Доставка модифицированных магнитных наночастиц Fe3O4 для CpG ингибирует рост опухоли и спонтанные метастазы в легкие для усиления иммунотерапии

Фон

Злокачественные опухоли являются одним из основных заболеваний, угрожающих здоровью и жизни человека, и частота возникновения опухолей постоянно растет [1, 2]. К сожалению, результаты традиционных методов лечения, таких как лучевая терапия, химиотерапия и хирургия злокачественных опухолей, не были особенно эффективными. В отличие от химиотерапии и лучевой терапии, которые нацелены на гибель быстро пролиферирующих клеток, иммунотерапия предназначена для усиления собственной системы иммунной защиты хозяина для нацеливания и уничтожения опухолевых клеток.

Примечательно, что иммунотерапевтические CpG широко изучались на предмет их эффективности в профилактике и регрессе опухолей [3]. Несмотря на обнадеживающие клинические данные, использование свободного CpG все же имеет ряд недостатков. Во-первых, CpG подвержены расщеплению, опосредованному нуклеазами, в биологических условиях. Во-вторых, они не обладают специфичностью к клеткам-мишеням после системного введения и имеют плохое клеточное поглощение. Поэтому, скорее всего, потребуются доработки. Поскольку TLR9 располагаются на эндосомах, мы предположили, что плохое поглощение CpG ассоциированными с опухолью воспалительными клетками вызывает слабый клинический ответ. Таким образом, методы, которые усиливают интернализацию CpG, могут усиливать его иммуностимулирующий ответ.

За исключением недостатков свободного CpG, способ введения CpG влияет на противоопухолевую способность и токсичность. Свободный CpG и другие стабильные фосфоротиоатные олигонуклеотиды, вводимые путем внутривенной инъекции, быстро выводятся из организма и имеют широкое распространение в тканях [4, 5]. Кроме того, системно вводимый свободный CpG может вызывать неспецифическую иммунную активацию, приводя к серьезным побочным эффектам, включая истощение иммунных клеток, разрушение лимфоидных фолликулов, повреждение печени и обострение аутоиммунных заболеваний [6,7,8]. Эти свойства могут объяснить неэффективность системного введения свободного CpG у людей [9]. Предыдущие исследования показали, что внутриопухолевая инъекция CpG оказывает сильное противоопухолевое действие, «фокусируя» иммунную стимуляцию на участках опухоли [10]. Как контролировать время удерживания CpG, введенного в опухоль, является проблемой.

Используя toll-подобный рецептор-9, дендритные клетки, макрофаги и NK-клетки могут распознавать CpG, который часто встречается в бактериальной ДНК [11]. CpG индуцирует выработку иммунными клетками хемокинов и цитокинов, а также стимулирующих костимулирующих молекул клеточной поверхности Т-клеток [12,13,14,15]. Таким образом, CpG превратились в мощные поляризующие адъюванты типа 1 [16, 17]. Более того, инъекция CpG непосредственно в опухоли является формой иммунизации, при которой опухоль in situ используется в качестве источника антигена и вводится CpG в качестве адъюванта для активации иммунного ответа внутри опухоли. Таким образом, мы предположили, что внутриопухолевая инъекция CpG устранит иммунную привилегию опухолей за счет рекрутирования и активации местных дендритных клеток, в зависимости от пути противоопухолевого ответа Т-лимфоцитов типа 1.

Чтобы преодолеть вышеупомянутые проблемы, мы разработали модифицированную платформу магнитных частиц на основе Fe ₃ О ₄ частицы для направления и контроля высвобождения CpG посредством внутриопухолевой инъекции в участки опухоли. Благодаря некоторым уникальным характеристикам Fe ₃ О ₄ магнитных частиц, особенно их хорошей гистосовместимости [18], суперпарамагнетизма [19, 20], низкой токсичности [21], а также простоты приготовления и адресной доставки лекарств с помощью внешнего магнитного поля [22, 23], их движение и концентрацию можно контролировать в тело с внешним магнитным полем, позволяющим Fe ₃ О ₄ частицы для использования в качестве носителей генной медицины с повышенной эффективностью трансфекции генов [24]. Кроме того, нанесение APTES на Fe ₃ О ₄ частицы за счет ковалентного связывания предотвращают образование агрегатов и предлагают больше сайтов модификации (аминогрупп) [25, 26] для дальнейшей помощи в связывании CpG. В этом исследовании Fe ₃ О ₄ Магнитные частицы были приготовлены методом соосаждения [27] и модифицированы APTES. CpG были прочно связаны с поверхностью модифицированного Fe ₃ О ₄ частицы путем электростатического взаимодействия с образованием частиц FeNP / CpG диаметром приблизительно 50 нм. Дальнейшие исследования показали, что системы доставки частиц FeNP обладают повышенной эффективностью поглощения CpG по сравнению с эффективностью свободного CpG в дендритных клетках, а внутриопухолевая инъекция частиц FeNP / CpG стимулирует эффективный противоопухолевый иммунный ответ Th1-типа не только для сдерживания опухоли в situ, но также для подавления метастазирования опухоли в моделях рака толстой кишки C26 и рака молочной железы 4T1 in vivo. Следовательно, терапия нанопрепаратами может быть потенциальной стратегией иммунотерапии опухолей.

