Оценка новых меченных 64Cu тераностических нанозондов на основе гадолиния у голых мышей, несущих опухоль HepG2

Фон

Гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) - одна из самых распространенных злокачественных опухолей в мире. В 2012 году было 782 500 впервые диагностированных случаев рака печени и 745 500 случаев смерти от рака печени, из которых от 70 до 90% были ГЦК [1]. Большинство пациентов с ГЦК классифицируются как запущенная стадия или терминальная стадия при первом диагнозе, поэтому только 20–25% пациентов подходят для лечения [2, 3]. Следовательно, лечение рака печени требует комплексного междисциплинарного лечения, которое включает лучевую терапию в качестве основного клинически жизнеспособного метода [4].

Одним из основных ограничений лучевой терапии пациентов с ГЦК является радиационная токсичность для окружающей нормальной ткани печени. С увеличением дозировки частота осложнений лучевой терапии, включая радиационно-индуцированное заболевание печени (RILD), представляет собой серьезную угрозу для жизни пациентов [5]. Одна из стратегий, позволяющих избежать этой проблемы, - использовать радиосенсибилизаторы, которые могут накапливаться в опухолевой ткани, чтобы повысить чувствительность опухолевых клеток к радиации, чтобы опухолевые клетки с большей вероятностью были убиты более низкими дозами радиации [6].

В 2013 году Mignot et al. сконструировал новый тип многофункциональной наночастицы гадолиния, AGuIX, которая имеет небольшой диаметр (около 5 нм), как сообщается, быстро выводится почками [7] и может быть конъюгирована с радиоактивными или флуоресцентными метками для ОФЭКТ, ПЭТ, МРТ, или флуоресцентная визуализация. Поскольку эти наночастицы несут большое количество гадолиния (атомный номер 64), они могут использоваться в качестве сенсибилизаторов лучевой терапии опухолей [8]. Ряд исследований показал, что наночастицы AGuIX повышают чувствительность опухолевых клеток к лучевой терапии в различных опухолевых клетках (включая линии радиационно-устойчивых клеток) in vitro. Коэффициенты усиления сенсибилизации (SER) наблюдались в диапазоне от 1,1 до 2,5 [8]. Учитывая гораздо более низкий печеночный фон AGuIX по сравнению с высоким поглощением AGuIX опухолью в большинстве моделей опухолей из-за эффекта повышенной проницаемости и удерживания (EPR), этот тип наночастиц имеет большой потенциал для превращения в идеальный радиотерапевтический сенсибилизатор для HCC. [9].

Эти наночастицы AGuIX в основном были разработаны для лучевой терапии под контролем МРТ; однако фармакокинетика AGuIX до конца не изучена. Для количественного определения эффекта дозы при лучевой терапии очень важно определить биораспределение и фармакокинетику этих наночастиц. ⁶⁴ Cu, один из наиболее часто используемых радиоизотопов в позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ), имеет характеристики распада ( T _1/2 =12,4 ч), что обеспечивает гибкость изображения малых молекул и больших медленно очищающихся белков и наночастиц. В этом исследовании мы пометили AGuIX радиоактивной меткой ⁶⁴ Cu для первоначальной оценки его биораспределения in vivo у голых мышей с опухолью HepG2 для более точного измерения величины и продолжительности его удержания в микросреде опухоли. Для дальнейшего проведения проверочных исследований с использованием AGuIX в качестве радиационного сенсибилизатора у голых мышей с опухолью HepG2 мы использовали ¹⁸ F-FDG PET / CT, клинически проверенная технология визуализации метаболизма опухоли для мониторинга ответа на терапию и оценки метаболизма глюкозы в опухоли HepG2 до и после лучевой терапии с использованием или без AGuIX.

