Противомикробные и цитотоксические эффекты синтезированных наночастиц серебра из экстракта кожуры Punica granatum

Фон

В последние несколько десятилетий растет количество исследований в области нанотехнологий, особенно связанных с зеленым синтезом и характеристикой наночастиц, поскольку наночастицы размером менее 100 нм являются идеальными агентами для доставки лекарств и биомедицинских приложений [1]. Синтез наночастиц играет важную роль в нескольких областях, включая нанотехнологию, биотехнологию, химическую обработку, физическую методологию, системную инженерию, молекулярные двигатели, нанокристаллы и нанобиоматериалы [2]. Сегодня существует три метода производства наночастиц:химический, физический и «зеленый», при этом зеленый путь предполагает использование биологических восстановителей, включая экстракты растений и микробные фильтраты. Первые два метода часто являются дорогостоящими и генерируют токсичные побочные продукты, но метод зеленого наносинтеза признан недорогим и экологически чистым процессом [3,4,5].

В зеленом синтезе НЧ компоненты растений, включая белки, ферменты и углеводы, используются для создания наночастиц, которые могут легко взаимодействовать с целевыми биомолекулами [6]. Такой подход к синтезу наночастиц серебра может сыграть важную роль в будущем лечении различных форм рака или других заболеваний, которые можно контролировать с помощью фито-нанотехнологий [7, 8]. Грамотрицательные бактерии, такие как Escherichia coli , синегнойная палочка и Proteus vulgaris и грамположительные патогены, такие как Staphylococcus aureus и С. эпидермис , несут ответственность за большинство внутрибольничных инфекций [9]. Действительно, хирургические инфекции, включая пневмонию и инфекции кровотока, также возникают из-за присутствия грамположительных и грамотрицательных бактерий [10]. Опосредованный растениями синтез AgNP может помочь в разработке эффективных антибактериальных агентов против микробных патогенов, имеющих значение для общественного здравоохранения. Недавно было отмечено, что синтезированные AgNP могут иметь синергетические отношения с антибиотиком левофлоксацином, увеличивая общую антимикробную активность [11]. Многие исследователи сообщают, что синтезированные AgNP обладают хорошо известными антимикробными свойствами против грамположительных и грамотрицательных патогенов, а также обладают цитотоксическим действием на различные раковые и нормальные клеточные линии [12,13,14]. Кроме того, AgNP высокоэффективны из-за высокого отношения площади поверхности к объему, могут легко разрушаться и обладают способностью проникать в бактериальные клетки по сравнению с одними ионами серебра [13].

Настоящее исследование сосредоточено на зеленом синтезе AgNP с использованием водного экстракта Punica granatum кожуре и при исследовании их антимикробных свойств с использованием планшетов для штриховки и измерений минимальной ингибирующей концентрации (МИК) через 24 часа инкубации при 37 ° C. Грамотрицательные бактерии E. coli (ATCC 25922), стр. aeruginosa (ATCC 27584), стр. vulgaris (ATCC 8427) и Salmonella typhi . (ATCC 14028), а также грамположительные бактерии Staphylococcus aureus (ATCC 29213), С. эпидермис (MTCC 3615) и К. пневмония были изучены для проверки потенциального ингибирования роста синтезированными AgNP. Кроме того, цитотоксические эффекты на линию клеток рака толстой кишки (RKO:ATCC® CRL-2577 ™) были протестированы и показали уровень жизнеспособности клеток 56% на 3-й день и 61% на 5-й день с дозой 12,5 мкг AgNP.

Методы

Приготовление экстракта кожуры

Один килограмм плодов саудовского граната ( Punica granatum (Выращивается в регионе Таиф Королевства Саудовская Аравия) был приобретен в супермаркете в Эр-Рияде, Саудовская Аравия. Плоды несколько раз промывали водопроводной водой, а затем бидистиллированной водой (DDH ₂ О). После мытья кожуру осторожно сняли. Кожуру граната тщательно промыли DDH ₂ . O, чтобы избежать загрязнения поверхности, и дать полностью высохнуть при комнатной температуре. Наконец, кожура была измельчена до мелкого помола. Десять граммов тонкого порошка замачивали в 100 мл DDH ₂ . O в течение 24 ч при комнатной температуре. Полученную смесь фильтровали с использованием фильтровальной бумаги Whatman № 1 для получения водного экстракта. Весь процесс проходил в стерильных условиях.

