Оценка токсичности наночастиц PEG-PCCL и предварительное исследование его противоопухолевого эффекта от загрузки паклитаксела

Методы

Материалы, клетки и животные

ε-капролактон (ε-CL, Alfa Aesar, США), полиэтиленгликоль (PEG, Mn =1000, Fluka, США), гексаметилендиизоцианат (HMDI, Aldrich, США), Palladium sur charbon (pd / c, Sigma , США), модифицированная Дульбекко среда Игла (DMEM, Hyclone, США), 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолий бромид (MTT, Sigma, США), бычий сывороточный альбумин (BSA , BR, BoAo Co. Ltd., Китай) использовали без дополнительной очистки. Все материалы были аналитической чистоты.

Самцы мышей Balb / C (возраст 7-8 недель, вес 20-25 г) и новозеландский кролик (вес 2,5-3,0 кг) были приобретены у биотехнологических компаний Chengdu DaShuo (Сычуань, Китай) с сертификатом качества № SCXK2013– 24. Животных содержали в стандартной среде, свободной от патогенов, с достаточным количеством пищи и водопроводной воды. Эксперименты проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных (Министерство науки и технологий Китая, 2006). Все экспериментальные процедуры на животных были одобрены Этическим комитетом лабораторных животных Западно-Китайского медицинского центра Сычуаньского университета.

Клетки гепатокарциномы мыши H22 (H22), клетки эмбриональной почки человека (HEK293T) и клетки карциномы гепатомы (Hep G2) были получены из отдела иммунологии Западно-Китайской школы фундаментальных медицинских наук и судебной медицины Университета Сычуань. HEK293T и Hep G2 культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) (Hyclone, UT, США), с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS) (Hyclone, UT, США) и антибиотиков (пенициллин 100 Ед / мл и стрептомицин. 100 Ед / мл) при 37 ° C в 5% CO2.

Подготовка мицелл PEG-PCCL, загруженных PEG-PCCL и PTX

PEG-PCCL и PTX-NP были поставлены нашим сотрудником, профессором Лю из Школы микроэлектроники и твердотельной электроники Китайского университета электронных наук и технологий. Диблок-сополимеры PEG-PCCL были синтезированы полимеризацией с раскрытием цикла ɛ-CL в присутствии гомополимера PEG с катализаторами на основе палладия на основе карбона, как показано на блок-схеме ниже (рис. 1). Полученные сополимеры PEG-PCCL очищали и хранили в герметичных мешках до использования.

Блок-схема синтеза диполимера PEG-PCCL

Для загрузки PTX в наночастицы PEG-PCCL, твердую дисперсию, простой и ценный метод без ядовитого органического растворителя [19] был проведен после приготовления PEG-PCCL. Затем раствор упаривали при 60 ° C при пониженном давлении. После выпаривания спирта были получены гомогенные сополимеры. PTX был инкапсулирован полимерными носителями в аморфной форме. Совместное испарение растворяли в воде при 65 ° C для получения раствора PTX-NPs, который фильтровали через фильтр 0,22 нм, чтобы получить осветленный и стерильный раствор. Порошок PTX-NPs получали из лиофилизированного раствора из системы сублимационной сушки. Эффективность улавливания (EE) PTX определяли методом центрифугирования на мини-колонке [20]. Концентрации PTX, включенного в PEG-PCCL (C _I ) или общее лекарственное средство в дисперсиях PEG-PCCL (C _T ) были проанализированы с помощью ВЭЖХ. EE (%) =(C _I / C _T ) × 100%.

Характеристика

Размер частиц и дзета-потенциал PEG-PCCL измеряли с помощью лазерного анализатора размера частиц (Malvern Nano-ZS 90). Просвечивающая электронная микроскопия (ТЕМ, H-6009IV, Hitachi, Япония) была использована для оценки морфологии PEG-PCCL. В частности, раствор наночастиц помещали на медную сетку, покрытую нитроцеллюлозой, а затем образцы окрашивали фосфорновольфрамовой кислотой и сушили при комнатной температуре.

