Украшение нанопузырьков с помощью вставляемого пептида с низким pH (pHLIP) для целевой доставки

Введение

Около века назад Пол Эрлих высказал идею реализации «волшебных пуль» для более эффективной доставки лекарств [1]. «Волшебные пули» должны быть в состоянии защитить доставляемое лекарство от суровых условий окружающей среды, уменьшить побочные эффекты, направляя лекарство на больную ткань, улучшая фармакокинетику и фармакодинамику лекарства и регулируя высвобождение лекарства [2].

В 1965 году Бэнгхэм впервые наблюдал везикулы на основе фосфолипидов [3], а в последующие годы Грегори Грегориадис основал концепцию, согласно которой липосомы могут инкапсулировать лекарства, а затем использоваться в качестве систем доставки лекарств. В частности, они состоят из фосфолипидных замкнутых бислоев (ламелей), где гидрофобные липидные цепи замкнуты между двумя слоями гидрофильных головных групп. Замкнутый бислой окружает водное ядро, что позволяет локализовать липофильные или гидрофильные лекарства соответственно [4, 5].

Размер липосом является критическим параметром, влияющим на судьбу носителя после введения с точки зрения абсорбции белков плазмы, распознавания ретикулоэндотелиальной системой (RES), полупериода циркуляции и клеточного транспорта. Наноразмерные носители могут способствовать интернализации клеток и нацеливанию на опухоли, поэтому многие исследователи сосредоточили свое внимание на «нанонизации» [6,7,8,9].

Чтобы получить более универсальные и более экономичные наноносители, были использованы синтетические поверхностно-активные вещества для получения липосомоподобных систем доставки лекарств. Для этой цели широко используются неионные поверхностно-активные вещества, которые способны самоорганизовываться в однослойные или многослойные везикулы ( non - ионные липосомы , ниосомы или везикулы неионных поверхностно-активных веществ). Поверхностно-активные вещества на основе эфиров сорбитана (Spans®) представляют собой липофильные вещества, широко используемые при приготовлении ниосом. Чтобы продлить время циркуляции везикул и получить «невидимые» наноносители, включение полиэтиленгликоля (PEG) является подходом золотого стандарта:посредством этой конъюгации получают поверхностно-активные вещества на основе эфиров этоксиэтилированного сорбитана (Tweens®). И Span, и Tween характеризуются разным значением гидрофильно-липофильного баланса (HLB), а выбор поверхностно-активного вещества позволяет получать ниосомы с желаемыми свойствами [10]. Кроме того, добавление холестерина используется для повышения стабильности бислоя за счет вытягивания хвостов поверхностно-активного вещества, воздействия на гель поверхностно-активного вещества до температуры жидкого фазового перехода и придания жесткости липофильному бислою [11, 12]. Разработан «оптимизированный» наноноситель. для улучшения формулировки и / или улучшения таргетинга [10].

В настоящее время рак - одна из основных причин смерти в мире. Современные терапевтические подходы имеют ряд ограничений, включая неэффективную доставку лекарств к опухолям и отсутствие нацеливания на опухоль, связанное с нежелательными и опасными побочными эффектами, которые нанотехнологические подходы могут помочь преодолеть [13].

В настоящее время разрабатываются различные подходы к таргетингу. Большинство из них основаны на нацеливании на определенные биомаркеры, сверхэкспрессированные на поверхности раковых клеток. Однако из-за того, что опухоли человека очень разнородны, более общие подходы к нацеливанию на опухоли будут гораздо более предпочтительными. Кислотность на поверхности раковых клеток является признаком микроокружения опухоли и не зависит от перфузии опухоли, поэтому она может служить общим биомаркером для нацеливания на опухолевые клетки [14]. Технология вставочного пептида с низким pH (pHLIP) быстро развивается для нацеливания визуализации и терапевтических малых молекул, а также наноматериалов в опухоли. pHLIP определяет pH на поверхности раковых клеток и внедряется в мембрану клеток-мишеней [15, 16]. Механизм вставки pHLIP запускается протонированием отрицательно заряженных остатков пептида при низком pH (pH <7,0). Это приводит к увеличению гидрофобности пептида, сдвигая равновесие в сторону разделения пептида на бислой [17]. Наноносители, украшенные pHLIP, являются биосовместимыми, могут нацеливаться на опухоли и демонстрируют повышенное клеточное поглощение раковыми клетками. К числу исследованных наночастиц, покрытых pHLIP, относятся липидные, полимерные и наноматериалы на основе металлов [18,19,20,21].