Процесс синтеза AgNP

Нитрат серебра (AgNO ₃ ; 0,1 мМ) смешивали с 250 мл DDH2O. Затем добавляли десять миллилитров водного экстракта кожуры граната и раствор тщательно перемешивали в инкубаторе со встряхиванием в течение 5 мин. Было обнаружено, что реакционная смесь меняет свой цвет с бесцветного раствора на раствор коричневого цвета через 24 часа, что указывает на восстановление ионов серебра до наночастиц серебра. Затем раствор наночастиц центрифугировали при 15000 об / мин в течение 15 мин, и процесс повторяли четыре раза. Наконец, были собраны очищенные AgNP, и были выполнены дополнительные анализы для анализа характеристик и биологической активности синтезированных NP. Избыток экстракта кожуры хранили при 4 ° C для дальнейшего анализа.

Характеристика AgNP

Восстановление ионов серебра водным экстрактом кожуры граната контролировали с помощью спектрофотометра Perkin Elmer Lambda 950 UV / Vis / NIR через 24, 48 и 72 ч после начала реакции от 200 до 800 нм и с разрешением 1 нм. . Картины XRD были получены с помощью рентгеновского дифрактометра PANalytical, способного сканировать скорости в диапазоне от 20 до 50 с 2 θ и были использованы для определения кристаллической структуры наночастиц серебра.

Топографический анализ поверхности и анализ состава AgNP выполняли с использованием ПЭМ-анализа, выполненного на JEOL JEM-1230 (JEOL, Токио, Япония) и JSM 6380 LA SEM с разрешением 3,0 нм. Элементный анализ AgNP был выполнен методом энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии (EDX) с использованием серии JED 2200 (Jeol).

Антибактериальные исследования

Приготовление бактериальной суспензии

Бактериальные штаммы E. coli (ATCC 25922), стр. aeruginosa (ATCC 27584), стр. vulgaris (ATCC 8427), С. тиф (ATCC 14028), С. золотистый (ATCC 29213), С. эпидермис (MTCC 3615) и К. пневмония были получены из больницы King Khalid Hospital, Эр-Рияд, Королевство Саудовская Аравия. Быструю идентификацию бактериальных клеток проводили по ранее опубликованным методикам [15]. Все идентифицированные культуры переносили на агаровые среды и хранили при -20 ° C до тех пор, пока они не понадобились для исследования. На этом этапе каждый штамм бактерий инокулировали в стерильный питательный агар и инкубировали при 37 ° C в течение 24 часов. Подвеска (10 ⁶ КОЕ / мл) получали путем переноса петли посевного материала из 24-часовой инкубированной культуры в 5 мл питательного бульона и ее инкубирования при 37 ° C в течение 2 часов.

Анализы на антимикробные препараты

Анализы антимикробной активности проводили с использованием метода диффузии в лунках агара [16]. Стерильный тампон увлажняли свежей бактериальной суспензией и наносили на твердую стерильную чашку с агаром Мюллера-Хинтона. На чашке с агаром делали лунки, используя пробоотборник. Разные концентрации (25, 50, 75 и 100 мкл) синтезированной суспензии наночастиц заливали в каждую последующую лунку. Все планшеты инкубировали при 37 ° C в течение 24 часов. Зону ингибирования измеряли (мм) вокруг каждой лунки в каждом инкубируемом планшете. Для каждого эксперимента было выполнено три повтора [17].

Анализ пролиферации клеток

Влияние AgNP на клеточную пролиферацию оценивали с помощью анализа Alamar Blue, как описано ранее [12].

Вкратце, 0,005 × 10 ⁶ клетки / лунку высевали в 96-луночные планшеты с различными концентрациями (100–0,3 мкг / мл) AgNP и инкубировали в течение 2–5 дней при 37 ° C. В среду DMEM добавляли 4500 мг / л d-глюкозы, 4 мМ l-глутамина, 110 мг / л пирувата натрия, 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1 × пенициллин-стрептомицин и заменимые аминокислоты. (все приобретено у Gibco-Invitrogen, США). Контрольные лунки обрабатывали только средой, и пролиферацию клеток измеряли на 3 и 5 день. В эти временные точки в каждую лунку добавляли Alamar Blue (1:10) и планшеты инкубировали при 37 ° C в течение 4 часов.; затем планшеты считывали с помощью спектрофотометрического ридера для микропланшетов (Biotek Synergy 2; Biotek Instruments, США) и записывали единицы относительной флуоресценции (RFU).