Анализы цитотоксичности

Цитотоксичность оценивали с помощью анализа утечки МТТ и ЛДГ в Hep-G2 и HEK293T. Метаболизацию MTS количественно оценивали в интактных клетках согласно методике MTT [21]. Суспензии клеток готовили трипсином / ЭДТА (HyClone, UT, США). Всего 0,4 × 10 ⁴ клетки высевали в 96-луночный планшет (Corning, MA, США). Планшеты инкубировали в течение 12 ч, чтобы позволить клеткам прикрепиться к пластиковой поверхности планшетов для культивирования. Затем среду удаляли и в лунки добавляли 200 мкл свежей культуральной среды или среды, содержащей различные концентрации PEG-PCCL (от 0 до 1 мг / мл). В течение 24-часового периода воздействия в среду не добавляли FCS. Выживаемость определялась параметрами цитотоксичности и выражалась уравнением:Выживаемость (%) =(OD _T / OD _C ) × 100. Здесь OD _T и OD _C относится к значению оптической плотности (измеренному считывающим устройством спектрофотометра при 570 нм) клеток, обработанных PEG-PCCL или наночастицами PEI, и необработанных клеток, соответственно.

Утечку ЛДГ в культуральную среду исследовали с помощью набора для анализа ЛДГ (Biotech, Китай). Все спектрометрические измерения групп, обработанных наночастицами, корректировались бесклеточным контролем. Для морфологического исследования клетки HepG2 высевали и экспонировали так же, как и в анализах цитотоксичности. Клетки фиксировали в 4% параформальдегиде и наблюдали под просвечивающим электронным микроскопом (ТЕМ).

Анализы апоптоза

Апоптоз определяли с помощью двойного окрашивания аннексином V-FITC и PI [22]. Вкратце, клетки HepG2 высевали в 12-луночные планшеты с плотностью 4 × 10 ⁴ . клеток / лунку и обрабатывали PEG-PCCL (0,5 мг / мл) и PEI (0,5 мг / мл) в течение 48 часов. Затем клетки трижды промывали холодным фосфатно-солевым буфером (PBS) с последующей инкубацией с аннексином V-FITC в течение 15 минут и окрашиванием PI еще в течение 15 минут при 4 ° C в темноте. Окрашенные клетки наблюдали под флуоресцентным микроскопом (Olympus Co. Ltd., Токио, Япония) в течение 30 минут.

Анализ гемосовместимости

Гемосовместимость PEG / PCCL оценивали в соответствии с ранее описанным тестом на гемолиз эритроцитов (RBC) in vitro [23]. Образцы крови мышей собирали, и эритроциты растворяли в PBS (2% раствор RBC). Физиологический раствор, PEI или PEG-PCCL 0,5 мг / мл смешивали с 2% раствором RBC. Положительный контроль гемолиза получали путем добавления равного объема суспензии эритроцитов и дистиллированной воды. После выдерживания смеси в течение 1 и 3 часов при 37 ° C, а затем центрифугирования при 2000 об / мин в течение 5 минут супернатанты детектировали с помощью ридера для микропланшетов (Bio-Rad, Калифорния, США) при 570 нм. Процент гемолиза рассчитывали по уравнению:гемолиз% =(OD _T –OD _NC ) / (OD _ПК –OD _NC ) × 100. Здесь OD _T , OD _NC , и OD _PC относятся к значениям оптической плотности образца, отрицательного контроля и положительного контроля соответственно. Кроме того, гемолиз in vivo анализировали путем подсчета количества эритроцитов в образце крови, взятом через хвостовую вену мышей, получавших физиологический раствор, PEI (20 мг / кг) или PEG-PCCL (20 мг / кг) в течение 3 часов.