Материалы и методы

Материалы и животные

3-Аминопропилтриэтоксисилан (APTES) был получен от Aladdin Company, Inc. Гексагидрат хлорида железа (FeCl ₃ ∙ 6H ₂ O) и тетрагидрат хлорида железа (FeCl ₂ ∙ 4H ₂ O) были приобретены в Тяньцзиньском научно-исследовательском институте химической промышленности Гуанфу. Следующий CpG был синтезирован Invitrogen Co:5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3 '. Флуоресцеинизотиоцианат (FITC) был приобретен у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США).

Линия клеток эмбриональной почки человека (293T), линия клеток опухоли молочной железы мыши (4T1) и линия клеток рака толстой кишки (C26) были получены из Американской коллекции типовых культур (ATCC), и были получены дендритные клетки костного мозга (BMDC). от мышей BALB / c. Самки мышей BALB / c в возрасте 6-8 недель были приобретены у Beijing HuaFuKang Laboratory Animal Co. Ltd. Мышей разводили и содержали в условиях, свободных от патогенов. Все протоколы для животных были выполнены в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных Национального института здоровья.

Подготовка FeNP

Метод соосаждения был использован для синтеза Fe ₃ О ₄ частицы [29]. В экспериментальной методике 11,68 г FeCl ₃ ∙ 6H ₂ O и 4,30 г FeCl ₂ ∙ 4H ₂ O добавляли в трехгорлую колбу, содержащую 200 мл деионизированной воды при 80 ° C, с последующим добавлением 15 мл 25% NH ₃ · H ₂ О. В течение 1-часового процесса реакции смесь продували N ₂ и перемешал. Тридцать миллиграммов приготовленного Fe ₃ О ₄ диспергировали в смеси 60 мл деионизированной воды и абсолютного этанола с помощью ультразвуковой вибрации в течение 30 мин. 0,3 г приготовленного Fe ₃ О ₄ диспергировали в смеси 4 мл деионизированной воды и 600 мл абсолютного этанола с помощью ультразвуковой вибрации в течение 30 мин. Затем к смеси добавляли 1.2 мл APTES при постоянном механическом перемешивании в течение 7 часов. Полученный функционализированный APTES-модифицированный Fe ₃ О ₄ Наночастицы (FeNP) отделяли от супернатанта магнитом, затем промывали этанолом и сушили при 40 ° C в вакууме в течение 24 часов. Наконец, осадок FeNP был подготовлен для дальнейшего использования.

Характеристика частиц FeNP / CpG

Спектры гранулометрического состава Fe ₃ О ₄ , Частицы FeNP и FeNP / CpG определяли с использованием лазерного анализатора размера частиц Zetasizer Nano ZS90 (Malvern Instruments, Малверн, Великобритания) при 25 ° C. Каждый тест проводился трижды, и принималось среднее значение. Просвечивающий электронный микроскоп (H-6009IV; Hitachi Ltd., Токио, Япония) и сканирующий электронный микроскоп (SEM) использовались для наблюдения за морфологией полученных частиц.

Анализ замедления агарозы проводили для оценки способности частиц FeNP связывать CpG. Вкратце, функционализированный APTES-модифицированный Fe ₃ О ₄ частицы (FeNP) смешивали с 1 мкг CpG в различных соотношениях (FeNP:CpG, w / w ) в дистиллированной воде. После совместной инкубации в течение 30 мин при комнатной температуре смеси подвергали электрофорезу на 1% ( мас. / v ) агарозный гель при 120 В в течение 30 мин. Затем гель окрашивали Golden View ™ (0,5 мг / мл) и фотографировали с помощью УФ-осветителя (Bio-Rad ChemiDox XRS, США).

Анализ МТТ

Цитотоксичность частиц FeNP по отношению к клеточным линиям C26, 4T1 и 293T оценивали с помощью анализа МТТ. Клетки C26, 4T1 и 293T высевали с плотностью 5 × 10 ³ . клеток на лунку в 100 мкл среды RPMI 1640, содержащей 10% FBS, в 96-луночных планшетах и ​​выращивали в течение 24 или 72 часов. Подготовленные клетки подвергали действию серии частиц FeNP в различных концентрациях:1,25, 0,625, 0,3, 0,15, 0,07, 0,03, 0,01 и 0 мг / мл в двух повторностях. После культивирования в течение указанного времени в каждую лунку пипеткой вносили 100 мкл полной среды и 10 мкл МТТ и инкубировали при 37 ° C в течение 4 часов. К растворенному веществу добавляли ДМСО на 30 мин, и образовался формазан. Затем оптическую плотность измеряли при 570 нм с помощью микротитровального люминометра Spectramax M5 (Molecular Devices, США). Жизнеспособность необработанных клеток считалась 100%.