Анализ апоптоза / некроза клеток

Для определения апоптоза / некроза клетки обрабатывали AgNP в различных концентрациях (25–1,5 мкг / мл). На 5 день клетки окрашивали двойным флуоресцентным окрашивающим раствором (1 мкл), содержащим 100 мкг / мл AO (акридиновый оранжевый) и 100 мкг / мл EtBr (бромид этидия) (AO / EtBr, Sigma, Сент-Луис, Миссури). ). Окрашенные клетки обрабатывали раствором красителя AO / EtBr (1:100) в течение 1 мин и наблюдали с помощью флуоресцентного микроскопа Nikon Eclipse Ti. Результаты сравнивали с экспериментальным контролем. AO / EtBr, комбинация двух красителей, помогает визуализировать клетки с аберрантной организацией хроматина. Дифференциальное поглощение AO / EtBr позволяет идентифицировать жизнеспособные и нежизнеспособные клетки. В частности, АО использовался для визуализации количества клеток, подвергшихся апоптозу.

Статистический анализ

Статистический анализ и построение графиков были выполнены с использованием программного обеспечения Microsoft Excel 2010 и GraphPad Prism 6.0 (GraphPad, Сан-Диего, Калифорния, США). P значения были рассчитаны с использованием односторонних множественных сравнений ANOVA. Анализ антимикробных данных для различных концентраций был протестирован с уровнем значимости P <0,05.

Результаты и обсуждение

AgNP были успешно синтезированы с использованием водного экстракта кожуры граната в качестве источника восстановителя. На рис. 1а показан раствор 0,1 мМ нитрата серебра в 250 мл DDH ₂ . O сделать бесцветный раствор. Затем добавляли 10 мл водного экстракта кожуры и хорошо перемешивали, и реакционная смесь медленно меняла цвет на темно-коричневый в течение 24 часов, как показано на фиг. 1b. Об изменении цвета, наблюдаемом во время синтеза AgNP, сообщалось для аналогичных реакций при использовании нескольких типов экстрактов частей растений, таких как листья, цветы, кожура, семена и плоды. Изменение цвета произошло из-за AgNO ₃ взаимодействуя с растительными источниками и восстанавливаясь от нитрата серебра до элементарного серебра [18,19,20,21,22].

а 0,1 мМ нитрата серебра. б Цвет меняется после P. granatum добавлен экстракт кожуры

На рис. 2 показан УФ-видимый спектр AgNP, синтезированных с использованием водного экстракта кожуры граната. Как показано на фиг. 2, полоса поглощения имеет пик при 378 нм при времени реакции 24, 48 и 72 часа с интенсивностями 0,96, 1,08 и 1,16 соответственно. Интенсивность возрастала со временем, так как у реакции было больше времени, что приводило к более высоким концентрациям AgNP. Данные поверхностного плазмонного резонанса показали, что увеличение концентрации AgNP приводит к увеличению пиков AgNP, что совпадает с увеличением количества восстановленного серебра с течением времени. Как AgNO ₃ прореагировала с образованием AgNP из-за высвобождения электронов из экстракта граната, началась сопутствующая реакция по окислению аскорбатных радикалов. Аналогичный спектр поглощения в УФ-видимой области наблюдался в другом исследовании, в котором производились AgNP из экстракта кожуры граната с пиком поглощения при 371 нм [23].