Флебит кролика

Вены в обоих ушах кроликов использовали для сравнения инфильтрации воспалительных клеток и дегенерации эпидермиса [24, 25]. Кроликов случайным образом разделили на две группы; каждому вводили либо 1 мл физиологического раствора, либо 0,5 мг / мл PEG-PCCL через ушную вену. Кроликов умерщвляли передозировкой хлоралгидрата (4%, Sigma, США) через 24 ч после инфузии наночастиц. Были получены два образца ушной вены, включая область в 10–15 мм от кончика катетера как проксимально, так и дистально. Эти вены фиксировали в 4% растворе параформальдегида. Затем были приготовлены парафиновые поперечные срезы и окрашены гематоксилином и эозином (HE). Гистопатологическое исследование проводилось вслепую. Результаты были классифицированы в соответствии с критериями, приведенными в таблице, которые были основаны на критериях Кувахары [17] с добавлением дегенерации эпидермиса.

Тесты гепаторенальной функции

После 7 дней введения PEG-PCCL (0,5 мл, 20 мг / кг) мышам образцы крови извлекали из орбитального венозного сплетения (2 мл) и немедленно центрифугировали при 1300 g, 4 ° C. Супернатант удаляли. Затем параметры биохимии сыворотки [26], включая аспартатаминотрансферазу (AST), аланинаминотрансферазу (ALT), щелочную фосфатазу (ALP), билируби, креатинин, мочевую кислоту и альбумин, оценивали с помощью автоматического биохимического анализатора животных (Dri-Chem 3000). , Fuji Photo, Tokyo, Japan), которые являются косвенными индикаторами функции печени и почек.

Гистопатологическое исследование

Гистопатологические изменения легких, печени и почек изучали с окрашиванием H&E через 24 часа, 48 часов и 7 дней после инъекции PEG-PCCL, раствора PEI или физиологического раствора (0,5 мл, 20 мг / кг) через мышей. хвостовая вена. Эти органы были получены после жертвоприношения животных. Раздел гистопатологии и окрашивание H&E выполняли, как описано в другом месте [26]. Патогистологические изменения наблюдали под световым микроскопом и регистрировали с помощью различных камер (Leica, Co. Ltd., Германия).

Концентрация крови

Концентрацию PTX в крови рассчитывали с помощью спектрофотометра (LAMBDA 950, PerkinElmer, Китай). Образцы крови брали из орбиты мышей через 0,08, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 2, 6, 12, 24 ч после обработки. Супернатант (100 мкл) собирали после центрифугирования при 1300 g в течение 10 мин. Концентрация PTX в каждом образце крови определялась спектрофотометром при 760 нм.

Модели опухолей мыши и лечение

Суспензия клеток H22 (0,25 мл, 4 × 10 ⁶ клеток / мышь) внутрибрюшинно вводили мышам Balb / C в день 0. Когда образовался асцит (на 3-5 день), мышей с опухолью случайным образом делили на три группы ( n =5), и лечение было начато. Мышам вводили физиологический раствор, PEG-PCCL / PTX (20 мг / кг) или PTX (10 мг / кг) внутрибрюшинно в объеме 0,5 мл на 3 и 10 дни для оценки противоопухолевой эффективности. Абдоминальный периметр (AP) измеряли каждый день, чтобы рассчитать увеличенный процент AP (IPAP), по следующей формуле:IPAP =( P _n - P ₀ ) / P _n . На 10 день выживших мышей умерщвляли смещением шейных позвонков, собирали и взвешивали асцит. Время выживания мышей наблюдали до 20 дня. Мышей с опухолями казнили в конечной точке с признаками дистресса, включая высокую частоту дыхания, взъерошенность шерсти, сутулость, снижение активности и прогрессирующее образование асцита [27]. Противоопухолевую активность всесторонне оценивали по дням выживания, периметру брюшной полости и объему асцита. Мышей кормили в стандартных лабораторных условиях.

Статистический анализ

Статистический анализ выполнялся с помощью SPSS 19.0 (IBM, NY, США). Каждое экспериментальное лечение повторялось независимо не менее трех раз. Данные были представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (SD). Для статистического анализа использовали дисперсионный анализ (ANOVA). Степень каждого обнаруженного флебита анализировалась с помощью критерия суммы рангов Вилкоксона. Тест Даннета использовался для сравнения отдельных вмешательств. Статистическая значимость была обозначена на P . <0,05.