Трансфекция in vitro

BMDC получали из мышей BALB / c. Вкратце, клетки костного мозга из бедренной и большеберцовой костей вымывали с помощью шприца с использованием свободной культуральной среды 1640, содержащей FBS. Клетки центрифугировали при 1500 об / мин в течение 3 минут, обрабатывали буфером для лизиса ACK (Lonza Inc.) для удаления эритроцитов и ресуспендировали в культуральной среде RPMI-1640 с добавлением 10% FBS, пенициллина (100 Ед / мл) и стрептомицина ( 100 Ед / мл) при 37 ° C в 5% CO2 с 20 нг / мл гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF). Затем клетки высевали в шестилуночные планшеты с плотностью 10 ⁶ . клеток на лунку, а среду для выращивания меняли каждые 2 дня. Дендритные клетки собирали на 7-й день.

На 7 день в предварительно разработанные лунки добавляли эквивалент в виде частиц 0,2 мкг свободного FITC-конъюгированного CpG (CpG-FITC) или FeNP, доставляющего CpG-FITC с массовым соотношением 10:1. Через один или 3 часа после трансфекции питательную среду удаляли, клетки окрашивали DAPI в течение 10 минут и трижды промывали физиологическим раствором. Фотографии каждой лунки были сделаны с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа (LSCM), а эффективность трансфекции была измерена с помощью проточной цитометрии (NovoCyte Flow Cytometer, ACEA Biosciences, США).

Анализ ингибирования опухоли in vivo

Сто тысяч клеток C26 или 4T1 вводили подкожно в спину каждой мыши BALB / c (в возрасте 6-8 недель). Затем объемы опухолей были измерены с помощью цифрового штангенциркуля и рассчитаны по следующей формуле:объем опухоли =0,5 × длина (мм) × [ширина (мм)] ² . Когда опухоли достигают примерно 50 мм ³ по размеру применялись обработки. Мыши ( n =10) получали либо внутриопухолевые инъекции CpG / FeNP (в соотношении 10:1) в виде частиц, эквивалентных 20 мкг CpG, либо только CpG каждые 3 дня для четырех обработок. Мышей, получавших эквивалент физиологического раствора (NS) или частиц FeNP, считали контрольными группами. Размер опухоли и массу тела животных контролировали каждые 3 дня. На 31 день всех мышей умерщвляли смещением шейных позвонков. Ткань опухоли и другие важные органы фиксировали 4% нейтральным формалином с последующим парафиновым срезом для окрашивания HE для оценки морфологических различий и для иммунофлуоресценции для тестирования микроокружения опухоли. В модели 4T1 мы измерили вес опухоли и подсчитали количество узелков метастазов в легких.

Эксперимент с повторным заражением опухолью обрабатывали на модели C26. Вкратце, мышей, излеченных обработкой FeNP / CpG, повторно заражали 5 × 10 ⁵ Клетки C26 или 4T1 подкожно на два отдельных участка на противоположной стороне бока без дополнительной обработки. Мышей забивали, когда объем опухоли 4T1 увеличивался до 200–300 мм ³ или 20 дней.

Анализ цитотоксических Т-лимфоцитов

Анализ CTL проводили в соответствии с опубликованными методами. В частности, лимфоциты селезенки в качестве эффекторных клеток собирали, удаляли эритроциты с помощью хлорида аммония и пропускали через нейлоновую вату в конце экспериментов по лечению. 4T1 или C26 в качестве клеток-мишеней были помечены 300 мкл Na ₂ ⁵¹ CrO ₄ в течение 2 ч, а затем промывали PBS и разливали в 96-луночные планшеты. Подготовленные эффекторные клетки инкубировали совместно с клетками-мишенями при различных соотношениях E:T. Супернатанты, содержащие радиоактивность от клеток-мишеней, измеряли сцинтилляционным счетчиком. Специфический лизис определяли следующим образом:% специфического лизиса =100 [(высвобождение в присутствии спонтанного высвобождения CTL) / (спонтанное высвобождение максимального высвобождения)]. Во всех экспериментах спонтанное высвобождение было менее 30% от максимального.

Анализ ELISpot

Спленоциты собирали у контрольных мышей или мышей, обработанных CpG, в конце эксперимента, и анализы ELISpot проводили с использованием набора мыши IFN-γ / IL-4 Dual-Color ELISpot в соответствии с инструкциями производителя. Собранные спленоциты совместно инкубировали с их соответствующими обработками в течение 96 ч, суспензию отбрасывали и клетки трижды промывали промывочным буфером перед добавлением смешанных антител IFN-γ и IL-4. После обработки хромогенными агентами количество пятнообразующих клеток (SFC) подсчитывали под микроскопом.

Анализ ELISA

ELISA выполняли для определения уровней титров Ct-специфических сывороточных антител в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, микропланшеты, покрытые очищенным цельным белком Ct (BestBio Biotechnology Co., Шанхай, Китай), промывали раствором PBS, содержащим 0,05% твин 20 (PBST), а затем блокировали 100 мкл блокирующего буфера (5% обезжиренное молоко в PBST). при 37 ° C в течение 1 ч. После пятикратной промывки PBST планшеты инкубировали с иммунной сывороткой (разведенной в соотношении 1:1000 в блокирующем буфере, 100 мкл / лунку) или вагинальными промывками (разведенными в соотношении 1:10 в блокирующем буфере, 100 мкл / лунку) при 37 ° C. ° C в течение 2 ч. После пятикратной промывки PBST планшеты инкубировали с HRP-конъюгированными козьими антителами против IgG мыши (разведенными в соотношении 1:1000 в блокирующем буфере, 100 мкл / лунку) или HRP-конъюгированными козьими антителами против IgA мыши (разведенными при 1:2000 в блокирующем буфере, 100 мкл / лунку) при 37 ° C в течение 1 ч.