Методы

Общая информация

Дегидратированные, сферические наночастицы гадолиния размером менее 5 нм (AGuIX) были получены от Nano-H (Лион, Франция) и использованы без очистки. Наночастицы состоят из атомов гадолиния, прикрепленных к полисилоксановой оболочке с помощью встроенных хелаторов DOTA. Наночастицы регидратировали в стерильной воде, обработанной DEPC (Invitrogen, США), и хранили при 4 ° C до использования в соответствии с инструкциями производителя. Мегестрола ацетат был приобретен у Sigma Chemical Co. (Сент-Луис, Миссури, США). Линия клеток HCC человека, HepG2, была получена из Американской коллекции типовых культур (American Type Culture Collection, University of Virginia, VA, USA). ⁶⁴ Изотоп Cu был приобретен в Висконсинском университете. Другие химические вещества и реагенты были приобретены у Sigma Chemical Co. (Сент-Луис, Миссури, США) и использовались без дополнительной очистки или обработки. Шестинедельные самцы бестимусных голых мышей BALB / c массой от 16 до 18 г были приобретены у Charles River. Исследование на животных было одобрено Комитетом по уходу и использованию животных в Университете Вирджинии.

Просвечивающая электронная микроскопия (ТЕМ)

Наночастицы AGuIX в концентрации 0,5 мМ в указанных выше растворах инкубировали с клетками HepG2 в течение 1 ч [10]. Затем оставшиеся наночастицы промывали 0,1 М фосфатным буферным солевым раствором и очищали центрифугированием. Осадки клеток с наночастицами окрашивали 4% формальдегидом и 1% глутаровым альдегидом в 0,1 M Pb для визуализации.

⁶⁴ Радиоактивная метка Cu

Наночастицы AGuIX были помечены радиоактивной меткой ⁶⁴ Изотоп Cu. Сначала мы смешали 200 мкл раствора наночастиц AGuIX (10 мкмоль AGuIX) со 100 мкл 0,5 М NH ₄ . Буфер OAc (pH =5,5). После инкубации в течение 5 минут, 1-3 мКи ⁶⁴ CuCl ₂ в 0,1 н. HCl и реакционную смесь инкубировали при 37 ° C в течение 1 часа. Затем реакционную смесь стерилизовали фильтрованием через ультрацентробежный фильтр 3k Amicon (Merck Millipore). Радиохимическую чистоту определяли методом iTLC с использованием 20 мМ лимонной кислоты в качестве подвижной фазы, как описано ранее [11].

Модели опухоли

Клетки HepG2 выращивали в MEM, содержащем 1 мМ пирувата натрия, 1 мМ заменимых аминокислот и 10% FCS (Life Technologies, Inc., Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США). Клетки поддерживали во влажной атмосфере воздух / CO ₂ . (19/1), и их субкультивировали каждые 2–3 дня.

Клетки HepG2 (5 × 10 ⁶ ) были собраны в 0,1 мл HBSS, и эти клеточные суспензии затем инъецировались подкожно в правый бок каждой голой мыши с использованием иглы 27-го размера. Уши голых мышей, которым вводили клетки, были помечены для идентификации. Обычно солидные опухоли начинают становиться видимыми через 2 недели после инъекции клеток HepG2.

Биораспределение у мышей с опухолями ⁶⁴ Cu-AGuIX

Голых мышей с опухолями (5 самцов и 4 самки) случайным образом разделили на три группы и внутрибрюшинно вводили ⁶⁴ Cu-AGuIX с активностью примерно 0,9 МБк в объеме 0,2 мл. Мышей умерщвляли смещением шейных позвонков под анестезией с помощью ингаляции изофлуорана через 9, 21 и 40 часов после инъекции. Представляющие интерес органы (сердце, мышца, легкое, почка, селезенка, печень, опухоль и т. Д.) Вскрывали и взвешивали, и из полости желудочка брали 100 мкл крови. Активность для каждого образца определяли с использованием счетчика γ (CRC-7, Capintec Inc., Нью-Джерси, США). Распределение радиоактивности в различных тканях и органах было рассчитано и выражено как процент инъекционной дозы на грамм (% ID / г).