Результаты

Морфология, диаметр и дзета-потенциал PEG-PCCL

Результаты лазерного анализатора размера частиц показали, что средний диаметр PEG-PCCL составлял 97 ± 2,6 нм. Результаты ПЭМ PEG-PCCL (фиг. 2) показали, что PEG-PCCL имел сферическую форму и был однородным в растворе. Средний дзета-потенциал PEG-PCCL составлял -18,4 мВ. Метод центрифугирования на мини-колонке показал, что EE% составил 55,98%.

Характеристика изображения ПЭГ-ПКСЛ:ПЭМ. Масштабные полосы были 100 нм

Цитотоксичность

Цитотоксичность PEG-PCCL оценивали путем сравнения с PEI, типичным наноразмерным носителем, в клеточных линиях HEK293T и Hep-G2. В диапазоне концентраций (от 0 до 1 мг / мл) PEG-PCCL или PEI жизнеспособность как клеток HEK293T (рис. 3a), так и опухолевых клеток (Hep-G2) (рис. 3b) снижалась в зависимости от концентрации. манера. Эмбриональные клетки оказались более чувствительными при концентрации 0,25 мг / мл, а опухолевые клетки - более 1 мг / мл. По сравнению с PEI, PEG-PCCL показал меньшую цитотоксичность, особенно при более высоких концентрациях, то есть 0,75 и 1 мг / мл ( P =0,023). Анализ LDH показал, что уровень смертности как в эмбриональных, так и в опухолевых клетках увеличивался со временем воздействия; (i) это было 19 и 42% через 24 и 48 часов соответственно при 0,5 мг / мл PEG-PCCL (рис. 3c) меньше, чем у PEI. (ii) Опухолевые клетки показали немного более низкий уровень смертности (32%) в течение 48 часов, когда клетки подвергались воздействию PEG-PCCL, по сравнению с PEI ( P =0,037) (рис. 3г).

Цитотоксичность PEG-PCCL по сравнению с PEI. а , b Анализ MTT показал выживаемость 293 T и концентрацию HepG2 в зависимости от группы отрицательного контроля (PEI). c , d Анализ утечки ЛДГ 293 Т и HepG2 при воздействии PEG-PCCL и PEI через 48 часов. * P <0,05 по сравнению с группой PEI

SEM

Электронно-микроскопические изображения интактных клеток Hep-G2 и клеток, обработанных наночастицами PEG-PCCL, показаны на рис. 4. В интактных клетках Hep-G2 на каждой поверхности было много микроворсинок (Mv), а ядро ​​(N) было расположены ближе к основанию, чем апикальная часть. В цитоплазме были распределены многочисленные митохондрии (Mt), комплекс Гольджи (Go) и грубая эндоплазматическая сеть (RER). В клетках, обработанных PEG-PCCL, количество пиноцитотических пузырьков определенно увеличивалось. Никаких значительных гистопатологических изменений не наблюдалось, а круглые N и цитоплазматические органеллы, включая Mt, RER и Go, не были повреждены.

Электронные микрофотографии. а , b Нормальные клетки HepG2. c , d Клетки, обработанные наночастицами PEG-PCCL через SEM (растровый электронный микроскоп). Темная стрелка указывает на пиноцитотические пузырьки

Апоптоз

Значительное снижение жизнеспособности клеток может быть связано с характеристиками размера частиц, химического состава поверхности и концентрации [28], что вызвало у нас интерес к механизмам, лежащим в основе наблюдаемой гибели клеток в клетках HepG2. Чтобы определить, связана ли гибель клеток с апоптозом или некрозом, клетки HepG2 обрабатывали PEI или PEG-PCCL для совместного окрашивания аннексином V и PI. Как наблюдали под флуоресцентным микроскопом (рис. 5), клетки, обработанные PEI или PEG-PCCL, показали более ранний апоптоз по сравнению с пустой контрольной группой, на что указывает зеленая флуоресценция, окрашенная аннексином V. Клетки, обработанные PEI, демонстрировали более сильный апоптоз, чем клетки. PEG-PCCL, что соответствует предыдущему результату анализа МТТ.