Гистологический анализ

Ткань опухоли и основные органы, взятые из исследований ингибирования in vivo, фиксировали и заливали парафином. После депарафинизации и регидратации срезы тканей, залитые воском, окрашивались Mayer's HE. Для анализа инфильтрирующих лимфоцитов (TIL) в опухолевые ткани из каждой группы срезы подвергали репарации антигеном под высоким давлением, окрашивали антимышиными FITC-CD4, PE-CD8 и PE-CD49b (в качестве производителя NK) (BD, USA) в течение 1 часа при 4 ° C, а затем окрашивали DAPI в течение 10 минут перед промывкой PBS для визуализации. Изображение каждой группы было получено через положительный флуоресцентный микроскоп (Olympus, Япония).

Статистический анализ

Данные были выражены как среднее значение ± стандартное отклонение. Статистический анализ выполняли с помощью одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с использованием программного обеспечения Prism 5.0c (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA), программного обеспечения SPSS 17. Межгрупповое сравнение проводили с использованием критерия Тьюки для однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA). P значения <0,05 считались статистически значимыми.

Результаты

Подготовка и определение характеристик частиц FeNP / CpG

Чтобы разработать магнитную частицу для доставки CpG с низкой цитотоксичностью, Fe ₃ О ₄ частицы были синтезированы с использованием метода соосаждения, как показано на рис. 1а. Прививка аминопропилсилановых групп (–O) 3Si – CH2 – CH2 – CH2 – NH2 APTES на поверхность Fe ₃ О ₄ с образованием частиц FeNP (рис. 1б). Отрицательно заряженный CpG (CpG) связывается с эффективными функциональными группами, обеспечиваемыми APTES, с образованием частиц FeNP / CpG посредством электростатических взаимодействий, как схематично представлено на рис. 1c. На основании измерения динамического светорассеяния размер подготовленного Fe ₃ О ₄ Размер частиц составлял 10,7 ± 4,1 нм (рис. 2а). Как наблюдали с помощью ПЭМ (рис. 2b) и SEM (рис. 2c), Fe ₃ О ₄ Разработанный в этой работе, имел однородную и почти сферическую форму. Динамический диаметр Fe, модифицированного APTES ₃ О ₄ Размер частиц составлял 34,5 ± 5,0 нм (рис. 2d), что хорошо согласуется с результатами ПЭМ (рис. 2e).

Приготовление частиц FeNP / CpG. а Уравнение синтеза Fe ₃ О ₄ магнитные частицы методом соосаждения. б Реакции гидролиза и конденсации с образованием силанового полимера и реакция силанизации APTES на поверхности магнетита с образованием частиц FeNP. c Принципиальная схема частиц FeNP / CpG. CpG связываются с поверхностью FeNP посредством электростатических взаимодействий с образованием частиц FeNP / CpG

Характеристика частиц FeNP / CpG. а Спектр распределения по размерам Fe ₃ О ₄ частицы. б Изображение Fe ₃ на просвечивающем электронном микроскопе (ПЭМ) О ₄ . c Изображение Fe ₃ , полученное с помощью сканирующей электронной микроскопии О ₄ частицы. г Распределение по размерам Fe ₃ с покрытием APTES О ₄ (FeNP) частицы. е ПЭМ-изображение частиц FeNP. е Способность FeNP связывать CpG определялась с помощью анализа задержки геля. Все данные представляют собой три независимых эксперимента

Чтобы проиллюстрировать способность частиц FeNP связываться с CpG, был проведен анализ замедления образования геля (рис. 2f). Когда молярное соотношение FeNP и CpG составляло 10:1, яркая полоса CpG не наблюдалась, показывая, что отрицательно заряженный CpG может полностью адсорбироваться частицами FeNP посредством электростатических взаимодействий после электрофореза. Поэтому мы выбрали это соотношение рецептов для дальнейшего применения в нашем исследовании. Вместе эти результаты продемонстрировали, что CpG может успешно сочетаться на поверхности FeNP за счет электростатических взаимодействий, демонстрируя стабильность и небольшие размеры.

Жизнеспособность клеток и трансфекция частиц FeNP / CpG in vitro

Для дальнейшего описания биофизических характеристик in vitro мы обнаружили цитотоксичность FeNP в клетках 293T, 4T1 и C26 через 24 или 72 часа (рис. 3a). Не было очевидной дозозависимой связи между жизнеспособностью клеток и частицами FeNP в клетках 293T, C26 и 4T1. Выживаемость клеток была более 80% через 24 часа и 60% через 72 часа на трех типах клеток, даже при концентрации FeNP 1,25 мг / мл. Эти результаты доказали биосовместимость частиц FeNP как с нормальными клетками (293T), так и с опухолевыми клетками (C26, 4T1).