Спектры поглощения в УФ и видимой областях синтезированных AgNP через 48-72 ч с временными интервалами

Картина XRD синтезированных зеленым светом AgNP показана на рис. 3. Шесть интенсивных дифракционных пиков наблюдаются при 2 θ значения в диапазоне от 0 до 90, что указывает на то, что мы можем сопоставить плоскости 111, 200, 220 и 311 граненого куба с центральным ионом Ag. Спектр XRD свидетельствует о том, что синтезированные AgNP сформировали кристаллическую структуру. Этот результат согласуется с диаграммами XRD, ранее опубликованными в базе данных JCPDS (№ 04-0783). Наблюдаемые неидентифицированные кристаллические пики (*) соответствуют оксидам серебра [24]. ПЭМ-изображение 0,1 мМ НЧ водной кожуры граната показано на фиг. 4. Это изображение показывает, что частицы имели сферическую форму с диаметром в диапазоне от 20 до 40 нм, со средним размером частиц 26,95 нм. Аналогичные сообщения были сделаны относительно наносинтеза НЧ с использованием Actinidia deliciosa экстракт плодов [25]. СЭМ-наблюдения синтезированных AgNP (рис. 5) показывают равномерное распределение наночастиц серебра на поверхности клеток кожуры граната. Из этого изображения было определено, что наночастицы имеют сферическую форму с диаметром от 20 до 40 нм, что аналогично предыдущему отчету о AgNP сферической формы с диаметром от 34 до 50 нм, полученных с использованием Raphanus sativus Экстракт кожуры L. [26].

Рентгенограмма синтезированных AgNP из P. granatum экстракт кожуры

ПЭМ-изображение синтезированных AgNPs из P. granatum экстракт кожуры

СЭМ-изображение синтезированных AgNPs из P. granatum экстракт кожуры

В фитосинтезе наночастиц серебра с использованием экстракта кожуры граната, представленного здесь, размер полученных наночастиц является весьма перспективным для доставки лекарств. Сообщается, что размер наночастиц менее 100 нм играет роль в разработке интеллектуальных систем, повышая терапевтическую ценность и эффективность визуализации, а также доставку лекарств в определенные ткани для обеспечения терапии с контролируемым высвобождением [27]. Размер и форма наночастиц влияют на биодоступность лекарства в тканях-мишенях. Сообщается, что наночастицы размером 100 нм демонстрируют поглощение в 2,5 раза больше, чем частицы диаметром 1 мкм [28, 29]. Размер наночастиц играет ключевую роль в функциях частиц, таких как деградация, сосудистая динамика, нацеливание, клиренс и механизмы захвата [30]. Кроме того, нанокристаллическая природа синтезированных AgNP улучшает биораспределение и фармакокинетику, как сообщалось [31, 32]. Утилизация биоотходов граната будет новым подходом к утилизации отходов, как сообщалось ранее [33].

Данные исследования EDX предоставили качественный и количественный анализ элементов, обнаруженных в синтезированных наночастицах, как показано на рис. 6. Исследование EDX предоставило элементарную разбивку содержания синтезированных наночастиц и оценило, что наночастицы состоят на 70%. Ag по весу. Другие элементы и связи, идентифицированные в результатах, включали C-K, O, C-U, Cu и K, каждый из которых соответствовал небольшому проценту от общей массы. Отчет EDX свидетельствует о том, что низкая концентрация 0,1 мМ AgNO ₃ привело к большому количеству синтезированных AgNP. Аналогичные результаты были получены для 0,3 мМ AgNO ₃ . который выливали в дистиллированную воду на 3 часа и нагревали до 300 ° C, а для 1, 2 и 3 г экстракта кожуры граната смешивали с 30 мл дистиллированной воды и нагревали до 80 ° C [34].

EDX-изображение синтезированных AgNP из P. granatum экстракт кожуры с количественным анализом

Антибактериальные свойства синтезированных гранатом AgNP были исследованы с использованием образцов 25, 50, 75 и 100 мкг / мл против грамположительных и грамотрицательных бактерий с помощью теста диффузии в лунках агара. Чашки агара с грамотрицательными бактериями E. coli , С. тиф , и P. aeruginosa а зоны ингибирования показаны на рис. 7а – в. Низкие концентрации синтезированных гранатом AgNP (25 и 50 мкл) показали ингибирующую активность против P. aeruginosa и Э. coli но не против С. тиф. Ранее сообщалось о подобных антимикробных эффектах продуктов из граната, при этом наиболее сильное ингибирование наблюдалось для E. coli , С. золотистый , и П. aeruginosa [35,36,37].

Антимикробные эффекты и зона ингибирования AgNP грамотрицательных возбудителей ( a - c )

Антимикробные эффекты и зона ингибирования AgNP грамположительных патогенов ( d - е )

На рис. 8a – c показана антимикробная активность синтезированных AgNP против грамположительных патогенов K. пневмония , С. золотистый , и С. эпидермис . Противомикробная активность наблюдалась даже при низких концентрациях AgNP (25 и 50 мкл) для K. pneumoniae, с зонами ингибирования 9 и 14 нМ соответственно и против S. золотистый , с зонами ингибирования 6 и 14 нм соответственно. Более ранние исследования также подтвердили ингибирование роста грамположительных бактерий, обработанных синтезированными НЧ [35,36,37,38]. Антибактериальная активность, оцененная после воздействия синтезированных AgNP, показала зоны ингибирования в диапазоне от 7 до 21 мм. На рисунке 9 представлены ингибирующие эффекты различных концентраций (от 25 до 100 мкл) P. granatum очистить AgNPs от E. coli , П. aeruginosa , С. тиф , К. пневмония , С. золотистый , и С. эпидермис . Даже при низких концентрациях AgNP хорошая антибактериальная активность наблюдалась для всех микробов, кроме S. тиф , как сообщалось ранее [38].

Для анализа цитотоксических эффектов AgNP использовали линию клеток рака толстой кишки (RKO:ATCC® CRL-2577 ™). На 3-й день мы обнаружили жизнеспособность 56% при обработке 12,5 мкг и жизнеспособность 61% на 5-й день. Общее значительное снижение пролиферации наблюдалось при> 12,5 мкг (рис. 10a), и это было стабильно на день 5. Кроме того, изображения, окрашенные AO / EtBr, подтвердили снижение пролиферации путем визуализации колоний и количества клеток (фиг. 10b). Интересно, что мы могли наблюдать клетки с перинуклеарными цитоплазматическими вакуолями при 12,5 мкг (рис. 10b, c); этот процесс может быть путем деградации лизосом в процессе аутофагии для усиления запрограммированной гибели клеток. Однако необходимы дальнейшие исследования, чтобы подтвердить влияние AgNP на функции аутофагии. В нашем предыдущем исследовании AgNP, синтезированных с использованием Pimpinella anisum семян мы также обнаружили, что 12 мкг AgNP были токсичны для клеток HCT116, усиливая апоптоз или некроз [12]. Сообщалось также, что низкая концентрация AgNPs может вызывать апоптоз [39]. Текущие эксперименты с AgNPs, синтезированными с Punica granatum экстракт кожуры также показал токсичность 55–62% при содержании 12,5 мкг. Более того, окрашивание AO / EtBr показало четкую картину запрограммированной гибели клеток через аутофагию.

Антимикробная активность AgNP в отношении грамотрицательных и грамположительных патогенов

Цитотоксичность AgNP. а Анализ пролиферации и жизнеспособности клеток на клетках RKO. Односторонние множественные сравнения ANOVA, *** P <0,0005. б Анализ апоптоза / некроза на клетках RKO. c Клетки RKO, подвергшиеся воздействию различных доз AgNP

Выводы

Результат настоящего исследования показал, что экстракт кожуры граната является хорошим восстанавливающим агентом для синтеза наночастиц серебра с диапазоном размеров 20-40 нм (средний размер 26,95 нм), что является идеальной предпосылкой для эффективной доставки лекарств и повышения биодоступности при определенных условиях. целевой сайт. Антибактериальная активность синтезированных AgNP на тестируемых организмах, даже при низких концентрациях AgNP (25–100 мкл), дополнительно подтверждает антибиотическую эффективность синтезированных зеленым AgNPs для разработки новых антибактериальных агентов для лечения против грамотрицательных и грамотрицательных бактерий. -положительные возбудители. Кроме того, наблюдаемые цитотоксические эффекты AgNP на клеточные линии рака толстой кишки и снижение пролиферации клеток при уровне дозы> 12,5 мкг дополнительно способствуют использованию AgNP в качестве средства лечения опухолей первой линии.

Сокращения

EDX:

Энергодисперсионная рентгеновская спектроскопия

SEM:

Сканирующий электронный микроскоп

ТЕМ:

Просвечивающая электронная микроскопия

XRD:

Рентгеновская дифракция