Синтез и исследование in vitro двухрежимного зонда, нацеленного на интегрин αvβ3

Фон

Инфильтрация злокачественной опухоли и отдаленные метастазы являются основной причиной неэффективности лечения. Процесс метастазирования злокачественной опухоли требует разрушения внеклеточного матрикса (ВКМ) и новой сосудистой сети опухоли [1]. Следовательно, неинвазивный мониторинг in vitro молекулярных маркеров, связанных с неоваскуляризацией опухоли, особенно важен для прогнозирования метастазов опухоли и ранней диагностики. Интегрин α _v β ₃ , широко изученный молекулярный маркер новой сосудистой сети опухоли, получил широкое внимание. Этот интегрин тесно связан с адгезией, пролиферацией и дифференцировкой эндотелиальных клеток сосудов во время неоваскуляризации опухоли [2].

Прогресс в области молекулярной визуализации сделал возможным неинвазивный мониторинг роста опухоли на молекулярном уровне. Исследования молекулярной визуализации целевых молекул, представляющих интерес, должны включать два основных элемента:(1) подходящие компоненты нацеливания и (2) компоненты сигнала, которые могут быть обнаружены методами визуализации. Интегрин α _v β ₃ , который специфически распознает и связывается с последовательностью аргинин-глицин-аспартат (Arg-Gly-Asp, RGD) в белках ЕСМ, активируется посредством конформационных изменений. Таким образом, последовательность RGD широко использовалась в синтезе нацеливающих маркеров опухоли в качестве важного компонента нацеливания [3]. Магнитно-резонансная (МРТ) визуализация стала одним из самых мощных диагностических инструментов молекулярной визуализации для мониторинга опухолей благодаря неионизирующему излучению, высокому разрешению мягких тканей и неограниченной глубине проникновения [4, 5]. Статистический анализ показал, что примерно 50% МРТ исследований требуют использования контрастных веществ для улучшения качества изображений [6, 7]. Флуоресцентная визуализация в ближнем инфракрасном диапазоне - это тип оптического изображения, а длина волны ближнего инфракрасного света, который является самым ранним обнаруженным невидимым светом, находится в диапазоне от 700 до 900 нм. Методы флуоресцентной визуализации в ближнем инфракрасном диапазоне позволяют хирургам визуализировать, очерчивать и резектировать опухоли во время операций [8, 9]. Однако с изменениями в спектре заболеваний человека одномодовая молекулярная визуализация не отвечает требованиям точной диагностики из-за высокого уровня ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Таким образом, методы молекулярной визуализации, основанные на интеграции нескольких режимов, станут новой тенденцией в развитии молекулярной визуализации [10].

В этом исследовании мы подготовили двухрежимный молекулярный зонд cRGD-Gd-Cy5.5, который можно использовать в гистологической и функциональной визуализации опухолей (схема 1). По сравнению с молекулярными зондами с Fe ₃ О ₄ в качестве сигнальной единицы [11, 12] cRGD-Gd-Cy5.5 отличался (а) высоким парамагнетизмом (семь неспаренных электронов вокруг Gd ^{3 +} ); (б) способность связываться с носителем с образованием стабильного хелатирующего агента, такого как Магневист, широко используемый в клинике; (c) высокое пространственное разрешение и более высокое разрешение изображения, чем у негативных контрастных агентов [13, 14]. Мы выбрали липосомы в качестве молекулы-носителя, которая связывает МР-контрастный агент с флуоресцентным контрастным агентом. Обычные фосфолипиды имеют две длинные гидрофобные углеводородные цепи и гидрофильную группу в их молекулярных структурах. При добавлении к воде или буферному раствору соответствующие количества молекул фосфолипидов принимают расположение в определенных направлениях, причем их гидрофильные группы обращены к водной фазе с обеих сторон, а гидрофобные углеводородные цепи обращены друг к другу, образуя бислой в липосомах. Циклические пептиды, нацеленные на RGD, и флуоресцентные молекулы Cy5.5 были конъюгированы с поверхностью липосом через введенный фосфолипид полиэтиленгликоля (PEG) с аминогруппами, и, наконец, ионы Gd были инкапсулированы в липосомы для создания целевого мультимодального молекулярного зонда. с желаемыми характеристиками с точки зрения структуры, состава, размера, формы, стабильности и МР-релаксации. Его цитосовместимость оценивалась с помощью анализа цитотоксичности и наблюдения за морфологией клеток. Наконец, был оценен потенциал cRGD-Gd-Cy5.5 для Т1-взвешенной МРТ и флуоресцентной визуализации раковых клеток in vitro.