Цитотоксичность и активность поглощения частиц FeNP / CpG in vitro. а МТТ-анализ. Мы обнаружили жизнеспособность клеток 293T, 4T1 и C26 после обработки различными концентрациями частиц FeNP в течение 24 или 72 часов. Не было существенной разницы в жизнеспособности клеток при любой дозе FeNP. б , c Обнаружение захвата FeNP / CpG в BMDC. BMDC подготовлены после GM - CSF лечения в течение 7 дней трансфицировали CpG-FITC или CpG-FITC с доставкой FeNP в течение 1 или 3 ч перед интенсивной промывкой, фиксацией и меткой DAPI. Изображения были получены с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии (LSCM). По сравнению со свободным меченным FITC CpG, FeNP / CpG с повышенной интенсивностью флуоресценции ( b ) и эффективность трансфекции были статистически значимыми ( c ). Эти данные были репрезентативными для трех независимых экспериментов, среднее значение ± стандартная ошибка; * P < 0,05, * P < 0,01 и *** P < 0,001 по сравнению с группой, не получавшей лечения

Дендритные клетки как основные рецепторные клетки для CpG играют важную роль в противоопухолевом иммунном ответе, опосредованном TLR9. CpG как мощный поляризующий адъювант типа 1 побуждает ДК активировать иммунный ответ внутри опухоли путем секреции хемокинов и цитокинов. Следовательно, эффективная доставка CPG в клетки DC имеет решающее значение для достижения противоопухолевого ответа. В нашем исследовании FITC-конъюгированные CpG были использованы для изучения способности частиц FeNP к DCs in vitro. Через 1 или 3 часа после трансфекции с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии (LSCM) интенсивность клеточной флуоресценции в группах, обработанных FITC-конъюгированными CpG-покрытыми частицами FeNP (FeNP / CpG-FITC), была выше, чем в группах эквивалентное количество свободных групп CpG (рис. 3б). Частицы FeNP / CpG-FITC были способны трансфицировать до 18,3% DC через 1 час. Затем, через 3 часа после трансфекции, доля положительных клеток увеличилась до 39,2% (фиг. 3c). Между тем, что касается свободных FITC-конъюгированных CpG-обработанных клеток, минимальную флуоресценцию можно было наблюдать даже через 3 часа после трансфекции при менее чем 10% трансфекции. Таким образом, предполагается, что доставка CpG частицами FeNP увеличивает клеточное поглощение CpG.

FeNP доставляют CpG к ксенотрансплантату и ингибируют рост опухоли и спонтанные легочные метастазы in vivo

Противораковая активность частиц CpG / FeNP была сначала оценена на моделях опухолей с подкожной трансплантацией рака толстой кишки C26 и рака молочной железы 4T1 in vivo. Когда объем опухоли составлял приблизительно 50 мм ³ , мышей случайным образом разделили на четыре группы для начала лечения ( n =10). Мышам вводили внутриопухолевую инъекцию частиц CpG / FeNP три раза на протяжении всего эксперимента (рис. 4а). В нашем исследовании внутриопухолевая инъекция частиц FeNP / CpG приводила к значительному ингибированию роста опухоли ксенотрансплантата по сравнению с таковой в контрольных группах, и степень ингибирования составляла до 69% ( P <0,05 по сравнению с NS) (рис. 4б). По сравнению с группой, получавшей физиологический раствор (NS) (0,90 ± 0,08 г) и группой FeNP (0,81 ± 0,03 г), в группах, обработанных частицами FeNP / CpG, наблюдалось статистически значимое снижение веса опухоли (0,38 ± 0,03 г, P <0,001). Для сравнения, группа свободных CpG показала минимальную противораковую способность (0,68 ± 0,03 г) (рис. 4c). Кроме того, у мышей в контрольной группе PBS развились обширные легочные метастазы, по сравнению с мышами, обработанными частицами FeNP / CpG, количество опухолевых узелков в легком уменьшилось на 64,1% (рис. 4d, e), демонстрируя силу частиц FeNP / CpG при лечении метастатических опухолей. Как показано на фиг. 4f, окрашивание легкого H&E показало снижение нагрузки в легкие с явными метастазами в легкие после обработки FeNP / CpG, чем в других группах. Эти результаты показывают, что доставка CpG FeNP в клетки 4T1 не только значительно ингибирует рост опухоли 4T1 ( P <0,001 по сравнению с NS), но также подавлял метастазирование рака груди в легкие.