Цель настоящей работы - полностью охарактеризовать новые везикулярные наноносители, декорированные pHLIP, чтобы получить фундаментальное понимание свойств наноносителей и облегчить рациональный дизайн чувствительных к кислотности нановекторов.

Материалы и методы

Материалы

Монолаурат полиоксиэтиленсорбитана (Tween 20), монолаурат сорбитана (Span 20), холестерин (Chol), соль Hepes { N - (2-идроксиэтил) пиперазин- N ′ - (2-этансульфоновая кислота)}, человеческая сыворотка, сефадекс G-75, кальцеин и дифенилгексатриен (DPH) были приобретены у Sigma-Aldrich. 1,2-димиристоил- sn -глицеро-3-фосфохолин (DMPC) и 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин- N - Натриевая соль [4- (п-малеимидофенил) бутирамид] (DSPE-малеимид) была приобретена у Avanti Polar Lipids, а пирен получен у Fluka. Пептид pHLIP (ACEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADEGT) был синтезирован и очищен CS Bio. Все остальные продукты и реагенты были аналитической чистоты.

Синтез DSPE-pHLIP

pHLIP конъюгировали с липидами DSPE в метаноле путем ковалентной конъюгации DSPE-малеимида с единственным остатком цистеина на N-конце pHLIP, как это было описано ранее [18, 21, 22]. Вкратце, 5 мг пептида, растворенного в 250 мкл метанола (продуваемого аргоном), и DSPE-малеимид (из 9,9 мМ исходного раствора), растворенные в хлороформе, смешивали в молярном соотношении 1:1. Реакционную смесь выдерживали при комнатной температуре около 2–6 ч до завершения конъюгации. За ходом реакции конъюгации DSPE-малемида с pHLIP следили с помощью RP-HPLC с использованием градиента от 25 до 80% ацетонитрила в воде, содержащей 0,05% TFA, отслеживая уменьшение пика, соответствующего немеченому pHLIP в реакционной смеси. Синтезированная конструкция охарактеризована масс-спектрометрией SELDI-TOF. Концентрацию конъюгата DSPE-pHLIP определяли по оптической плотности с использованием коэффициента молярной экстинкции для pHLIP: ε ₂₈₀ =13 940 M ⁻¹ см ⁻¹ .

Подготовка и очистка везикул

Метод тонкослойного испарения использовали для приготовления везикул неионного поверхностно-активного вещества (из Tween 20 или Span 20) и фосфолипидов (из DMPC) с pHLIP и без него. В каждый состав везикул добавляли холестерин в различных молярных соотношениях (таблица 1) [23].

Состав образцов был оптимизирован за счет выбора ранее хорошо охарактеризованных структур [24, 25], в которые было добавлено такое же количество pHLIP.

Липофильные компоненты сначала растворяли в CHCl ₃ . :CH ₃ Смесь ОН (3:1); затем органический растворитель удаляли в вакууме при различных температурах в зависимости от образца. Полученную пленку гидратировали 5 мл буфера Hepes (0,01 M pH 7,4) или раствором кальцеина натрия 10 ^-2 . М. Суспензию перемешивали на вортексе в течение примерно 5 мин с последующей обработкой ультразвуком (см. Дополнительный файл 1:Таблица S1, вспомогательная информация) с использованием микрозонда, работающего на частоте 20 кГц (VibraCell-VCX 400-Sonics, Тонтон, Массачусетс, США). Обработка LipoDMPC ультразвуком проводилась в инертной атмосфере для предотвращения окисления.

Суспензию везикул затем очищали гельпроникающей хроматографией с использованием Sephadex G-75 (стеклянная колонка 50 × 1,2 см) и буфера Hepes в качестве элюента. После этого очищенную суспензию везикул фильтровали с помощью целлюлозных фильтров с соответствующим диаметром пор.

Тот же метод приготовления был использован для приготовления ниосом и липосом, покрытых pHLIP.

Измерения динамического рассеяния света

Средний размер и распределение пузырьков по размерам измеряли при T =25 ° C путем динамического рассеяния света (DLS) с использованием Malvern NanoZetaSizer ZS90, оснащенного гелий-неоновым лазером мощностью 5 мВт (длина волны λ =632,8 нм) и цифровым коррелятором. Нормированные автокорреляционные функции интенсивности рассеяния под углом 90 ° были проанализированы алгоритмом Contin для получения распределения коэффициента диффузии частиц D , отсюда и распределение эффективного гидродинамического радиуса R _H пузырьков через соотношение Стокса-Эйнштейна R _H = К _B Т / 6πη D , где K _B Т - тепловая энергия, η - вязкость растворителя. Ширина распределения по размерам ниосом / липосом довольно мала, но им нельзя пренебречь. Значения, приведенные в таблице 2, соответствуют средневзвешенному по интенсивности гидродинамическому диаметру частиц [26].

Измерения ζ-потенциала

Измерения электрофоретической подвижности проводили методом лазерного допплеровского электрофореза с использованием прибора Malvern NanoZetaSizer ZS90. Мобильность u был преобразован в ζ -потенциал с использованием соотношения Смолуховского ζ =uη / є, где η и є - вязкость и диэлектрическая проницаемость фазы растворителя соответственно [27].

Малоугловое рассеяние рентгеновских лучей

Эксперименты по малоугловому рассеянию рентгеновских лучей (МУРР) проводились в Европейском центре синхротронного излучения (ESRF, Гренобль, Франция). Использование луча высокой яркости ID02 позволило проводить измерения разбавленных растворов в области передачи импульса 0,1 нм ⁻¹ ≤ q ≤ 6 нм ⁻¹ , q =(4π / λ) sin (θ / 2), где θ - угол рассеяния, а λ =0,1 нм - длина волны рентгеновского излучения. Соответствующий исследуемый масштаб длины составляет от 1 до 60 нм, что позволяет получить доступ к внутренней структуре ниосомных и липосомных везикул. Все эксперименты проводились при T =25 ° C с коротким временем облучения, 0,1 с, для предотвращения радиационного повреждения. Для каждого образца интенсивность рассеяния при разных углах рассеяния фиксировалась на 2D-детекторе, затем перегруппировывалась по углам, вычиталась для вклада фона и растворителя и анализировалась для получения информации о форме и внутренней структуре везикул в растворе.>

В случае однослойных везикул замкнутый бислой моделировали тремя концентрическими оболочками, соответствующими внешним головным группам, гидрофобным цепям и внутренним головным группам. Было принято распределение Шульца для размера везикул.

Крио-ТЕМ

Раствор везикул (капля 5 мкл) наносили на сетку для электронной микроскопии Лейси формар / углерод и сохраняли в замороженном-гидратированном состоянии путем быстрого замораживания в жидком этане. Процесс витрификации проводили с использованием системы FEI Vitrobot с настройкой одного блоттинга 3 с, смещения 1 и времени слива и ожидания 1 с. Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) (JEOL 2100) с ускоряющим напряжением 200 кВ и увеличением в диапазоне от × 10 000 до × 150 000 использовалась для изображения везикул.

Исследования стабильности

Исследования физической стабильности ниосом и липосом, приготовленных с pHLIP и без него, проводили при двух различных температурах хранения (25 ° C и 4 ° C). Цель состояла в том, чтобы оценить, происходят ли значительные изменения в размере и ζ-потенциале дисперсии везикул в течение 90 дней. Образцы из каждой партии отбирали через определенные интервалы времени (1, 30, 60 и 90 дней) и определяли размер везикул и ζ-потенциал, как описано ранее.

Точно так же стабильность везикул исследовали также в присутствии биологических жидкостей, таких как сыворотка крови человека. Суспензии контактировали с 45% сыворотки крови человека при 37 ° C. Через определенные интервалы времени (0, 30 мин, 1 час, 2 часа и 3 часа) определялись изменения размера везикул и ζ-потенциала, как описано.

Двухслойная характеристика

Текучесть и микровязкость-полярность ниосомных и липосомных бислоев были получены с помощью измерений флуоресценции двух флуоресцентных зондов, дифенилгексатриена (DPH) и пирена, соответственно, расположенных в гидрофобной области двухслойной мембраны. И DPH (2 мМ), и пирен (4 мМ), 220 мкл и 2,5 мг соответственно добавляли к поверхностно-активному веществу или смеси фосфолипид / холестерин перед приготовлением везикул [28]. После этого везикулы, нагруженные пиреном, очищали, как описано ранее, в то время как везикулы, нагруженные DPH, фильтровали через поры постепенно уменьшающегося размера (от 5,0 до 0,22 мкм).

Измерения анизотропии флуоресценции проводили при комнатной температуре с использованием спектрофлуориметра LS55 (PerkinElmer, Массачусетс, США) при λ _exc =400 нм и λ _em =425 нм и анизотропия флуоресценции ( A ) образцов рассчитывали по следующему уравнению [29]:

где I _vv и я _vh - интенсивности испускаемой флуоресценции (произвольные единицы), соответственно, параллельные и перпендикулярные направлению вертикально поляризованного возбуждающего света. Поправочный коэффициент G =I _hv / Я _чч представляет собой соотношение между вертикально и горизонтально поляризованными компонентами излучения, когда возбуждающий свет имеет горизонтальную поляризацию. Значения анизотропии флуоресценции обратно пропорциональны текучести мембраны. Следовательно, высокое значение анизотропии флуоресценции соответствует высокому структурному порядку и / или низкой текучести мембраны [30].

Для оценки микровязкости и микрополярности бислоя везикул были проведены эксперименты по флуоресценции пирена на спектрофлуориметре Perkin-Elmer LS55 при λ _exc =330 нм, регистрируя спектр излучения в диапазоне 350 <λ _em <550 нм [28]. Тонкая структура флуоресценции пирена представлена ​​пятью пиками. Соотношение интенсивностей первой (372 нм) и третьей (382 нм) колебательных полос спектра флуоресценции пирена, I ₁ / Я ₃ , связано с полярностью пиренового окружения [31]. Действительно, низкие значения I ₁ / Я ₃ соотношение соответствуют неполярной среде. Кроме того, молекулы пирена, включенные в бислой везикул, могут образовывать внутримолекулярные эксимеры, и этот процесс чувствителен к вязкости микроокружения зонда [32]. Следовательно, отношение интенсивностей флуоресценции эксимера / мономера, I _E / Я _M , относится к микровязкости.

Эти исследования проводились на везикулах, приготовленных как с pHLIP, так и без него, а затем полученные результаты сравнивались.

Исследования выпуска кальцеина

Везикулы неионного поверхностно-активного вещества или фосфолипидов загружали кальцеином в концентрации 10 ^-2 М. При этой концентрации флуоресценция кальцеина самотушается [33]. Затем для определения высвобождения кальцеина из водной сердцевины везикул использовали измерения декогашения. Флуоресцентный зонд загружали в везикулы во время гидратации тонкой пленки путем добавления 5 мл водного раствора кальцеина. Суспензии везикул очищали гельпроникающей хроматографией, вводили в контакт с 45% сывороткой человека или Hepes, а затем загружали в диализный мешок с целлюлозной мембраной (предельная молекулярная масса 8000 Да от Spectra / Por®). Эксперименты по высвобождению проводили при 37 ° C при магнитном перемешивании в буфере Hepes (10 мМ, pH 7,4) в качестве внешней среды. Аликвоты внешней среды отбирали в разное время в течение 0–24 ч. Время от времени отобранные аликвоты повторно вводились в систему [34].

Высвобождение кальцеина контролировали путем измерения флуоресценции среды с использованием спектрофлуориметра Perkin-Elmer LS50B с λ _ex =492 и λ _em =520 нм. Контрольное значение F _∞ (условные единицы), соотнесенное с общим количеством кальцеина, захваченного везикулами [35], определяли после разрушения везикул с использованием изопропилового спирта (1:1 v / v ). Процент выпуска ( F %) в каждый момент времени были получены с использованием следующего уравнения:

где F _t (условные единицы) - флуоресценция, считываемая в определенный момент времени t .

Статистический анализ

Для статистического анализа использовали односторонний дисперсионный анализ. Апостериори Бонферрони t Был проведен тест для оценки статистической значимости теста ANOVA. А п значение <0,05 считалось статистически значимым. Результаты представляют собой среднее значение трех экспериментов ± стандартное отклонение.

Результаты и обсуждение

Везикулы Tween20-, Span20- и DMPC, полученные с DSPE-pHLIP и без него, были охарактеризованы по размеру и ζ-потенциалу (Таблица 2).

Согласно результатам, представленным в Таблице 2, проанализированные образцы не показывают значительных изменений ни в размере, ни в ζ-потенциале, независимо от присутствия pHLIP.

Вышеуказанные диапазоны размеров были подтверждены с помощью другого метода анализа, такого как крио-ТЕМ (рис. 1).

Репрезентативные крио-ТЕМ-изображения ниосом и липосом, покрытых pHLIP. Изображения ниосом NioSpan20-pHLIP ( a ) и липосомы LipoDMPC-pHLIP ( b ), полученные при увеличении × 10000, и липосомы LipoDMPC-pHLIP ( c ) получено при увеличении × 40 000

Внутренняя структура ниосом / везикул с и без DSPE-pHLIP была определена с помощью экспериментов SAXS. Спектры интенсивности МУРР, представленные на рис. 2, различаются, что указывает на то, что каждая система имеет свои особенности.

Спектры МУРР. Спектры интенсивности ниосом / везикул без (черные открытые символы) и с DSPE-pHLIP (цветные символы)

Ниосомы на основе твин-20 являются однослойными, в то время как везикулы DMPC демонстрируют определенную степень мультиламеллярности (как липосомы), о чем свидетельствует наличие характерного пика на q ≅ 1 нм ⁻¹ , что соответствует межламеллярному расстоянию 6 нм (около 5 нм липидного бислоя и 1 нм воды). Везикулы на основе Span20 определенно многопластинчатые с характерным пиком на q =1,6 нм ⁻¹ соответствует межламеллярному расстоянию 3,8 нм, что соответствует удвоенной длине молекулы Span20. Результаты показывают, что многослойная оболочка везикул Span20 состоит из смежных бислоев, почти без межламеллярной воды.

Присутствие DSPE-pHLIP (мольная доля менее 1%) не оказывает существенного влияния на системы. Интенсивность рассеяния во всех исследованных q -диапазон очень похож, что указывает на сопоставимую фракцию структурированного материала и сопоставимый общий размер везикулярных частиц.

Везикулы на основе DMPC демонстрируют небольшое увеличение количества бислоев в липосомах, о чем свидетельствует увеличение интенсивности пика Брэгга на q =1 нм ⁻¹ . Встраивание низкой фракции C18-цепей DSPE, связанных с каждой молекулой пептида, не изменяет толщину липидного бислоя и в основном продиктовано большой долей холестерина по отношению к DMPC (около 40-50%). При этой концентрации холестерина липидные цепи организованы в жидкой упорядоченной (Lo) фазе и характеризуются разделением слабого латерального позиционного порядка цепей по сравнению с высоким ориентационным порядком вдоль цепей и способны содержать небольшое количество C18- цепочки без структурных изменений [36]. Кроме того, многослойные везикулы на основе Span20 не изменяют свою внутреннюю структуру.

В системе Tween20 + pHLIP присутствует небольшое количество кристаллитов холестерина, что показано типичным острым пиком при q =1,84 нм ⁻¹ (характерное расстояние 3,41 нм), а структура везикул не изменяется. Присутствие небольшого количества микрокристаллитов часто обнаруживается в связи с ниосомами на основе твин [37] в количестве, зависящем от состава, процедуры получения и очистки. На рис. 2 два экспериментальных спектра везикул Tween20 и Tween20 + pHLIP показаны вместе с аппроксимирующими кривыми, полученными путем моделирования сферически замкнутого бислоя с тремя концентрическими оболочками:внешними головными группами, цепями и внутренними головными группами. Подходящий средний размер везикул составляет около 168 нм в обеих системах, что согласуется с результатами DLS. Структурные параметры одинаковы для двух замкнутых бислоев (см. Дополнительный файл 1:Рисунок S1 и Таблица S2) за исключением внешней оболочки:в присутствии DSPE-pHLIP небольшое уменьшение (5%) электронной плотности головных групп наблюдается (от 0,42 до 0,40 э / Å ³ ) вместе с увеличением шероховатости слоя. Этот результат указывает на то, что добавление DSPE-pHLIP в основном влияет на внешнюю оболочку везикул. Это согласуется с картиной, где C18-цепи DSPE вставляются в бислой и закрепляют пептид на поверхности везикулы среди протяженных и разветвленных головных групп полиэтиленгликоля. Отметим, что способность самого пептида pHLIP (не связанного с липидными молекулами) взаимодействовать с внешней поверхностью везикул при высоком pH и вставляться в бислой при низком pH была недавно обнаружена методом SAXS в случае ненасыщенных бислоев фосфолипидов [38]. ]. В настоящем исследовании мольная доля пептида значительно ниже, и пептид связан с липидами, поскольку цель состоит в разработке pH-чувствительных нановекторов лекарственных препаратов с покрытием pHLIP. Ассоциация pHLIP управляется гидрофобным взаимодействием конъюгированных C18-цепей DSPE, вставленных в гидрофобную область нановектора. Пептид pHLIP заякорен и расположен во внешней области головной группы, склонен взаимодействовать с мембранами-мишенями при кислом pH и / или высвобождать содержимое нановектора после перестройки бислоя в среде с низким pH.

Чтобы исследовать, может ли присутствие pHLIP влиять на микрореологические свойства бислоя (текучесть, микровязкость и полярность), была проведена характеристика липофильной оболочки. Исследования характеристик проводились с использованием флуоресцентного зонда пирена, добавленного к образцам в начале процедуры приготовления. Благодаря своей липофильной природе, он вставляется в бислой везикул и предоставляет информацию о полярности и микровязкости мембранной среды.

Как показано в таблице 3, во всех трех наборах образцов значения полярности незначительно снижаются в присутствии pHLIP по сравнению с аналогичной везикулой без pHLIP, тогда как значения микровязкости показывают трехкратное увеличение для всех везикул.

Далее бислой характеризовали измерениями анизотропии флуоресценции другого липофильного флуоресцентного зонда, DPH, включенного в липиды. Эти измерения отражают движение зонда и его ориентацию внутри бислоя, что дает информацию о текучести бислоя, которая может влиять на способность пузырьков высвобождать свое содержимое [29]. Значения анизотропии флуоресценции обратно пропорциональны текучести мембраны. Следовательно, высокое значение анизотропии флуоресценции соответствует высокому структурному порядку и / или низкой текучести мембраны, как в жидкоупорядоченной фазе [30].

Значения анизотропии для каждого образца показаны в таблице 3. Данные показывают, что присутствие DSPE-pHLIP в везикулах увеличивает текучесть мембран, поскольку анизотропия флуоресценции снижается. Хорошо известно, что на текучесть бислоя влияет не только порядок и латеральная организация аполярных цепей, но и полярные головные группы [31]. Результаты SAXS для трех разных систем показывают, что молекулы DSPE-pHLIP влияют в основном на область головной группы, в конечном итоге вызывая различную упаковку полярных головок. Структурные результаты, по-видимому, соответствуют микрореологическим свойствам бислоев в присутствии ассоциированного DSPE-pHLIP, что выявлено введением двух разных зондов. Результаты показывают повышенную микровязкость, обнаруженную пиреном, зондом, который может вставляться близко к внешней области (log P пирена составляет 4,88). С другой стороны, предполагается, что DPH встроен в ядро ​​бислоя, ориентирован параллельно оси липидной ацильной цепи или ограничен в центре бислоя параллельно поверхности. Он в значительной степени чувствителен к угловой переориентации ацильных цепей амфифильных групп [39]. Повышенная текучесть, как показывает DPH, может быть связана как с эффектом встраивания цепей DSPE среди других ацильных цепей, так и с эффектом разделения pHLIP в области полярных головных групп, изменяя свойства упаковки поверхностно-активных веществ. (Рис. 3).

Представление взаимодействий pHLIP с мембраной везикул

На исследуемых препаратах были проведены дальнейшие исследования характеристик. Все образцы, приготовленные с pHLIP и без него, хранили в течение 90 дней при температуре 4 ° C, чтобы оценить стабильность везикул с течением времени путем измерения их размера и вариаций ζ-потенциала (дополнительный файл 1:рисунок S2). Никаких значительных изменений в размере и ζ-потенциале на протяжении эксперимента не наблюдалось; Таким образом, все исследованные препараты оказались стабильными при хранении при температуре 4 ° C.

Кроме того, стабильность образцов была исследована в присутствии 90% ( v / v ) человеческой сыворотки и хранили при 37 ° C в течение 3 часов (дополнительный файл 1:Рисунок S3).

При контакте с сывороткой человека везикулы Tween20 увеличивались в размерах, но оставались ниже 300 нм. Размер и значения PDI были постоянными в течение 3-часового эксперимента, что позволяет предположить, что везикулы в суспензии оставались нетронутыми на протяжении всего эксперимента.

Оба образца Span20, контактировавшие с сывороткой человека, показали увеличение размера, особенно в препарате с pHLIP, в то время как значения PDI предполагают однородное распределение по размеру (данные не показаны). Это событие может быть связано с поглощением белков плазмы на поверхности ниосомы, но в результате электростатических взаимодействий, но без разрушения везикул. Эта гипотеза подтверждается снижением ζ-потенциала после контакта везикул с сывороткой крови человека. Это явление происходит, когда ζ-потенциал достигает слегка отрицательных значений около области нейтральности, что делает систему нестабильной, и везикулы начинают агрегироваться.

Как и Tween20, везикулы DMPC увеличиваются в размере по сравнению с образцом до контакта. Однако это изменение оказалось незначительным, и значения размеров сохранялись ниже 280 нм (DMPC) или ниже 240 нм (DMPC + pHLIP).

Способность к высвобождению оценивалась для образцов, приготовленных с pHLIP и без него, по количеству кальцеина (гидрофильного зонда), высвобождаемого из везикул с течением времени.

Исследования проводились при температуре 37 ° C в течение 24 часов, подвергая очищенные образцы либо буфером HEPES, либо сывороткой крови человека. Как показано на рис. 4, профили высвобождения кальцеина оказались очень похожими как для Tween20, так и для Tween20-pHLIP в буфере HEPES или в сыворотке крови человека.

Профиль выпуска кальцеина. NioTween20 и NioTween20-pHLIP контактировали с буфером HEPES ( a ) или человеческой сыворотке ( b )

Высвобожденное количество кальцеина составляло от 30 до 50%, что указывает на отсутствие различий в способности высвобождения между образцами, приготовленными с pHLIP и без него.

Такие же результаты были получены для образцов Span и DMPC (данные не показаны).

Сравнимые профили высвобождения описаны для различных реагирующих на раздражители наноносителей, таких как термочувствительные кубосомы [40] или полимерные самособирающиеся наноносители (SAN) [41, 42].

В заключение следует отметить, что физико-химические различия, наблюдаемые с точки зрения микровязкости и текучести для образцов, приготовленных с pHLIP и без него (таблица 3), не влияют на их способность к высвобождению (рис. 4), согласно свидетельствам того, что введение DSPE-pHLIP молекулы влияют в основном на область головной группы. Эти данные согласуются с ранее опубликованными результатами, показывающими, что при нейтральном и высоком pH pHLIP связывается с поверхностью липосом, образованных 1-пальмитоил-2-олеоил- sn -глицеро-3-фосфохолин (POPC) и не вызывает слияния или утечки через мембрану.

Заключение

Это исследование подтверждает возможность получения везикул, декорированных pHLIP. Образцы стабильны, если хранятся при температуре 4 ° C не менее 3 месяцев и в присутствии сыворотки. Кроме того, предлагаемые нановекторы способны захватывать гидрофильный зонд и модулировать его высвобождение.

Везикулы pHLIP были полностью охарактеризованы, чтобы получить фундаментальное представление о свойствах наноносителей и облегчить рациональный дизайн чувствительных к кислотности нановекторов.

The pHLIP association is driven by the hydrophobic interaction of the conjugated DSPE C18-chains inserting in the hydrophobic region of the nanovector. The pHLIP peptide is anchored and lies in the external headgroup region, prone to interact with target membranes at acidic pH and/or to release the nanovector content after bilayer rearrangement in low pH environment.

According to these findings, proposed pHLIP decorated vesicles could be useful to obtain a prolonged (modified) release of biological active substances for targeting tumors and other acidic diseased tissues.

Сокращения

Chol:

Cholesterol

Cryo-TEM:

Cryo-transmission electron microscopy

DLS:

Динамическое рассеяние света

DMPC:

1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine

DPH:

Diphenylhexatriene

pHLIP:

pH (low) insertion peptide

SAXS:

Small angle X-ray scattering

Span20:

Sorbitan monolaurate

Tween20:

Polyoxyethylenesorbitan monolaurate