Синтетический путь липосом, допированных Gd, с последующей конъюгацией RGD и Cy5.5 для биоприложений для высокочувствительного обнаружения интегрина α _v β ₃

Результаты

Характеристика нанозонда cRGD-Gd-Cy5.5

Раствор cRGD-Gd-Cy5.5 представлял собой бледно-розовую прозрачную жидкость без видимого осаждения после некоторого времени отстаивания, что свидетельствует о хорошей дисперсии. Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) выявила появление липосомального комплекса cRGD-Gd-Cy5.5 в виде сферической формы однородного размера без агрегации гранул или повреждения после отрицательного окрашивания 2% фосфовольфраматом натрия, как показано на рис. 1а. Распределение частиц по размерам было постоянным, в пределах от 50 до 80 нм, со средним размером частиц 60,08 ± 0,45 нм. Размер гидратированных частиц липосомального комплекса cRGD-Gd-Cy5.5, измеренный с помощью динамического светорассеяния (DLS), составлял 124,2 ± 0,215 нм (рис. 1b). Как показано на рисунке, наночастицы показали узкое распределение по размерам в воде и хорошую дисперсию. Поверхностный дзета-потенциал составлял 39,5 ± 1,65 мВ, показывая положительный поверхностный заряд, что согласуется с наличием аминогрупп на поверхности (рис. 1c).

Характеристики нанозонда CRGD-GD-CY5.5. а ПЭМ-изображения cRGD-Gd-Cy5.5 с малым увеличением. б Размер частиц определяли анализом размеров, и средний размер зонда составлял 124,2 нм. c Дзета-потенциал составляет около 39,5 мВ, видимая поверхность - электроположительная

Многофункциональный анализ на микропланшете показал, что холостые липосомы не имеют области поглощения УФ, а липосомы, связанные с флуоресцентным Cy5.5 в возбуждающем свете 600 нм, имеют очевидный пик поглощения при 685 нм (рис. 1a), что соответствует длине волны излучения флуоресцентного Cy5.5. . Флуоресцентные молекулы показали, что Cy5.5 был успешно связан. Результаты системы визуализации флуоресценции мелких животных показали, что под возбуждающим светом 600 нм конъюгированный с липосомами флуоресцентный Cy5.5 имел очевидную красную флуоресценцию, в то время как пустая липосома не имела сигнала флуоресценции (рис. 2b).

Флуоресцентные свойства нанозонда cRGD-Gd-Cy5.5. а Липосома, меченная флуоресценцией Cy5.5, была обнаружена многофункциональным анализатором ферментов, и был обнаружен пик излучения в видимой области при 670 нм при возбуждающем свете 600 нм. б Под возбуждающим светом 600 нм связанный с липосомами флуоресцентный Cy5.5 (слева) имеет очевидную люминесценцию, в то время как пустая липосома (справа) не имеет флуоресцентного изображения

МР-релаксометрия нанозонда cRGD-Gd-Cy5.5

Скорость релаксации r1 является важным параметром для оценки эффективности визуализации контрастных агентов T1 MR. Поэтому мы измерили время релаксации T1 зонда cRGD-Gd-Cy5.5 с разными концентрациями Gd. Как показано на рис. 3b, скорость релаксации r1 cRGD-Gd-Cy5.5 составляла 10,515 мМ ^-1 . s ⁻¹ после линейной аппроксимации намного выше, чем у клинического продукта Магневист (4,56 мМ ^-1 s ⁻¹ ). Высокая скорость релаксации r1 cRGD-Gd-Cy5.5 может быть результатом особой пространственной структуры липосом-носителей и эффекта усиления биологического сигнала липосом. По мере увеличения концентрации Gd cRGD-Gd-Cy5.5 увеличивал интенсивность сигнала MR (рис. 3a). Эти результаты продемонстрировали, что синтетический cRGD-Gd-Cy5.5 удовлетворяет потребности в высоком контрасте изображения при МРТ.