Противоопухолевые свойства частиц FeNP / CpG in vivo. а Схема лечения противоопухолевым препаратом с помощью частиц FeNP / CpG как на моделях рака толстой кишки C26, так и на моделях ксенотрансплантата рака молочной железы 4T1 посредством внутриопухолевой инъекции in vivo. б - г Обработка частицами FeNP / CpG ингибировала рост опухолей 4T1. б Типичные кривые роста опухоли модели опухоли 4T1. c Средний вес опухоли. г Средний узелок опухоли легкого в каждой группе четко показывает метастазы в легкие после внутриопухолевой инъекции FeNP / CpG. е , f Визуализация светлого поля и окрашивание легких H&E: e Количество видимых метастазов в легких, стрелками указаны метастазы в легких. е H&E окрашивание метастазов в легких. Шкала 100 мкм для окрашивания H&E. г , ч Частицы FeNP / CpG значительно ингибировали рост опухолей ксенотрансплантата C26: e кривые роста опухоли каждой группы во время эксперимента и f средний вес опухоли. В каждой группе было по 10 мышей. г Эксперимент с повторным заражением опухолью. я В модели C26 мышей, вылеченных обработкой FeNP / CpG, повторно заражали 5 × 10 ⁵ Клетки C26 (правый фланг) или 4T1 (левый фланг) подкожно. на два отдельных участка на противоположной стороне бока без дополнительной обработки. Представленные изображения представляют собой репрезентативных мышей через 20 дней после повторного заражения опухолью. Все данные были репрезентативными для трех независимых экспериментов, среднее значение ± стандартная ошибка среднего; * P < 0,05, * P < 0,01 и *** P < 0,001

Точно так же значительный усиленный противоопухолевый эффект в группах обработки FeNP / CpG наблюдался в подкожной модели мышей, инкубированных с C26. Как показано на фиг. 4g, опухоль быстро росла у контрольных мышей, группы носителя и группы CpG со средним объемом опухоли приблизительно 2300 ± 239,4 мм ³ , 2116,7 ± 360,9 мм ³ , и 1353,3 ± 158,9 мм ³ соответственно, к 31 дню. Напротив, в группе FeNP / CpG рост опухоли был чрезвычайно подавлен, при этом средний объем опухоли составлял приблизительно 153,7 ± 62,7 мм ³ ( P <0,01 по сравнению с NS) и степень ингибирования 94,4%. Опухоли, казалось, медленно росли после первоначального лечения, и часть опухолей начала постепенно исчезать после окончания трех сеансов лечения. Что еще более важно, в группах лечения частицами FeNP / CpG опухоли почти у половины мышей полностью исчезли к концу эксперимента. Как показано на рис. 4h, группа лечения FeNP / CpG имела гораздо более низкий средний вес опухоли, чем у других групп ( P <0,001):группа лечения FeNP / CpG (0,14 ± 0,08 г), группа NS (2,41 ± 0,26 г), группа FeNP (2,50 ± 0,4 г) и группа CpG (1,44 ± 0,32 г). Чтобы определить, были ли частицы FeNP / CpG достаточными для опосредования специфического противоопухолевого ответа, эксперимент с повторным заражением опухолью был обработан в модели C26 (фиг. 4i). Мышам, опухоли которых были полностью регрессивными после обработки частицами FeNP / CpG в модели рака толстой кишки C26, подкожно инокулировали опухоли 4T1 и C26 в различных положениях на мышах BALB / c, и никакого дальнейшего лечения не проводили. Все опухоли 4T1 быстро росли, и их объемы превышали 1000 мм3 к 20-му дню после заражения. Напротив, в модели C26 были солидные опухоли, невидимые невооруженным глазом, что свидетельствует о том, что группы частиц FeNP / CpG стимулировали специфический противоопухолевый ответ. Эти результаты предполагают, что внутриопухолевая инъекция частиц FeNP / CpG эффективно ингибирует рост подкожный ксенотрансплантат.

Частицы FeNP / CpG стимулируют усиленный систематический противоопухолевый иммунный ответ

Были дополнительно изучены противоопухолевые механизмы in vivo частиц FeNP / CpG в двух вышеупомянутых моделях. Чтобы изучить тип иммунного ответа, мы применили анализ ELISpot для анализа уровней IFN-γ / IL-4 в селезенке мыши. Если уровень IFN-γ в лимфоцитах селезенки (показывающий эритему на доске ELISpot) значительно больше, чем уровень IL-4 (показывающий синие точки на доске ELISpot), типом стимулированного иммунного ответа был Th1, а именно, чтобы активировать CD8 ⁺ Т-лимфоциты и, в основном, ответ CTL организма. В противном случае тип иммунного ответа был Th2, а именно, в основном, чтобы активировать CD4 ⁺ Т-лимфоциты, таким образом стимулируя В-лимфоциты и производя антиген-специфические антитела. Двухцветный анализ ELISpot проводили для измерения экспрессии IFN-γ и IL-4 при различных обработках (фиг. 5a). По сравнению с другими тремя группами, количество пятнистых клеток (SFC) IL-4 и IFN-γ, секретируемых лимфоцитами селезенки мышей, имело тенденцию к возрастанию в группе лечения частицами FeNP / CpG, а количество SFC секреция IFN-γ была в 1,5 раза больше, чем для IL-4 ( P <0,05), что подразумевает усиленный противоопухолевый клеточный иммунный ответ после внутриопухолевой инъекции частиц FeNP / CpG. Кроме того, сыворотку мышей, обработанных NS, FeNP, CpG и FeNP / CpG, анализировали с помощью анализа ELISA на наличие общего опухолеспецифического IgG после трех иммунизаций. В модели опухоли C26, хотя мыши, иммунизированные FeNP / CpG, вырабатывали значительно более высокие титры опухолеспецифических IgG, чем в других группах (рис. 5b), не было статистической разницы между мышами, иммунизированными FeNP / CpG, и мышами, иммунизированными CpG. .

