермической конверсии.

В ходе исследований последних лет было разработано и подготовлено множество материалов для лечения опухолевых тканей в качестве агентов PTT, таких как драгоценный металл (золотые наностержни [4], золотые нанопластинки [5]), полупроводниковые наноматериалы (CuS [6], MoS ₂ [7], FeS [8]), органические материалы (полидофамин [9], наночастицы полипиррола [10]), углеродные наноматериалы (углеродные нанотрубки [11], углеродные наночастицы [12] и графен [13]). В качестве перспективного углеродного наноматериала графен широко использовался для ингибирования опухолей с помощью метода PTT из-за его специальных двумерных нанолистов, которые обеспечивают сверхвысокую удельную поверхность и большой потенциал для высокой эффективности загрузки лекарственного средства [14, 15]. Однако восстановленный оксид графена (rGO), полученный обычными методами, включая мочевину и гидразингидрат, гидротермальным способом всегда проявляет высокую гидрофобность, что не способствует применению в воде феномена тканей тела [16].

В этом случае мы предложили новую идею использования водорастворимого полимера с восстановительной способностью для получения гидрофильного rGO. В нашей предыдущей работе мы синтезировали гиперразветвленный полимер с концевыми аминогруппами (NHBP) и попытались использовать его для обработки наночастиц оксида металла и получения металлических наносфер, которые являются высокогидрофильными без явной агломерации, таких как наночастицы серебра, модифицированные HBP, и -бактерии [17, 18].

Чтобы улучшить способность ингибировать опухоль, противоопухолевые препараты обычно загружают в фототермические агенты, чтобы создать систему, содержащую лекарство [19]. С одной стороны, фототермический агент может проявлять PTT-эффект при облучении лазером в ближнем инфракрасном диапазоне. С другой стороны, повышенная температура может ускорить скорость доставки лекарственного средства из-за улучшенной скорости движения молекул. Таким образом, фототермический агент, содержащий лекарственное средство, может оказывать химиофотермический синергетический терапевтический эффект в отношении ингибирования опухоли [20, 21]. Здесь мы использовали HBP с концевыми аминогруппами для получения гидрофильного rGO (NrGO, рис. 1), и были охарактеризованы физико-химические свойства, а также фототермическая способность. Впоследствии противоопухолевый препарат (доксорубицин, DOX) был включен в NrGO, затем были протестированы поведение доставки лекарства в различных условиях и эффективность ингибирования опухоли in vitro.

Схематическое изображение приготовления и химиофотермической терапии DOX @ NrGO

Методы / экспериментальные

Материалы

Оксид графена (GO, толщина 0,8 ~ 1,2 нм и ширина 0,5 ~ 5 мкм) был поставлен XFNANO Co., Ltd. DOX был приобретен у HuaFeng United Technology Co., Ltd. Среда Игла, модифицированная Дульбекко (DMEM), эмбрион крупного рогатого скота. сыворотка (FBS), трипсин, пенициллин (100 Ед / мл) и стрептомицин (100 мкг / мл) были приобретены у Thermo Fisher Scientific Inc. Метилтиазолилтетразолий (МТТ), 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI ) и иодид пропидия (PI) были получены от Beyotime Biotechnology Co., Ltd. Все остальные реагенты были приобретены у Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. без дополнительной очистки.

Получение гиперразветвленного полимера с концевыми аминогруппами (NHBP)

Сверхразветвленный полимер с концевыми аминогруппами был синтезирован, как и в нашей предыдущей работе [16]. Тетраэтиленпентамин (94 мл, 0,5 моль) добавляли в трехгорлую круглодонную стеклянную колбу объемом 250 мл, снабженную защитой от газообразного азота и магнитной мешалкой. Реакционную смесь перемешивали нагревательной магнитной мешалкой и охлаждали на ледяной бане, при этом в колбу по каплям добавляли раствор метилакрилата (43 мл, 0,5 моль) в метаноле (100 мл). Затем смесь удаляли с ледяной бани и оставляли перемешиваться еще на 4 ч при комнатной температуре. Смесь переносили в колбу в форме баклажана для автоматического роторного вакуумного испарения, температуру повышали до 150 ° C с использованием масляной бани и оставляли на 4 часа до получения желтоватой вязкой чешуи HBP со средневесовой молекулярной массой около 7759. .