Окрашивание FITC-аннексином V представляло апоптоз клеток. Клетки HepG2, инкубированные с наночастицами в концентрации 0,5 мг / мл в течение 48 часов, а затем совместно окрашенные йодидом пропидия (красный) и аннексином V (зеленый), были отображены при × 40

Биосовместимость

Гемолиз

Поскольку биосовместимые наночастицы предназначены для эндоваскулярных применений, необходимы исследования гемосовместимости и эндотелиальной цитотоксичности. Тест in vitro показал, что в течение 3 часов наблюдения гемолиз увеличивался со временем, при этом PEG-PCCL демонстрировал более низкий коэффициент гемолиза, чем нормальный физиологический раствор (рис. 6a). Тест in vivo выявил аналогичную тенденцию. Напротив, PEI вызывал тяжелый гемолиз как in vitro, так и in vivo (рис. 6b).

Коэффициент гемолиза и количество клеток (× 10 ⁹ / Л) образца крови за 3 ч. In vitro ( а ) in vivo ( b ) * P <0,05 по сравнению с группой отрицательного контроля

Флебит кролика

Гистопатологическое исследование (рис. 7) показало интактный эндотелий сосудов без некроза хрондроцитов в хряще ушной раковины. Наблюдается небольшой отек проксимального отдела вены. Что касается потери венозных эндотелиальных клеток и инфильтрации воспалительных клеток, совместная инфузия (таблица 1) групп, получавших PEG-PCCL, через 12 и 24 часа имела тенденцию к увеличению, но улучшение не было статистически значимым ( П > 0,05).

Микрофотографии ушной вены после 24-часовой инфузии, окрашенной H&E. а , b Группа инфузий с физиологическим раствором. c , d Группа инфузий с PEG-PCCL. Иглы представляют собой ушной хрящ. (Левое изображение × 10, правое изображение × 40)

Токсичность органов

Чтобы оценить острую токсичность PEG-PCCL для основных органов, гистопатологическое исследование легких, печени и почек было выполнено после внутривенного введения PEG-PCCL в дозе 0,5 мг / мл в течение 3 дней мышам ( n =5). В качестве контроля использовали физиологический раствор и PEI. Результаты показали, что PEI вызывает легкое воспаление, толщину лобулярного интерстиция и кариопикноз гепатоцитов (рис. 8). Хотя по сравнению с группой, получавшей физиологический раствор, никаких явных гистопатологических изменений не наблюдалось во всех исследованных органах в группе, обработанной PEG-PCCL (фиг. 7); гепаторенальная функция была исследована для дальнейшего подтверждения ее нетоксичности (Таблица 2).

Световые микроскопические изображения легких, печени и почек, полученные методом окрашивания H&E. Изображения получены от мышей, которым внутривенно вводили NS, PEI и PEG-PCCL. Иглы представляют собой кариопикноз гепатоцита. (Изображения левых столбцов, × 10; изображения правых столбцов, × 40)

Фармакокинетическое исследование

Фармакокинетическое исследование проводили после внутривенной инъекции 10 мг / кг PTX Taxol® или 20 мг / кг PEG-PCCL / PTX (PP + PTX) (коэффициент нагрузки 50%). Пик концентрации в плазме (Cmax) составлял 312 ± 2,59 мкг / мл (PTX) и 283 ± 2,79 мкг / мл (PP + PTX). Время максимальной концентрации (Tmax) и площадь под кривой зависимости концентрации в плазме от времени составляли 0,54 ± 0,20 ч, 52,00 ± 4,30 мкг ч / мл и 4 ± 1,22 ч, 282,21 ± 21,08 мкг ч / мл для PTX и PTX-NP. , соответственно. График зависимости концентрации в крови от времени показан на рис. 9.