The mechanism of antitumor immune response. а ELISpot assay. Splenocytes were harvested from NS or treated mice after the final treatment, and ELISpot assays were performed using the mice IFN-γ/IL-4 Dual-Color ELISpot kit in the C26 xenograft model. б In the C26 model, serum antibody titers in tumor-bearing mice treated by FeNP/CpG particles were tested using an ELISA assay. Each symbol represents an individual mouse, and horizontal lines indicate the median as determined by Mann–Whitney U тесты. c CTL assays. The cytotoxicity of splenocytes against C26 cells were examined in a 4-h 51Cr-release assay. г Representative immunofluorescence images showing infiltrating immune cells in tumor tissues in each group. The FeNP/CpG particles treatment groups with enhanced CD4 ⁺ T, CD8 ⁺ T and NK (CD57 ⁺ ) cell infiltration in tumors compared to that of other groups. е The cytotoxicity of splenocytes against 4T1 cells were examined in a 4-h 51Cr-release assay

To assess the cell-mediated immune response stimulated by the FeNP/CpG, CTL activity was assessed using the 51Cr release assay on C26 and 4T1 cells ex vivo (Fig. 5c, e). When the killing activity of CTL was at a 100:1 ratio of effector cells to target cells, in the C26 cells, the effectors in the FeNP/CpG groups showed 8.2-fold more tumor-killing activity than that in the NS group and 9.7-fold and 1.7-fold more than that in the FeNP and CpG groups (P  < 0.05 versus NS) (Fig. 5c). Similarly, this observation was coincident with the result in the 4T1 cells; the FeNP/CpG group had 7.4-fold more tumor-killing activity than that of the NS group and 6.6-fold and 1.4-fold more than that of the FeNP and CpG groups (P  < 0.01 versus NS). These results illustrated that compared to that of free CpG, the use of APTES-coated Fe₃ О ₄ to deliver CpG can stimulate a more intense humoral immune response and result in a better antitumor efficiency in vivo.

The FeNP/CpG Increases Infiltrating Lymphocytes in Tumors and Alters Tumor Microenvironments

Tumor-infiltrating lymphocytes (TILs), a primary immune component infiltrating solid tumors, are considered the manifestation of the host antitumor reaction. Immunofluorescence analyses were performed to study TILs in tumors. The intensity of infiltration by CD4 ⁺ T cells, CD8 ⁺ T cells and CD49B ⁺ NK cells was studied (Fig. 5d). There was a significant increase in the intensity of infiltration of NK cells, CD4 ⁺ T cells, and CD8 ⁺ T cells in tumors from the FeNP/CpG groups compared with that in the FeNP, CpG, and NS groups (P  < 0.005), which suggests that FeNP/CpG not only stimulates a higher immune response but also alters the tumor microenvironment by activating more immune cells into the tumor tissues. During the entire experiment, the mouse body weight and state were observed, and there was no piloerection, poor appetite, weight loss, or abnormal behavior in the C26 xenograft model (Fig. 6a). As shown in Fig. 6b, no significant pathological changes in heart, liver, spleen, lung, or kidney were observed through HE analysis. No histopathological changes and changes of body weight were observed in the 4T1 subcutaneous xenograft model (data not shown). Overall, our data suggested that the developed FeNP particles for CpG delivery were capable of treating cancer and inhibiting tumor metastasis with high safety.

Safety and toxicity evaluation of FeNP/CpG formulation. ( а ) Body weight changes in NS, FeNP, CpG, and FeNP/CpG groups. б The section of the heart, liver, spleen, lung, and kidney in each group was collected and stained with H&E staining. No significantly pathological changes were observed in any group (magnification, × 200)

Обсуждение

Synthetic CpG, identified as an effective drug in immunotherapy by simulating the immune activation of natural bacterial DNA [28,29,30], have been characterized in a variety of tumor models. CpG intratumoral injection is one of treatments in clinical trials on CpG. Molenkamp and his colleagues showed that the intratumoral injection of CpG alone or combined with radiotherapy could obviously increase the tumor-specific CD8 ⁺ T cell immune response in lymphoma or melanoma patients, causing systemic tumor regression [31]. So far, CpG combined with other treatments showed both a great antitumor effect and good security, which suggests that CpG are quite effective in tumor immunotherapy. However, the greater challenge of CpG truly coming into clinical application is if they can efficiently be delivered into the cells to combine with receptors such as TLR9 to stimulate an immune response. Nanotechnology can address such concerns by enhancing the delivery of CpG to antigen-presenting cells, and a number of nanocarriers have been explored for this purpose [32,33,34]. The nanoparticle formulations explored include gelatin particles, liposomes [35, 36], and DNA origami structures, but these were only explored in the context of combination treatments.