Изображение ⁶⁴ на микро-ПЭТ Cu-AGuIX у голых мышей

⁶⁴ Cu-AGuIX (22,2 МБк) в 0,2 мл физиологического раствора вводили внутрибрюшинно каждой голой мышам с опухолью. Каждое животное помещали ничком на кровать системы ПЭТ (SuperArgus, Sedecal, Испания). Изображения ПЭТ были получены для разных периодов времени через 9 и 21 час после инъекции ⁶⁴ Cu-AGuIX под анестезией 4–5% изофлурана для индукции и 1–2% для поддержания, уравновешенных кислородом.

Настройка облучения и ¹⁸ Оценка ксенотрансплантатов с помощью F-FDG PET

Для исследований с помощью ПЭТ-визуализации для оценки радиосенсибилизации AGuIX во время лучевой терапии 12 голых мышей с опухолями HepG2 были разделены на три группы, по четыре мыши, случайным образом распределенных на группу. Для базовой ПЭТ-визуализации мышам вводили ¹⁸ F-FDG (16,4 ± 4,7 МБк) через хвостовую вену и держали под общей анестезией в течение 10 минут при статической визуализации ПЭТ через 30 минут p.i. (после инъекции) с помощью ПЭТ-сканера для мелких животных (Madiclab, Шаньдун, Китай). Изображения ПЭТ были восстановлены с использованием алгоритма 3D OSEM, размер вокселя 0,91 × 0,90 × 0,90 мм и пространственное разрешение в центре поля зрения 1,3 мм.

Для исследования облучения каждая группа получала инъекции в хвостовую вену 0,1 мл физиологического раствора, 1 мг (0,1 мл) AGuIX и 10 мг (0,1 мл) AGuIX. Через 1 час после инъекции этих голых мышей облучали с использованием источника рентгеновского излучения (X-RAD 320, Precision X-Ray, North Branford, CT, USA), который работал при 250 кВ и 8 мА, с 2- мм Al-фильтр при мощности дозы 1,2 Гр / мин для общей дозы 6 Гр. На следующий день тот же протокол облучения был повторен с мышами. Через 1 день после двух сеансов облучения у этих мышей было обнаружено ¹⁸ ПЭТ F-FDG (11,1 ± 1,0 МБк) с использованием того же протокола, что и первое сканирование ПЭТ. Стандартное максимальное значение поглощения (SUVmax) определяли путем рисования областей интереса (ROI) в областях опухоли (Madiclab, Shandong, CN).

Статистический анализ

Все эксперименты проводили в трех экземплярах, и результаты выражали как среднее значение ± стандартная ошибка (SE). Статистически значимые различия были рассчитаны с использованием двустороннего непарного t тест или односторонний дисперсионный анализ; p значения <0,05 (*) и <0,01 (**) считались значимыми.

Результаты и обсуждение

Хотя МРТ с контрастным усилением широко использовалась в радиотерапии под визуальным контролем на основе AGuIX, предел обнаружения концентрации наночастиц вызывает беспокойство из-за более длительного измерения фармакокинетики наночастиц. Обладая гораздо более чувствительной и более высокой количественной способностью, ПЭТ расширяет динамический диапазон концентраций до гораздо более низких наномолярных концентраций, которые невозможно обнаружить с помощью МРТ с контрастным усилением. В этом отчете мы описали маркировку и оценку биораспределения и фармакокинетики AGuIX с ⁶⁴ Cu для потенциальной лучевой терапии под контролем ПЭТ.