График концентрация в крови - время. У мышей после внутривенного введения PTX или PP + PTX. ( нет =6)

Влияние PEG-PCCL / PTX на мышей, несущих опухоль

Чтобы исследовать противоопухолевый эффект PEG-PCCL / PTX in vivo, (i) ежедневно рассчитывали увеличенный процент абдоминального периметра (IPAP) мышей с опухолью H22 (фиг. 10a). На 3-й день начал формироваться асцит, и IPAP в каждой группе резко повысился, при этом группа PP / PTX и группа PTX, по сравнению с группой NS, показали более медленное увеличение со временем. (ii) Асцит собирали на 10-й день и измеряли объем (рис. 10b). По сравнению с группой NS, объем асцита как в группе PTX, так и в группе PP / PTX был значительно снижен ( P =0,0005 и P =0,0052), где группа PP / PTX демонстрировала меньшую громкость, чем группа PTX ( P =0,0138). (iii) выживаемость каждой группы наблюдалась в течение 20 дней, начиная с нулевого дня. Группа PP / PTX и группа PTX имели более длительную продолжительность жизни и более высокую выживаемость, чем группа NS.

Противоопухолевый эффект PP / PTX у мышей с опухолью H22. а Мыши Balb / C ( n =5) внутрибрюшинно вводили PP / PTX или PTX на 3 день. b Асциты каждой группы ( n =5) были собраны на 10-й день. c Выживаемость каждой группы ( n =10) наблюдали ежедневно. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001

Обсуждение

Было высказано предположение, что многие полимеры, включая PEI, являются носителями химических и биофармацевтических препаратов для соответствующей конъюгации. PEI - это широко исследуемый катионный полимер, который считается золотым стандартом в анализах эффективности трансфекции [29]. Однако побочные эффекты (например, цитотоксичность) препятствуют применению PEI в медицинских целях. Для поиска более безопасного и эффективного материала на основе наночастиц мы успешно подготовили новый кандидат для доставки лекарств; PEG-PCCL характеризуется высокой гидрофильностью и благоприятной стабильностью благодаря эффекту водородной связи. Основная цель исследования заключалась в оценке токсичности PEG-PCCL in vivo и in vitro, что открывает потенциально терапевтическое окно для лечения рака.

Поскольку повышенная проницаемость и удерживающий эффект рассматриваются как механизмы доставки, избирательные к опухолям, наноразмерным лекарствам уделяется значительное внимание [30, 31]. Наночастицы меньшего диаметра имеют лучшую иммуносовместимость [32] и меньшее поглощение печенью, более длительное время циркуляции крови и более высокую биодоступность [33]. Наши диполимеры имеют соответствующий размер (97 ± 2,6 нм) (рис. 2), чтобы проникать в и из кровеносного сосуда опухоли, а также ускользать от иммунной системы хозяина, в то время как катионные полимеры с положительным дзета-потенциалом были токсичны [34]. Предполагалось, что в идеале следует избегать этой токсичности PEG-PCCL с отрицательным дзета-потенциалом. Действительно, при оценке токсичности в настоящем исследовании было мало опасений по поводу токсичности PEG-PCCL. Аналогичные результаты были получены и в другой лаборатории [35,36,37].