In this study, we first developed a non-viral delivery system, FeNPs, which were easily formed via APTES-modified Fe₃ О ₄ , to deliver CpG into BMDCs. The CpG surrounded the surface of the modified magnetic Fe₃ О ₄ particles via electrostatic interactions to form FeNP/CpG particles with a small size distribution. The FeNP/CpG particles not only showed enhanced transfection efficiency compared to that of free CpG but also had a great antitumor effect in subcutaneous tumor models of C26 colon cancer, with 94.5% tumor inhibition, and 4T1 breast cancer, with a 64.3% inhibitory rate, though intratumoral injection in vivo. Moreover, FeNP/CpG treatments significantly stimulate an effective antitumor immune response and alter the tumor microenvironment by recruiting a number of immune cells to tumor tissues.

We further discuss possible reasons to account for the enhanced transfection and therapeutic efficiency of FeNP/CpG particles over that of free CpG. First, the developed FeNPs take advantage of characteristics such as their good histocompatibility, superparamagnetism, and a strong positive charge (for the Fe₃ О ₄ particles) to assist in delivering the CpG into the intracellular space, resulting in drug-carrier particles focusing on the tumor site to increase the drug concentrations in the area, reduce the drug loss, and improve drug utilization. Simultaneously, APTES was used to modify Fe₃ О ₄ , providing more CpG binding sites to firmly bind the CpG onto the carrier. FeNPs exerted higher cell viability on 293T, C26, and 4T1 cells in vitro, and there was no remarkable pathological change after FeNP/CpG treatment by intratumoral injection that could avoid the side effects due to CpG entering into circulation by systemic administration. Second, the FeNP load CpG into DCs with a higher transfection efficiency than that of free CpG, increasing opportunities for integration with intracellular TLR9, which is widely expressed in macrophages, NK cells, DCs, and so on. The combination of CpG and TLR9 induces the secretion of local cytokines and chemokines, recruiting and activating immune cells of the innate immune response to stimulate the antitumor immune response; additionally, NK cells and CTLs could kill tumor cells directly or use IFN-γ or granzyme B to kill tumor cells [37, 38]. We suspected that FeNP/CpG may be taken up by the recruited immune cells to trigger the secondary cascade amplification of the immune response. Third, some studies have indicated that CpG can react with tumor cells expressing TLR9, aiming to induce tumor cell autophagy [39]. Autophagy may enhance the sensitivity of tumor cells to the immune response, and the ATP dependent on autophagy could be released extracellularly and used to recruit DCs into the tumor tissue, activating the tumor-specific T cell immune response. This therapy is a form of immunization that uses the in situ tumor as a source of antigen and introduces CpG as an adjuvant to activate an immune response within the tumor. In our study, although the FeNP/CpG was injected without any specific tumor antigen, a cell-specific and systematic immune response could be elicited, and the contralateral tumors appear regressive, as shown in the tumor re-challenge experiment and the two-tumor site model. In addition, being coated with the lysate of tumor cells in a 96-well plate, the ELISA assay showed after FeNP/CpG intratumoral injection in mice that the antitumor antibody titer in the serum appeared to significantly increase. The ELISpot assay suggested that FeNP/CpG treatment, to a great degree, increased the spleen lymphocyte secretion of IFN-γ and IL-4, especially that of IFN-γ , which indicated that the humoral immunity responses and cellular immunity responses were both enhanced by treatment with FeNP/CpG in mice. In addition, immunohistochemistry analyses were performed to study TILs in the tumor microenvironment. Compared to that in the other groups, in the FeNP/CpG group, the number of CD4 ⁺ T, CD8 ⁺ T, and NK cells in the tumors showed a significant increase. Taken together, our study suggested that FeNP/CpG particle intratumoral injection may be a potential tumor immunotherapy strategy.

In recent years, treatment strategies based on nucleic acids have become one of the important areas of tumor treatment. The negative charge of the lipid bilayer of cell membranes makes it difficult for nucleic acid drugs with the same charge to pass through the cell membrane into the cell. Thus, APTES-modified Fe₃ О ₄ as a safe and efficient delivery system is expected to be used for other nucleic acid drugs to contribute to the carrier solution.

Conclusion

In summary, magnetic APTES-modified Fe₃ О ₄ particles (FeNP) were used to deliver CpG adjuvants via intratumoral injection to treat C26 colon carcinoma and 4T1 breast cancer, with enhanced antitumor ability over that of free CpG. The prepared FeNPs showed high stability, low toxicity, and high transfection ability for CpG in vitro and in vivo. Our results demonstrated the potential capacity of FeNP particles in non-viral nucleic acid drug delivery and offered an alternative strategy for CpG immunotherapy.

Сокращения

APTES:

3-Aminopropyltriethoxysilane

BMDC:

Bone marrow-derived dendritic cell

CpG:

Cytosine-phosphate-guanine

CpG-FITC:

FITC-conjugated CpG

FeNP:

3-Aminopropyltriethoxysilane-modified Fe₃ О ₄ nanoparticle

FeNP/CpG:

FeNP-delivered CpG particles

FeNP/CpG-FITC:

FeNP-delivered CpG-FITC particles

GM -CSF :

Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor