Наночастицы маггемита действуют как нанозимы, улучшая рост и устойчивость к абиотическому стрессу у Brassica napus

Фон

Продовольственная безопасность имеет первостепенное значение и является неотложной проблемой нашего меняющегося мира. Меняющийся климат и рост населения заставляют ученых-растениеводов и сельскохозяйственных инженеров вводить новые усовершенствованные инструменты для обеспечения производства продуктов питания с меньшим воздействием на окружающую среду. Нанотехнологии - один из таких новых инструментов, которые можно использовать для решения этой давней проблемы [1,2,3]. Предполагается, что нанотехнологии станут важной и неотъемлемой частью цепочки производства продуктов питания, играя, например, роль в защите растений [4,5,6], удобрениях [7, 8], биосенсорах и точном земледелии [9], упаковка и безопасность пищевых продуктов [10]. Наночастицы распространены в природе повсеместно, и растения эволюционировали, подвергаясь воздействию различных наночастиц [11]. Наночастицы оксида железа (ИОН) составляют важную часть встречающихся в природе наночастиц [12]. Имеются данные о том, что растения и почвенные микробы продуцируют ИОН [11, 13, 14]. В то время как некоторые исследователи были обеспокоены токсичностью сконструированных ИОНов для растений [15, 16], другие сосредоточили внимание на возможности использования ИОНов в качестве удобрения [17,18,19,20,21,22]. Магнитные наночастицы магнетита Fe ₃ О ₄ и маггемит γ-Fe ₂ О ₃ Предполагается, что структура является эффективными нанозимами, обладающими как способностью миметика пероксидазы (при низком pH), так и способностью миметика каталазы (при нейтральном pH) [23,24,25]. Было показано, что при определенных концентрациях нанокись железа увеличивает рост растений по сравнению с добавлением эквивалентных количеств ионов двухвалентного железа в хелатной форме [17]. Мы предполагаем, что ферментативные способности нанооксида железа могут стимулировать рост растений выше, чем просто удобрение железом. Кроме того, мы предполагаем, что это должно помочь растениям во время обычных абиотических стрессов, таких как засуха, когда каталаза и пероксидаза становятся важными для поглощения высвобождаемых активных форм кислорода (АФК). Здесь мы представляем исследования для проверки этой гипотезы на γ-Fe ₂ О ₃ и масличный рапс, выращенный в почве и в контролируемой среде.

Результаты

Влияние частиц на свойства растений

Добавляя ИОН, мы увеличили рост масличного рапса по сравнению с простым добавлением достаточного количества хелатного железа. Длина листа показала статистически значимое увеличение по сравнению с контролем, что свидетельствует об увеличении либо деления клеток, либо удлинения клеток (рис. 1а). До того, как растения подверглись засухе, наблюдалось статистически значимое увеличение содержания хлорофилла, измеренное с помощью SPAD-метра, что свидетельствует о повышенной пригодности этих растений по сравнению с контролем (рис. 1b).

Различные физиологические параметры растений, выращенных в горшках с почвой, орошаемой питательными веществами или питательными веществами, содержащими ИОН. а Увеличение длины отдельных листьев от до и после 5 дней ИОН-обработки ( n =16, p значение =0,053). б Содержание хлорофилла в листьях, измеренное с помощью измерения SPAD ( n =16, p значение =0,000). Разные буквы означают статистически значимое различие

Потеря воды не показала статистически значимой разницы, но наблюдалась тенденция к большему удержанию воды при обработке ионами (рис. 2а). Свежие массы, которые также учитывают рост растений, всегда имели более высокие значения для обработок ИОН (рис. 2b) и в некоторых случаях были статистически значимыми. Например, один эксперимент с продолжительной засухой можно увидеть на рис. 3.

Параметры растений после стресса засухи. а Процент веса растения, составляющий воду. б Биомасса растений после 5 дней засухи ( n =8, p значение =0,127). Разные буквы означают статистически значимое различие

Свежий вес растений, измеренный через 5 дней засухи. Статистически значимая разница с 15 биологическими повторностями и p значение 0,01

Учитывая, что контроль также имеет достаточное количество железа, большие различия в свежем весе будут исключительными. Было замечено, что растения, обработанные ИОНами, лучше справлялись, чем контрольный образец, во время засухи и лучше восстанавливались после повторного полива (рис. 4).