Эксперименты in vitro показали отсутствие токсичности для PEG-PCCL. Как наблюдали с помощью SEM (рис. 4), (i) пиноцитотические везикулы, обозначенные темной стрелкой, указывают на значительный эндоцитоз [38]. (ii) Полное ядро ​​и интактные органеллы (Mt, RER и Go) показали небольшую цитотоксичность и хорошую биосовместимость PEG-PCCL на клеточном уровне. В анализе МТТ и анализе утечки ЛДГ (рис. 3) PEI и PEG-PCCL привели к аналогичной тенденции жизнеспособности клеток в зависимости от дозы и времени как в Т-клетках 293, так и в клетках HepG2, хотя PEG-PCCL показал более низкую цитотоксичность, особенно при более высоких концентрациях ( P <0,05). Эти результаты свидетельствуют о том, что ковалентное связывание карбоксила не увеличивает дополнительную токсичность. Гемолиз in vitro широко признан полезным и надежным методом оценки совместимости NP с кровью. В тесте на гемолиз in vitro PEG-PCCL показал более низкий коэффициент гемолиза, чем нормальный физиологический раствор (рис. 6a). Это может быть связано с отрицательным потенциалом PEG-PCCL, который защищает клетки крови. Тест на гемолиз in vivo выявил аналогичную тенденцию. Напротив, PEI демонстрировал тяжелый гемолиз. В совокупности наночастицы PEG-PCCL гемосовместимы, поскольку они не проявляют никакого гемолитического эффекта ни в модели in vitro, ни в модели in vivo (рис. 6b).

The innoxious nature of PEG-PCCL was further proved by in vivo experiments. Since phlebitis induced by intravenously administered antineoplastic agents [24] is frequently seen in clinical practice, we tested the inflammatory reaction after PEG-PCCL injection. In the rabbit phlebitis study (Fig. 7), little inflammatory infiltration or tissue edema was observed, indicating that the new formulation of chemotherapeutic drugs captured by PEG-PCCL is biocompatible, and that co-infusion of PEG-PCCL could be a favorable candidate as intravenous drug deliverer. Meanwhile, in the H&E staining assay (Fig. 8), no obvious histopathological changes of organs were observed in PEG-PCCL nanoparticles treatment group compared to normal group. Further hepatorenal function was investigated for safety evaluation (Table 2), in which no significant differences were shown between normal saline group and PEG-PCCL group. Consequently, it is evident that PEG-PCCL is a kind of safe and non-toxic nanoparticles with potentiality to be applied in targeting intervention.

Furthermore, preliminary evaluation of drug-loaded effect in regard of pharmacokinetics and anti-tumor was carried out in H22 tumor-bearing mice. In the pharmacokinetic study (Fig. 9), Tmax of PP + PTX was 4 ± 1.22 h, which exhibited better persistence than that of PTX (0.54 ± 0.20 h). PP + PTX also performed larger area under the plasma concentration-time curve than PTX. These results showed that PEG-PCCL/PTX lasted longer than PTX alone in blood, which indicated higher stability and more delayed release of PEG-PCCL/PTX. However, the EE% of PEG-PCCL was dissatisfactory (55.98%) and sustained drug release was less than ideal (4 ± 1.22 h). Therefore, more research is needed to modify the nanoparticle to achieve a higher EE and longer drug release. For example, adjusting the proportion of PEG and PCCL can be considered [39]. Although no metastasis was seen in abdominal organs in our model, tissue distribution and concentration of PTX-NPs should be investigated in further study to find out the possible side effects. Moreover, the combination of PEG-PCCL and PTX made an improvement in life expectancy and a reduction in tumor ascites formation (Fig. 10). Notably, the anti-tumor effect was enhanced when PTX was loaded with PEG-PCCL, suggesting a possibility of a promising drug carrier. Besides, nanoparticles may be beneficial to confront anti-tumor drug resistance. Modification with folate [40] has been reported to overcome TLR4 driven chemotherapy resistance, and its co-encapsulation of anti-tumor agents [41] could be a promising option. Nanoparticle modified by additional Fe₃ О ₄ [42] may be more easily guided to its targets under the applied magnetic field, which would lower chemotherapeutic drugs-induced systemic toxicity [43].

Conclusions

PEG-PCCL nanospheres showed less cytotoxicity and better biocompatibility than mature medical nanoparticles (PEI) at the therapeutical concentration. PEG-PCCL-loaded PTX revealed higher stability and slower release in tumor mice. These results suggest that PEG-PCCL is a potential candidate of biocompatible drug vehicle for hydrophobic drugs.