Релаксационные свойства нанозондов cRGD-Gd-Cy5.5. а T1 - взвешенные изображения (Siemens, Verio, 3.0T, MOLLI, последовательность:TR =5,8 мс, TE =3,66 мс, TI =16–3200 мс) этих частиц при различных концентрациях (Gd). б Подгоночные кривые концентрации Gd и времени релаксации; значение r1 cRGD-Gd-Cy5.5 составляло 10,515 мМ ^-1 s ⁻¹

Исследование цитотоксичности нанозонда cRGD-Gd-Cy5.5

Цитотоксичность cRGD-Gd-Cy5.5 in vitro оценивали с помощью анализа CCK-8, сравнивая с жизнеспособностью клеток в необработанной группе (100%). Все клетки показали жизнеспособность клеток более 70% в диапазоне протестированных концентраций Gd (50–400 мкМ) (рис. 4), что указывает на то, что этот молекулярный зонд имеет хорошую совместимость с клетками. Примечательно, что жизнеспособность клеток все еще была выше 70% даже после 24 часов инкубации с 400 мкМ Gd, концентрация существенно выше, чем дозировки, используемые in vitro и in vivo.

Тест на цитотоксичность. Жизнеспособность клеток аденокарциномы легких человека (A549), линии клеток карциномы носоглотки (SUNE-1-5-8F), эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC) и линии нормальных клеток груди (MCF10A), инкубированных с различными концентрациями cRGD-Gd- Cy5.5 в течение 24 часов

Иммунофлуоресцентный анализ окрашивания и проточной цитометрии интегрина αvβ3

Результаты иммунофлуоресценции показали, что экспрессия интегрина αvβ3 в клетках A549 и 5-8F локализована в клеточной мембране и цитоплазме. Интегрин клеток A549 в основном располагался в клеточной мембране, и интенсивность флуоресценции на поверхности клеток A549 была выше, чем у клеток SUNE-1-5-8F. Интенсивность флуоресценции клеток MCF-10A была чрезвычайно слабой, демонстрируя, что интегрин αvβ3 почти не экспрессировался на поверхности эпителиальных клеток молочной железы (фиг. 5a). Результаты проточной цитометрии показаны на рис. 5c. Уровни экспрессии интегрина αvβ3 ранжируются следующим образом:A549 (89,07%)> SUNE-1-5-8F (63,84%)> MCF-10A (1,56%), что указывает на то, что уровни αvβ3 в раковых клетках были значительно выше, чем в здоровых молочных железах. клетки железы.

Изображения клеток A549, SUNE-1-5-8F и MCF-10A, полученные с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM). а Клеточные иммунофлуоресцентные изображения интегрина αvβ3. Клеточная линия A549 и SUNE-1-5-8F экспрессируется в клеточной мембране, клетки MCF-10A почти не экспрессируют интегрин α _v β ₃ . б Клетки A549, SUNE-1-5-8F и MCF10A, инкубированные с cRGD-Gd-Cy5.5 при 200 мкг / мл ^-1 концентрация при 37 ° С в течение 1 ч. Количество зондов, связанных с клетками, согласуется с результатами клеточной иммунофлуоресценции. c Анализ проточной цитометрии для определения экспрессии интегрина αvβ3 в клетках A549, SUNE-1-5-8F и MCF-10A

Использование сотовой связью cRGD-Gd-Cy5.5

По результатам иммунофлуоресцентного окрашивания клетки A549 и 5-8F, инкубированные с cRGD-Gd-Cy5.5, использовали в качестве экспериментальных групп, а клетки MCF-10A, инкубированные с cRGD-Gd-Cy5.5, использовали в качестве экспериментальных групп. контрольная группа. После инкубации с cRGD-Gd-Cy5.5 в мембране клеток A549 и 5-8F наблюдались сигналы красной флуоресценции, причем интенсивность сигнала в клетках A549 была выше, чем в клетках SUNE-1-5-8F (рис. 5б). Этот результат согласуется с экспрессией интегрина αvβ3, обнаруженной с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания. В мембране клеток MCF-10A в контрольной группе почти не было обнаружено сигнала красной флуоресценции.