Фото растений после повторного полива после 5 дней стресса засухи. а Контрольные растения орошают питательным раствором. б Растения орошают питательным раствором, содержащим 0,8 мг / мл ИОНОВ. c Орошение растений питательным раствором, содержащим 2 мг / мл ИОНОВ

Влияние ионов на концентрацию перекиси водорода в листьях

Количество перекиси водорода в листе после засухи значительно снизилось, когда ИОН были добавлены в питательный раствор, используемый для полива. Вариация была высокой в ​​0,8 мг / мл ^-1 лечение; следовательно, разница по сравнению с другими видами лечения не является статистически значимой. Однако разница между контролем и максимальной концентрацией 2 мг / мл ^-1 статистически значимо с p значение 0,004 и в среднем на 84% больше в контрольной группе (рис. 5).

Количество растворимой перекиси водорода на грамм ткани листа масличного рапса, обработанного питательным раствором, содержащим ИОН, и зараженного засухой в течение 5 дней ( n =16, p значение =0,004)

Влияние ионов на перекисное окисление липидов

Перекисное окисление липидов с уровнями МДА в качестве заместителя было снижено путем добавления ИОНов, при этом средняя концентрация МДА в листьях растений была на 36% ниже при добавлении 200 мг ИОНов. Мы добавили положительный контроль с такой же молярной концентрацией ионов железа (III); однако разброс был слишком большим, чтобы делать какие-либо выводы. Среднее значение более низкой концентрации ИОНА также было ниже, чем в контроле, что свидетельствует о тенденции к снижению перекисного окисления липидов в листьях масличного рапса (рис. 6).

Концентрация продукта перекисного окисления липидов МДА в листьях масличного рапса, обработанных питательным раствором, содержащим ИОН, и засуха в течение 5 дней ( n =8, p значение =0,052)

Поглощение растительных частиц

Чтобы исследовать поглощение частиц тканью листа, мы измерили содержание железа в листьях с помощью атомно-эмиссионной спектроскопии с индуктивно связанной плазмой (ICP-AES). Действительно, статистически значимое увеличение количества железа наблюдалось при обработке наночастиц маггемита. Интересно, что концентрация железа снижалась в листьях, орошаемых избыточными ионами железа (III) (рис. 7).

Концентрация железа в листьях капустного кустарника после обработки наночастицами маггемита по сравнению с контролем с тем же питательным раствором или тем же питательным раствором с соотношением ионов железа (III) 1:1. Разные буквы означают статистически значимое различие ( n =15)

Чтобы еще раз подтвердить повышенное содержание железа как доказательство поглощения частиц, мы измерили низкотемпературную намагниченность в тех же листьях. Большая намагниченность наблюдалась при контроле в сильном магнитном поле, но без магнитного поля остаточная намагниченность была больше в листьях, обработанных наночастицами маггемита (рис. 8 и 9). Из-за небольшого размера выборки и большого разброса различия не являются статистически значимыми, но тенденция ясно показывает присутствие суперпарамагнитных ионов, поскольку намагниченность выше при контроле при сильных магнитных полях, но ниже при отсутствии магнитного поля. Он затенен из-за вариаций, но в некоторых образцах присутствие ИОНов было четко видно (дополнительный файл 1:Рисунок S2). С одной стороны, при достаточно низкой температуре и достаточно высоком магнитном поле намагниченность для ионов железа будет больше, чем для ферримагнитных ионов. С другой стороны, при той же низкой температуре, но при нулевом магнитном поле остаточная намагниченность будет больше для ИОНов из-за заблокированных магнитных моментов наночастиц.

Низкотемпературная (2 K) намагниченность озоленных листьев растений, обработанных наночастицами маггемита, по сравнению с контрольными растениями. Планки погрешностей показывают стандартную ошибку среднего ( n =6)

Низкотемпературное (2 К) намагничивание золы листьев в различных магнитных полях. На графике выше при 10000 э.э. p значение 0,8, а график ниже в нулевом поле имеет p значение 0,08 ( n =6)

Характеристики материалов

ИОН, полученные методом Cui et al. (2013) сформировали гель, что свидетельствует об успешном производстве наночастиц порядка ~ 1–10 с нм. Высушенный гель растирали в порошок. СЭМ низкого разрешения не может показать отдельные частицы, но иерархическая структура порошка очевидна; EDS образца не обнаружила Y, только железо (рис. 7).

При диспергировании в воде частицы образуют агрегаты с гидродинамическим размером до 500 нм, однако 84% агрегированных частиц меньше 300 нм и по крайней мере 11% меньше 50 нм. В абсолютных величинах, согласно измерениям Nanosight, есть 4,28 × 10 ⁶ частицы размером менее 20 нм / мл ^-1 , в 50 раз разбавленной дисперсии, необходимой для измерения (рис. 8). Возвращаясь назад, это означает, что имеется примерно 2 × 10 ⁸ частицы размером менее 20 нм / мл ^-1 в процедурах.

На изображениях, полученных с помощью АСМ, видна картина, аналогичная НТА в сочетании с рентгеновской дифракцией vide Infra, с размерами частиц от нескольких нанометров до агрегатов в несколько сотен нанометров (рис. 9).

XRD частиц был получен через 1 год после производства и все еще показывает четкую структуру структуры маггемита, что свидетельствует об успешной стабилизации маггемита (рис. 10). Расчетный размер кристаллитов составлял 3,8 нм с использованием уравнения Шеррера. Несмотря на то, что структура сохраняется, введение 13% Y по весу, конечно, влияет на колебательные состояния атомов (дополнительный файл 1:Рисунок S3).

Сканирующее электронное изображение γ-Fe ₂ О ₃ синтезирован с помощью золь-гель-синтеза, направленного иттрием, и EDS-спектра того же материала

Обсуждение

Предлагаемое использование ИОНов в качестве железных удобрений ранее исследовалось в других системах [17,18,19]. В этом исследовании впервые было проверено, существует ли ферментативный эффект подобного удобрения в дополнение к эффекту обеспечения микроэлементом, железом, важным видам сельскохозяйственных культур. Контрольной группе вводили адекватное количество хелатного железа. Мы также протестировали положительный контроль, в котором молярное эквивалентное количество ионов железа (III) было добавлено к отрицательному контролю с адекватным количеством доступного для растений железа. Следовательно, положительные эффекты от ИОНов, наблюдаемые в наших экспериментах, связаны со свойствами ИОНов. Мы хотели бы предположить, что здесь играют роль известные ферментативные эффекты ИОН [23, 25, 26]. Нельзя исключать и другие механизмы - ионы также могут взаимодействовать с белками, липидами и другими биомолекулами [27], или может случиться так, что наночастицы абсорбируют естественные ионы железа на поверхности и, следовательно, уменьшают вредные реакции Фентона. Тот факт, что уровень перекиси водорода в листьях был снижен при ИОН-обработке, сам по себе является косвенным доказательством поглощения наночастиц. Вместе с повышением содержания железа и изменением намагниченности в маггемите картина становится более полной. Положительный контроль с ионами железа (III) имел пониженную концентрацию содержания железа в листьях, что указывает на то, что растения обладают способностью снижать поглощение ионов железа в качестве защитного механизма. Это также предполагает, что повышенная концентрация железа в листьях при обработке маггемитом действительно является наночастицами, которые не так токсичны для растений, как может быть повышенный уровень ионов железа. Магнитные измерения показывают суперпарамагнитное поведение и заблокированные магнитные моменты наночастиц при низких температурах, типичных для очень малых γ-Fe ₂ О ₃ в листьях, обработанных маггемитом [28], что ясно демонстрирует захват наночастиц. Введенное минимальное количество Y не должно оказывать никакого воздействия на растения; мало что известно о влиянии Y на растения, но Fu et al. (2014) установили, что 2 мг л ⁻¹ Y - средняя летальная доза (LD50) в гидропонной системе, а Maksimovic et al. (2014) начали наблюдать токсические эффекты при 10 ⁻⁵ моль л ⁻¹ Y [29, 30]. В максимальной концентрации, использованной в наших экспериментах, приблизительное количество 50 мг (5,6 10 ⁻⁴ моль) Y добавляли на горшок путем орошения почвы, из которого можно ожидать поглощения только части. То, что поглощается, не должно быть легко доступно в виде ионов, а должно быть связано в частицах маггемита. Целью введения Y в синтез является снижение растворимости наночастиц маггемита, а также предотвращение превращения в гематит, менее ферментативную форму оксида железа. Несомненно, повышение активности каталазы во время стрессовых состояний полезно [31], поскольку известно, что целый ряд стрессовых состояний вызывает токсическое накопление H ₂ О ₂ [32] _. Кроме того, становится все более очевидным, что H ₂ О ₂ также служат сигнальной молекулой для стресса [32, 33]. Увеличение производства биомассы еще не подтверждено, желательно также изучить урожай масличных семян и их качество. Другие особенности, такие как повышенная скорость роста листьев, что является очень хорошим свойством в сельскохозяйственных условиях, где конкуренция с сорняками имеет решающее значение, легко могут быть приняты во внимание. Это было показано на Arabidopsis что наночастицы нуль-валентного железа могут вызывать экструзию протонов в апопласт листьев и тем самым обеспечивать расширение клеточной стенки за счет тургора [34]. Такой же эффект наблюдался и в корнях, что также могло быть полезным при стрессе засухи [35]. Они также наблюдали увеличение устьичных отверстий на листьях, что могло привести к потере воды, но когда они измерили, разница по сравнению с контролем была лишь незначительной. Это известный парадокс, что связь между открытием устьиц и транспирацией воды не является линейной [36]. На эту взаимосвязь также сильно влияет окружающая среда, например, относительная влажность или ветер [37]. Хотя нульвалентные наночастицы, конечно, не следует рассматривать как маггемит, механизм удлинения листа, наблюдаемый в наших экспериментах, должен быть исследован. Гафариян и др. (2013), как и мы, наблюдали увеличение концентрации хлорофилла в листьях при добавлении ИОНов по сравнению с отрицательным контролем без железа. По сравнению с хелатным железом разницы не было. Однако добавление равных количеств хелатного железа к ионам приведет к получению большего количества железа, доступного для растений, поскольку в случае частиц большая часть железа хранится в кристаллических структурах. Следовательно, существует вероятность того, что растения, удобренные ионами, действительно страдают дефицитом железа. Мы обнаружили большее количество хлорофилла в листьях (согласно измерениям SPAD, см. Рис. 1), когда ИОН были добавлены как вспомогательные к хелатному железу. Мы также измерили снижение количества перекиси водорода и МДА в листьях после засухи, когда мы добавили ИОН. Rui et al. (2016) измеряли не перекись водорода, а MDA и ферменты, связанные с окислительным стрессом. Они предположили, что окислительный стресс не возникает из-за добавления ИОНов, и действительно, они также обнаружили пониженное количество МДА в листьях по сравнению с хелатным железом на 10 мг / кг ^-1 концентрация. В корнях они увидели уменьшение МДА по мере увеличения концентрации ИОНов. Они также измерили пониженное количество супероксиддисмутазы и активности пероксидазы по сравнению с хелатным железом, предполагая, что наша гипотеза о том, что ИОН ​​могут работать как реактивные поглотители кислорода in vivo, может быть верной. Реактивное поглощение кислорода было дополнительно продемонстрировано измеренным нами снижением перекиси водорода в листьях Brassica napus . Это объясняет повышенную устойчивость к засухе, наблюдаемую при добавлении ИОНОВ.

Выводы

Наши эксперименты предоставили доказательства механизма действия ИОНов как нанозимов in planta , выявляя связь между снижением содержания перекиси водорода в листьях Brassica napus и внедрение ИОНов. Таким образом, повышенная устойчивость к засухе, наблюдаемая при добавлении ИОНов, может быть связана со снижением окислительного стресса.

Методы

Условия и план экспериментов

Brassica napus семена ярового рапса сорта Лариса (Scandinavian Seed AB, Лидчёпинг, Швеция) стерилизовали и проращивали на чашках с агаром в течение 3 дней перед переносом сеянцев аналогичного размера в горшки со стерилизованной S-Soil (сад Hasselfors, Эребро, Швеция) . Это почва для профессионального выращивания рассады с низким содержанием всех макро- и микронутриентов, перлитом для аэрации, гуминовыми кислотами, стимулирующими рост, и pH 6. Растениям давали прижиться в горшках на 7 дней, орошали деионизированной водой. вода. Перед началом обработки растения распределяли по лоткам, чтобы размер растений был как можно более постоянным. С седьмого дня после пересадки в горшки растения орошали питательным раствором, питательным раствором с дополнительным количеством FeCl ₃ . или питательный раствор с разными концентрациями γ-Fe ₂ О ₃ ИОНОВ. Каждый горшок поливали 40 мл каждый день. Растения выращивали в камере для выращивания с 16-часовым освещением (180 мкЕ м ^-2 s ⁻¹ ) и 8-часовая темнота. Температуру устанавливали на 25 ° C во время облучения и 22 ° в темноте, а относительную влажность на 65%. Растения выращивали в горшках 8 × 8 см на лотках по восемь горшков в каждом. Каждая обработка имела две чашки и 16 биологических повторов. Лотки перемещали в порядке вращения каждый день, чтобы компенсировать любые изменения в камере. Лечение продолжалось 5 дней, добавляя в общей сложности 200 мл 0,5, 0,8, 1 или 2 мг / мл ^-1 , всего 100, 160, 200 или 400 мг на растение соответственно. После 5 дней добавления ИОНов все обработки поливали питательным раствором (Дополнительный файл 1:Таблица S1) еще в течение 5 дней до начала 4 дней засухи. После 4 дней засухи были проведены измерения перекиси водорода и перекисного окисления липидов, и растения снова поливали тем же питательным раствором в течение 3 дней для изучения восстановления. Эксперимент повторяли четыре раза.

Синтез и характеристика наночастиц

Частицы маггемита были получены в соответствии с методом [38] с содержанием иттрия (Y) примерно 13% и охарактеризованы с помощью дифракции рентгеновских лучей (XRD), сканирующей электронной микроскопии (SEM), анализа слежения за наночастицами (NTA), инфракрасной спектроскопии. (FTIR), термогравиметрический анализ (TGA) и атомно-силовая микроскопия (AFM). СЭМ-изображения были получены на Hitachi TM1000 с электронно-дисперсионным рентгеновским спектрометром (EDS) Oxford μDeX. Гидродинамический размер был измерен с помощью анализа нанотрекинга (NTA) на Nanosight 300 (рис. 11). Perkin-Elmer Spectrum 100 использовали для проведения инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье (FTIR) в таблетках бромида калия (KBr). Для термогравиметрического анализа (ТГА) использовали Perkin-Elmer Pyris 1, а для атомно-силовой микроскопии (АСМ) - Bruker FastScan (рис. 12). XRD выполняли на многоцелевом дифрактометре Bruker Smart ApexII с источником молибдена; размер кристаллитов был рассчитан с помощью уравнения Шерера с использованием наибольшего пика при угле 2θ ° 16,197 с полушириной на полувысоте (FWHM) 1,01358489355378, рассчитанной с помощью функции поиска пиков программного обеспечения Origin (рис. 13). Высушенные ИОН суспендировали в питательном растворе с 3,4 мг л ^-1 . хелатное железо, такое же, как и в контроле. Полный список всех питательных веществ см. В дополнительном файле 1:Таблица S1.

Гидродинамическое распределение частиц γ-Fe ₂ по размерам в воде, измеренное с помощью NTA. О ₃ синтезирован иттриевым золь-гель синтезом. Значения усреднены из четырех повторных измерений, а область внутри тонких линий представляет собой среднюю ошибку

Наночастицы маггемита, синтезированные с помощью золь-геля, направленного на иттрий, диспергированы на кремниевой пластине и визуализированы с помощью АСМ. Одно и то же изображение представлено в 3D и 2D

Порошковая дифрактограмма полученных наночастиц маггемита. Пики совпадают с положениями стандартного маггемита из базы данных, обозначенными точкой с падающей линией в основании рисунка. Размер кристаллитов рассчитывали по наибольшему пику при 16,197 2 θ угол в градусах

Измерение характеристик растений

Перед началом обработки измеряли длину самого длинного листа, первого настоящего листа на каждом растении. Позже, после 5 дней последовательного орошения ионами в питательном растворе или только в питательном растворе, тот же лист был измерен снова. Результаты представлены в виде увеличения в процентах. Хлорофилл листьев оценивали с помощью SPAD-измерений с помощью SPAD-метра Minolta до и после обработки и впоследствии после засухи. Три измерения для двух листьев на растение были усреднены для каждого из 16 биологических повторов. Наконец, надземную биомассу всех растений взвешивали и помещали в алюминиевую фольгу для сушки при 110 ° C в течение 72 часов.

Содержание железа и магнитные измерения

После пяти дней засухи эксперимент был завершен, и все надземные ткани растений были озолены при 450 ° C в течение 24 часов. После гомогенизации золы взвешивали по 10 мг на образец и растворяли в 3 мл соляной кислоты 36% на шейкере в течение ночи. Затем образцы разбавляли 44,74 мл 10% этанола в воде Milli-Q и затем измеряли содержание железа с помощью ICP-AES при 238,204 нм. Для магнитных измерений один и тот же пепел помещался в держатель для образцов, и точный вес каждого образца взвешивался на прецизионных весах. Затем образец охлаждали до 2 К и выполняли развертку магнитного поля от 10000 до 0 Эрстеда на сверхпроводящем квантовом интерференционном магнитометре (SQUID). Магнитный момент держателя образца вычитался из измеренного магнитного момента перед нормализацией на вес железа в образце.

Измерения перекиси водорода

Перекись водорода в листьях определяли методом eFOX [39]. 16 растений объединяли в четыре биологических повтора по четыре растения в каждом. Пятьдесят миллиграммов было взято с самого молодого и еще свежего листа каждого растения. Затем 200 мг листового материала измельчали ​​в предварительно охлажденной ступке в жидком азоте. К порошку мы добавили 4 мл 100 мМ фосфатного буфера (pH 6,9) и растерли лед в однородную жидкость. Из этой гомогенной жидкости мы перенесли 1900 мкл в пробирку Эппендорфа объемом 2 мл и добавили 20 мкл 25 мМ сульфата двухвалентного аммония (соль Мора), 20 мкл 10 мМ сорбита, 20 мкл 10 мМ ксиленола оранжевого, 20 мкл 99 % этанола и 20 мкл 250 мМ серной кислоты. Для каждого образца был взят полный видимый спектр поглощения, но для количественного определения пероксида водорода использовалась разница между 550 и 800 нм. Калибровочная кривая от 2 до 40 мкМ перекиси водорода была построена с помощью R ² значение 0,9946.

Перекисное окисление липидов

Перекисное окисление липидов измеряли по методике [40]. Образцы собирали таким же образом, как и для измерения перекиси водорода, за исключением того, что они были гомогенизированы в 4 мл 0,1% w / v трихлоруксусная кислота (TCA). Поглощение измеряли при 532 нм и корректировали на неспецифическую мутность путем вычитания поглощения при 600 нм. Коэффициент экстинкции 155 мМ см ⁻¹ был использован для расчета концентрации малонового диальдегида (МДА).

Статистический анализ

Вся статистика проводилась в программе Minitab 17. Все данные были обработаны с помощью одностороннего дисперсионного анализа с тестом Фишера для группировки. Студенческий t был проведен тест, чтобы найти конкретный p значения между группами имеют статистически значимые различия.