Подготовка GO с пониженным содержанием NHBP (NrGO)

Сначала GO диспергировали в деионизированной воде и смешивали с помощью ультразвука с соответствующим HBP (массовое соотношение GO и NHBP 1:10, 1:20 и 1:30) в течение 10 минут, продолжали перемешивать и реагировали при 90 ° C в течение 1 часа. Затем полученный продукт (обозначенный как NrGO-10, NrGO-20 и NrGO-30) центрифугировали и трижды промывали деионизированной водой.

Подготовка загруженного DOX NrGO (DOX @ NrGO)

Свежеприготовленную суспензию NrGO диспергировали в растворе DOX с массовым соотношением 1:1 и продолжали перемешивать в течение 24 часов при комнатной температуре. Затем составной раствор центрифугировали и промывали для сбора DOX @ NrGO.

Измерения

Морфологию поверхности охарактеризовали с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ТЕМ, JEM-2100, JEOL, Япония). Инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье (FTIR, Nicolet iS10, Thermo Scientific, America) была выполнена, чтобы проиллюстрировать изменение химического компонента между GO и NrGO. Все спектры были измерены в диапазоне длин волн 400 ~ 4000 см ^-1 . с разрешением 4 см ⁻¹ . Поверхностный потенциал и размер частиц исследовали с помощью анализатора размера частиц Zeta-потенциала (NanoBrook 90plus Zeta, Брукхейвен, США). Поглощение NrGO в ближней ИК-области изучалось методом УФ-видимости (Evolution 300, Thermo Fisher, США) с диапазоном длин волн 400 ~ 900 нм и разрешением 1 см ^-1 . .

Фототермические свойства измеряли с использованием лазерного устройства NIR (SFOLT Co., Ltd., Шанхай, Китай) и термопарного термометра (DT-8891E, Shenzhen Everbest Machinery Industry Co., Ltd., Китай). Фототермические свойства NrGO были измерены при лазерном облучении с длиной волны 808 нм. Площадь пятна лазера составляет около 0,25 см ² , а изменение температуры суспензии исследуемого образца контролировалось в режиме реального времени. При этом чистая вода и суспензия GO применялись в качестве контрольных групп:(1) 0,2 мл чистой воды, суспензия GO и NrGO (NrGO-10, NrGO-20 и NrGO-30) помещалась в пробирку Эппендорфа 0,25 мл, затем NIR лазер облучали с плотностью мощности 1 Вт / см ² на 5 мин; (2) 0,2 мл суспензии NrGO-30 с различной концентрацией (100, 200 и 300 мкг / мл) облучали (1 Вт / см ² ) в течение 5 мин; (3) 0,2 мл суспензии NrGO-30 (200 мкг / мл) облучали с различной плотностью мощности (1, 1,5 и 2 Вт / см ² . ) в течение 5 мин; (4) 0,2 мл суспензии NrGO-30 (200 мкг / мл) облучали (1 Вт / см ² ) на три цикла включения / выключения.

Собранный DOX @ NrGO был разделен на три группы для различной обработки, чтобы исследовать поведение доставки лекарственного средства:(1) диспергирование в растворе PBS с pH =7,4, обозначенное как контрольная группа; (2) диспергирование в растворе PBS с pH =4,0, обозначенным как кислотная группа; (3) диспергирование в растворе PBS с pH =7,4 и облучение лазером NIR, обозначенным как группа NIR. Вышеупомянутые три группы (каждая группа была выставлена ​​на три параллели) были помещены в диализный мешок (5 мл) с отсеченной молекулярной массой 8000, а затем помещены в центрифужную пробирку с 20 мл соответствующего раствора PBS. После этого все пробирки помещали в шейкер при 37 ° C со скоростью 100 об / мин, 10 мл раствора PBS из каждой пробирки отбирали в заранее определенные моменты времени для анализа высвобождения лекарственного средства и снова добавляли равный объем соответствующего свежего PBS. Кроме того, группу NIR обрабатывали так, что свет NIR облучали в течение 5 минут после каждой заданной точки времени. Все извлеченные растворы были проанализированы УФ-видимой спектрофотометрией, и был получен профиль доставки лекарственного средства.

Цитотоксичность NrGO против опухолевых клеток (HeLa) исследовали с помощью МТТ-анализа. Вкратце, клетки HeLa высевали в 96-луночные планшеты при плотности 5 × 10 ³ . клеток на лунку и инкубировали до закрытия 80% лунки. Затем старую среду заменили свежей с NrGO (3,125, 6,25, 12,5, 25 и 50 мкг / мл), среду без NrGO выбрали в качестве контрольной группы. После инкубации в течение 24 и 48 ч анализ МТТ использовали для измерения относительной жизнеспособности клеток с помощью уравнения. (1):

где OD _sample и OD _control представляли измеренную оптическую плотность клеток, обработанных NrGO, в различных концентрациях и в контрольной группе, соответственно.

Затем изучали химиофотермическую синергетическую терапию путем обработки клеток HeLa DOX @ NrGO (3,125, 6,25, 12,5, 25 и 50 мкг / мл) при облучении NIR. После инкубации с DOX @ NrGO в течение 4 часов клетки HeLa облучали NIR-лазером в течение 5 минут и инкубировали еще 20 часов. После этого жизнеспособность клеток снова проверяли с помощью анализа МТТ. Затем для наблюдения за клетками клетки HeLa окрашивали DAPI и PI, соответственно, и наблюдали под CLSM и флуоресцентным микроскопом.

Результаты и обсуждение

Физические и химические характеристики

После реакции с NHBP раствор GO стал черным из коричневого, что указывает на то, что GO был успешно восстановлен до rGO и диспергирован в воде. Как показано на рис. 2a, b, были показаны ПЭМ-изображения GO и NrGO-30, соответственно, в то время как на NrGO не было обнаружено явного скрипа или агломерации, что свидетельствует о том, что обработка HBP не вызовет каких-либо морфологических изменений при восстановительной реакции. На основании спектров FT-IR на рис. 3 кривая пропускания NrGO-30 была очень похожа на кривую пропускания NHBP. Примечательно, что пик на 1725 см ⁻¹ ОГ исчезал после реакции восстановления, которая предполагалась поглощением колебаний C =O от карбоксильной группы [22]. В соответствии с молекулярной структурой NHBP с концевыми аминогруппами, восстановительная аминогруппа прореагировала с ГО, и новый пик FT-IR был получен при 1633 см ^-1 , который должен быть C-N из амидной связи. Результат дзета-потенциала был представлен на фиг. 4, очевидно, все образцы NrGO имели положительный потенциал, в то время как GO был отрицательным, что указывает на то, что карбоксильная группа GO реагировала с аминогруппой из HBP. УФ-видимый-БИК-спектры (рис. 5) использовали для иллюстрации поглощения NrGO в ближнем ИК-диапазоне; кривые образцов NrGO с различным соотношением исходных материалов показали аналогичную тенденцию с высоким поглощением в ближней ИК-области, что является преимуществом для применения в PTT. Принимая во внимание, что раствор GO и HBP практически не показал абсорбции в ближней инфракрасной области, что свидетельствует об успешном изготовлении фототермического агента из GO и NHBP. Кроме того, был измерен наноразмер NrGO (рис. 6), который не показал очевидных изменений с увеличением отношения NHBP.

ТЕМ-изображения GO ( a ) и NrGO ( b ). На вставке - оптическая фотография соответствующей дисперсии образца с концентрацией 1 мг / мл

ИК-Фурье спектры GO, NrGO и NHBP

Испытание дзета-потенциала образцов GO и NrGO

Спектры UV-vis-NIR образцов GO, HBP и NrGO

Измерение наноразмеров образцов NrGO

Измерение фототермических свойств

На основе полученного NrGO исследованы фототермические свойства при лазерном облучении с длиной волны 808 нм. Как показано на рис. 7, кривые нагрева воды, GO и NrGO имеют разные тенденции. Температура чистой воды почти не росла, и GO поднялся только ниже 5 ° C, в то время как NrGO улучшился до 40 ° C, а NrGO-20 и NrGO-30 даже поднялся выше 45 ° C. NrGO мог поглощать NIR-лазер, чтобы вызвать фототермическое поведение, а эффективность фототермического преобразования была улучшена с увеличением отношения HBP; поэтому NrGO-30 был выбран для завершения следующего расследования. Как показано на рис. 7b, c, достигнутая температура повышалась с увеличением концентрации NrGO или мощности лазера, и последний фактор влиял сильнее. Было доказано, что 41–43 ° C подходит для ингибирования опухолевых клеток с небольшим отрицательным эффектом на нормальные клетки; таким образом, приготовленный NrGO может удовлетворять требованиям PTT в малых дозах и лазерном порошке. Затем была протестирована фототермическая стабильность, которая показала на рис. 7d, нет очевидной разницы после трех циклов включения / выключения. Таким образом, NrGO получил отличные фототермические свойства в ближней инфракрасной области. Чтобы подтвердить стабильность поглощения NrGO до и после облучения лазером NrGO, УФ-видимые спектры были показаны на рис. 8. Очевидно, что кривая не изменилась после облучения NrGO, показывая, что облучение NrGO не повлияет на поглощение NrGO. / P>

Измерение фототермических свойств. а Кривые нагрева образцов воды, GO и NrGO (200 мкг / мл) при облучении лазером 808 нм (1 Вт / см ² ). б Кривые нагрева NrGO-30 с различными концентрациями при лазерном облучении 808 нм (1 Вт / см ² ). c Кривые нагрева NrGO-30 (200 мкг / мл) при лазерном облучении 808 нм при различной плотности мощности. г Кривая изменения температуры NrGO-30 (200 мкг / мл) при лазерном облучении 808 нм при трехкратном циклическом облучении (1 Вт / см ² )

UV-vis-NIR спектры NrGO до и после облучения лазером NIR

Тест поведения при доставке лекарств

После того, как DOX был загружен на NrGO, был проведен эксперимент по доставке лекарства. Из-за слабокислой среды опухолевой ткани было изучено влияние NIR-излучения и pH. В данном случае для имитации нормальной или опухолевой ткани применяли PBS с pH 7,4 или 4,0 соответственно. Как показано на фиг.9, скорость доставки лекарственного средства, очевидно, увеличивалась при низком pH и ближнем ИК-излучении. С одной стороны, аминогруппа NrGO будет ионизирована при низком значении pH, тогда сила отталкивания между DOX и ионизированными аминогруппами будет улучшена в условиях низкого pH, что ускорит доставку лекарства и покажет чувствительность к pH. Кроме того, хорошая растворимость DOX в условиях низкого pH также может увеличить скорость доставки лекарства [23]. С другой стороны, при облучении лазером в ближнем инфракрасном диапазоне местная температура повышалась, а скорость движения молекул увеличивалась. Таким образом, DOX @ NrGO был чувствителен к pH / фототермическому воздействию при доставке лекарств, что полезно для контроля скорости доставки лекарств в опухолевую ткань и оказывал химиофотермическую синергетическую терапию.

Профили высвобождения лекарственного средства DOX @ NrGO in vitro при различных условиях

Цитотоксичность NrGO

Биосовместимость - это основное обязательное свойство биоматериалов; таким образом, цитотоксичность NrGO с различной концентрацией первоначально была протестирована во время эксперимента in vitro с помощью анализа МТТ. Как показано на рис. 10a, результаты анализа МТТ за 24 часа показали, что жизнеспособность клеток оставалась более 80%, когда концентрация NrGO достигала 50 мкг / мл, что может доказать, что NrGO был хорошо биосовместим и считался многообещающим биосовместимым агентом PTT в опухоли. торможение.

а Тест на цитотоксичность NrGO при различных концентрациях в течение 24 и 48 часов. б Исследование ингибирования опухолевых клеток DOX @ NrGO при различном лечении

Синергетическое ингибирование DOX @ NrGO на опухолевых клетках

Основываясь на биосовместимости NrGO, эффективность ингибирования опухолей DOX @ NrGO была изучена in vitro. Чтобы изучить влияние фототермического поведения, соответствующие опухолевые клетки облучили лазером ближнего ИК-диапазона в течение 5 минут с плотностью мощности 0,5 Вт / см ² . Как показано на фиг. 10b, когда опухолевые клетки обрабатывали DOX @ NrGO в течение 24 часов, жизнеспособность, очевидно, снижалась с увеличением концентрации, показывая, что высвобожденный DOX может ингибировать пролиферацию опухолевых клеток. Более того, жизнеспособность снижалась намного быстрее, когда также применялось NIR-излучение, что указывает на то, что повышенная температура и скорость высвобождения DOX могут играть роль химиофотермической синергетической терапии.

После окрашивания DAPI клетки наблюдали под конфокальной лазерной сканирующей микроскопией (CLSM), ядра окрашивали в синий цвет, и изображения различных обработок отображались на рис. 11a – c, соответственно. Клетки, культивированные с NrGO, были чрезмерно распространены (фиг. 11a) на культуральной чашке с большим количеством, в то время как их количество уменьшалось при обработке DOX @ NrGO (фиг. 11b), показывая, что высвобожденный DOX может ингибировать пролиферацию опухоли. Примечательно, что опухолевые клетки в области воздействия NIR-лазера были эффективно разрушены и отпали, в результате чего на изображении образовалась темная область (рис. 11c).

CLSM-изображения ядер клеток, окрашенных DAPI (синий) после обработки NrGO ( a ), DOX @ NrGO ( b ) и DOX @ NrGO + NIR ( c ). (× 400)

Кроме того, ИП применяли для наблюдения за ингибированием опухолевых клеток после химиофотермической синергетической обработки, которая представляет собой своего рода низкомолекулярный краситель, окрашивающий мертвые клетки до красной флуоресценции. Как показано на Рис. 12, редко мертвые клетки (красная точка на изображении) наблюдались на Рис. 12a, когда лечение не проводилось, в то время как после химиофотермической обработки опухолевые клетки вне области воздействия пострадали от повреждения DOX и высокая температура для дальнейшего снижения жизнеспособности клеток (рис. 12b). Согласно приведенным выше результатам, DOX @ NrGO оказался желательным кандидатом для лечения опухолей.

Окрашивание опухолевых клеток ИП при различных обработках. а Контроль. б DOX @ NrGO + NIR

Выводы

Таким образом, новый гидрофильный NrGO был разработан и успешно получен посредством простой реакции GO и HBP с концевыми аминогруппами. Различные характеристики показали, что NrGO обладает стабильными и выдающимися фототермическими свойствами. После загрузки DOX доставка лекарственного средства проявляла двойное реагирование на pH и фототермическое воздействие, которое можно было ускорить при низком значении pH и облучении NIR. Кроме того, результат цитотоксического эксперимента in vitro показал, что свежеприготовленный NrGO был хорошо биосовместим. Благодаря этому преимуществу, опухолевые клетки можно было эффективно ингибировать на основе химиофотермической синергетической терапии, а NrGO, нагруженный противоопухолевыми лекарственными средствами, получил многообещающее применение в терапии опухолей.

Сокращения

CLSM:

Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия

DAPI:

4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол

DOX:

Доксорубицин

DOX @ NrGO:

NrGO с загрузкой DOX

FTIR:

Инфракрасное преобразование Фурье

GO:

Оксид графена

HBP:

Сверхразветвленный полимер

MTT:

Метилтиазолилтетразолий

NHBP:

HBP с концевой аминогруппой

NIR:

Ближний инфракрасный порт

NrGO:

Сверхразветвленный полимер с концевыми аминогруппами, восстановленный оксид графена

PI:

Иодид пропидия

PTT:

Фототермическая терапия

rGO:

Восстановленный оксид графена

SEM:

Сканирующая электронная микроскопия

ТЕМ:

Просвечивающий электронный микроскоп