МРТ и флуоресцентная визуализация in vitro

Основываясь на высокой скорости релаксации r1 и хорошей совместимости с клетками, cRGD-Gd-Cy5.5 использовали в качестве положительного контрастного агента для МР-визуализации раковых клеток in vitro. Как показано на фиг. 6a, b, цвет T1-взвешенных МР-изображений постепенно становился ярче, указывая на то, что интенсивность МР-сигнала клеток A549, обработанных cRGD-Gd-Cy5.5, увеличивалась с более высокими концентрациями Gd. Разница во времени релаксации T1 между двумя группами была статистически значимой, на что указывает t тест для двух независимых выборок ( p <0,05). Эти данные предполагают, что синтетический cRGD-Gd-Cy5.5 имеет потенциал для использования в качестве положительного контрастного агента при МР-визуализации раковых клеток in vitro. Точно так же система флуоресценции небольших животных показала соответствующее увеличение интенсивности флуоресценции при увеличении концентрации зонда (фиг. 6c). Исходя из сигнала изображения и конкретных данных, эффект визуализации целевой группы (cRGD-Gd-Cy5.5) был лучше, чем у нецелевой группы (Gd-Cy5.5).

Магнитно-резонансная и флуоресцентная томография клеток. а Клетки инкубировали с клетками A549 в течение 2 ч в соответствии с концентрациями Gd:0, 0,005, 0,01, 0,02, 0,04 и 0,08 (мМ). Gd-Cy5.5 использовали в качестве контрольной группы. б Время релаксации T1 соответствующего магнитно-резонансного изображения. c Система визуализации мелких животных в реальном времени

МРТ и флуоресцентная визуализация in vivo

Изображения МРТ, полученные до введения контрастных веществ, не показали значительных различий сигналов между опухолями и другими периферическими органами / тканями. Через 5 минут после инъекции CRGD-Gd-Cy5.5 интенсивность сигнала на участках опухоли начала усиливаться, но стабильная гиперинтенсивность сохранялась через 6 часов после инъекции. В опытной группе усиленная паренхима опухоли наблюдалась с 30 мин, а усиление усиливалось через 2 ч (рис. 7а). В группе с блокировкой рецепторов, однако, было обнаружено только легкое усиление на краях опухолей, а степень усиления ослабла через 2 часа и уже исчезла (рис. 7а). На изображениях флуоресценции интенсивность флуоресценции в целевой группе постепенно увеличивалась с 30-й минуты, но все еще оставалась высокой к шестому часу (рис. 7b), что указывает на расширение кровообращения и эффективную концентрацию CRGD-Gd-Cy5.5 в опухоли. В группе с блокировкой рецептора не наблюдали специфической концентрации зонда ни в одной из тестируемых временных точек. На шестом часу наблюдалась интенсивная флуоресценция двусторонней почки (рис. 7b). Мы пришли к выводу, что метаболический путь CRGD-Gd-Cy5.5 может заключаться в прохождении через почечную систему.

МРТ и флуоресцентная визуализация моделей опухоли с подкожной ксенотрансплантацией карциномы носоглотки бестимусных мышей. а Голых мышей анестезировали и визуализировали с помощью 3,0-Т МРТ-сканера перед инъекцией и через 0,5, 2 и 6 часов после инъекции. б Голых мышей анестезировали и визуализировали с помощью системы флуоресцентной визуализации через 0,5, 2 и 6 часов после инъекции

Обсуждение

Интегрин αvβ3 высоко экспрессируется не только в эндотелиальных клетках новой сосудистой сети опухоли, но и на поверхности различных опухолевых клеток, таких как злокачественная меланома, злокачественная глиома, рак простаты, рак легких и клетки рака груди [15], в то время как αvβ3 не экспрессируется или экспрессируется на низких уровнях в обычных эпителиальных клетках и зрелых эндотелиальных клетках сосудов. Основываясь на вышеуказанных свойствах, интегрин αvβ3 стал идеальной мишенью для мониторинга метастазов опухоли in vivo [16]. Однако современные методы измерения уровней экспрессии интегрина αvβ3 все еще имеют проблемы неинвазивности, повторяемости и своевременности визуализации, которые еще предстоит решить. Ввиду вышеупомянутых объективных проблем в этом исследовании был синтезирован двухрежимный молекулярный зонд для динамического мониторинга экспрессии интегрина αvβ3 в реальном времени, что косвенно позволило достичь цели прогнозирования и мониторинга метастазов опухоли.

Контрастные вещества можно разделить на два типа по механизму МР-визуализации:соединения Gd (T1-положительный контрастный агент) и наночастицы парамагнитного оксида железа (T2-отрицательный контрастный агент). По сравнению с другими контрастными веществами, соединения Gd имеют беспрецедентные преимущества в клинической практике [17]. Ион Gd, который является суперпарамагнитным материалом, обеспечивает сигнал высокой интенсивности на T1-взвешенных изображениях. Gd также может связываться с различными веществами с образованием стабильных комплексов с высоким пространственным разрешением и высоким отношением сигнал / шум. Однако каждый тип контрастного вещества имеет свои ограничения (а именно, короткое время циркуляции крови у контрастных агентов T1 и артефакты магнитной восприимчивости контрастных агентов T2) [18,19,20,21]. Традиционные соединения Gd имеют следующие ограничения. (1) Традиционные хелаты Gd не имеют целевого эффекта. (2) Интенсивность сигнала хелатных контрастных агентов Gd ниже, чем у сверхмалых суперпарамагнитных частиц оксида железа (USPIO) при той же концентрации. Для решения вышеуказанных проблем ионы Gd связываются с макромолекулярными структурами (такими как липосомы, дендритные молекулы и декстран) для усиления эффекта релаксации T1 [22], а затем комплекс связывается с лигандом опухолевых мишеней для получения молекулярных зондов. и добиться визуализации, нацеленной на опухоль [23]. В этом исследовании липосомы были выбраны в качестве молекулы-носителя, которая связывает МР-контрастные агенты с флуоресцентными контрастными агентами. Специальная пространственная структура липосом имеет эффект усиления биологического сигнала и эффективно улучшает концентрацию ионов Gd в местных тканях, тем самым увеличивая интенсивность сигнала МР. Чжоу и др. [24] использовали связанные с β-циклодекстрином полиэдрические олигомерные наночастицы силсесквиоксана (POSS) в качестве носителя для связывания RGD с соединениями Gd для успешного получения молекулярного зонда cRGD-POSS-βCD- (DOTA-Gd) со скоростью релаксации T1, равной 9,50 мМ ⁻¹ S ^-1 . Было обнаружено, что комплекс липосома-cRGD-Gd-Cy5, полученный в этом исследовании, имеет скорость релаксации T1 10,515 мМ ^-1 S ^-1 , что более чем в два раза превышает скорость релаксации T1 агента Gd, который в настоящее время используется в клинической практике (Magnevist), и этот комплекс также продемонстрировал отличные свойства МРТ.

Нанозонд, изготовленный нашей группой, имеет одинаковый размер, правильный внешний вид и хорошую диспергируемость. Дзета-потенциал отражает стабильность молекулярного зонда, а более высокое положительное или отрицательное значение дзета-потенциала связано с более стабильной системой и меньшей вероятностью агрегации. Как правило, молекулы с дзета-потенциалами выше + 30 мВ или ниже -30 мВ считаются хорошо стабильными. Дзета-потенциал на поверхности зондирующей частицы, полученный в этом исследовании, составил + 39,5 ± 1,65 мВ, что немного ниже + 30 мВ. Тем не менее, при ПЭМ агрегации не наблюдалось.

Агенты Gd являются наиболее широко используемыми контрастными веществами для МРТ в современной клинической практике, и их биобезопасность нельзя игнорировать. Guo et al. [25] обнаружили, что комплекс Gd, связанный с дендритной гиалуроновой кислотой, является очень безопасной и эффективной микрочастицей в качестве контрастного агента МРТ, с высокой чувствительностью и низким остаточным присутствием в организме человека. Благодаря изучению цитотоксичности сконструированного молекулярного зонда in vitro было продемонстрировано, что этот молекулярный зонд обладает низкой цитотоксичностью и высокой биобезопасностью для опухолевых клеток, а также неопухолевых клеток (эпителиальных клеток и эндотелиальных клеток сосудов). Мы считаем, что липосомы обладают хорошей биосовместимостью, а низкая биотоксичность может быть преимуществом липосом, инкапсулирующих ионы Gd.

Основываясь на предыдущих исследованиях [26,27,28], наша группа выбрала линию клеток аденокарциномы легкого A549 с высокой экспрессией интегрина αvβ3 для использования в экспериментальной группе с инновационным добавлением клеток карциномы носоглотки SUNE-1-5-8F. линия в экспериментах in vitro по нацеливанию на клетки; эпителиальные клетки молочных желез, практически не содержащие экспрессии интегрина αvβ3, были включены в группу отрицательного контроля. Молекулярный зонд хорошо связывался с клеточной мембраной клеток аденокарциномы легкого A549 и клеток карциномы носоглотки SUNE-1-5-8F, но не связывался с клетками MCF-10A, что указывает на то, что зонд обладает превосходной способностью к нацеливанию на молекулы, что подтверждено результатами иммунофлуоресцентного анализа. Результаты МРТ дополнительно подтвердили свойство нацеливания липосомного молекулярного зонда cRGD-Gd-Cy5.5 в МРТ с сигналами более высокой интенсивности, чем у ненаправленного контрастного агента (Gd-Cy5.5) в опухолевых клетках. Эксперименты in vivo подтверждают, что зонды могут сохранять стабильность в сыворотке и устойчиво воздействовать на участки опухоли в течение как минимум 6 часов. Результаты исследований in vitro обеспечивают последующие исследования in vivo молекулярного зонда на метастатической модели карциномы носоглотки у голых мышей.

Выводы

Таким образом, возможен способ получения двухрежимного зонда cRGD-Gd-Cy5.5, нацеленного на интегрин αvβ3, и этот зонд имеет желаемую стабильность и биобезопасность, а также высокую скорость релаксации T1. Зонд продемонстрировал сильный целевой эффект в отношении клеток с высокой экспрессией интегрина αvβ3, что заложило прочную основу для неинвазивного, эффективного и динамического мониторинга метастазов опухоли в реальном времени на анатомическом уровне и на уровне молекулярного метаболизма с помощью магнитно-резонансной / флуоресцентной молекулярной визуализации. in vivo.

Методы

Синтез cRGD-Gd-Cy5.5

К 20 мл хлороформа добавляли 70 мг лецитина, 20 мг холестерина и 210 мг DSPE-PEG2000-NH, и смесь помещали в ультразвуковой очиститель для полного растворения веществ (на что указывает прозрачный раствор без гранулированные вещества). Затем раствор помещали в колбу грушевидной формы для роторного испарения на водяной бане при 60 ° C до образования сотовой пленки (без жидких остатков). Гексагидрат трихлорида Gd (10 мг) точно взвешивали и растворяли в карбонатном буфере при pH 8,5 с получением прозрачного раствора, который затем смешивали с указанной выше сотовой пленкой для гидратации при 50 ° C в течение 1 часа; за этим этапом последовали диспергирование и уточнение с помощью ультразвукового датчика в ультразвуковом жидкостном процессоре (VCX 750, Sonics, США). Наконец, смесь собирали и пропускали через фильтр 0,22 мкм и подвергали ультрафильтрации с помощью ультрафильтрационной трубки 10 кДа для удаления свободного трихлорида Gd и получения липосом, несущих трихлорид Gd, которые затем хранили при 4 ° C.

Затем циклический пептид RGD был присоединен к флуоресцентной молекуле Cy5.5. Циклический пептид RGD (5 мг) растворяли в 1 мл разбавленного буфера соляной кислоты при pH 5,0 и 1 мг гидрохлорида 1-этил-3- (3-диметиламинопропил) карбодиимида (EDC) и 0,5 мг N -гидроксисукцинимид (NHS) были добавлены и затем активированы при комнатной температуре в течение 30 минут в осцилляторе при постоянной температуре. Затем активированную молекулу циклического пептида RGD смешивали со 100 мкг флуоресцентной молекулы Cy5.5 и липосомой, и измеряли pH, равный 8,4, с использованием прецизионной тестовой бумаги. Затем смесь инкубировали при комнатной температуре в шейкере в течение 4 часов; за этим этапом последовало удаление непрореагировавшего циклического пептида RGD и флуоресцентной молекулы Cy5.5 с помощью ультрафильтрационной трубки 10 кДа.