Исследование ТЕА

Для исследований инкубации клеток на основании опубликованных данных была выбрана концентрация 0,5 мМ наночастиц AGuIX, и наночастицы AGuIX инкубировали с клетками HepG2 в течение 1 ч [10]. Наблюдалось проникновение в цитоплазму клеток HepG2 (рис. 1). Этот результат согласуется с ранее опубликованными исследованиями, в которых наночастицы AGuIX инкубировали с другими типами клеточных линий [12, 13]. Мы также наблюдали, что AGuIX показал отличную форму дисперсии в клетках HepG2, что позволяет предположить, что AGuIX был стабильным в клетках.

Локализация AGuIX в клетках HepG2. а . Изображения ПЭМ (× 6500) отображают поглощение AGuIX клетками HepG2. б . Увеличенное изображение ПЭМ (× 52000) показывает распределение наночастиц AGuIX в цитоплазме

Радиомаркировка

Мечение удобно проводить с использованием текущей формы AGuIX со встроенным хелатором DOTA за одну стадию для радиохимического выхода> 98%. Используя тест iTLC для идентификации радиоактивно меченных наночастиц, которые оставались в исходных пятнах, мечение привело к удельной активности и радиохимической чистоте примерно 3–10 МБк / мкмоль и 98%, соответственно. При каждом синтезе получали в среднем 50–100 МБк конечного продукта.

Исследования биораспространения

⁶⁴ Наночастицы Cu-AGuIX вводили внутрибрюшинно, биораспределение определяли у голых мышей с опухолью HepG2 и сравнивали с ранее описанными. Как показано на фиг. 2, биораспределение в каждом органе / ткани представлено как процент введенной активности (введенная доза) на грамм ткани (% ID / г). Результаты ясно показали, что ⁶⁴ Cu-AGuIX накапливается в опухоли с отличным удерживанием через 9, 21 и 40 часов в день. с поглощением 7,82 ± 1,50, 8,43 ± 6,23 и 6,84 ± 1,40% ID / г соответственно. Такое долгосрочное удерживание может быть связано с поглощением наночастиц AGuIX внутри клеток и, таким образом, связано с ⁶⁴ Размещение Cu в клетках. В соответствии с другими сообщениями [11, 14], хотя использовались различные способы введения радиоактивной метки и введения изотопов, ⁶⁴ Радиоактивно меченные Cu нанозонды демонстрировали гораздо меньшее поглощение (менее 1% ID / г) в других нормальных органах и тканях и быстрый клиренс. В совокупности эти данные предполагают потенциальное использование ⁶⁴ Меченый Cu AGuIX как инструмент для измерения биораспределения и фармакокинетики AGuIX, помогающий составить план лучевой терапии, в которой эти наночастицы используются в качестве радиосенсибилизаторов. В этом исследовании поглощение почками намного ниже, чем сообщалось в других исследованиях, поскольку в этом исследовании использовались внутрибрюшинные инъекции [11, 14].

Биораспределение ⁶⁴ Cu-AGuIX у мышей nude с опухолями HepG2. Поглощение радиоактивности каждой тканью / органом было представлено в% ID / г через 9, 21 и 40 часов после внутрибрюшинной инъекции ⁶⁴ Cu-AGuIX (среднее ± стандартное отклонение, n =3)

Визуализация микро-ПЭТ у голых мышей

Микро-ПЭТ-изображение показало, что высокий уровень поглощения ⁶⁴ Cu-AGuIX наблюдали в опухолях, почках и печени у голых мышей с опухолями (рис. 3). Опухоль была четко видна после введения ⁶⁴ Cu-AGuIX через 9 часов и даже более отчетливо до 21 часа после инъекции по мере уменьшения фона.

Микро-ПЭТ-изображения опухолевых мышей. ПЭТ-изображения (вид сверху, коронка; снизу, поперечный вид) голых мышей с опухолями ( красная стрелка ) были получены через 9 часов (слева) и 21 час (справа) после внутрибрюшинной инъекции ⁶⁴ Cu-AGuIX

¹⁸ Оценка F-FDG ПЭТ / КТ облученных ксенотрансплантатов с или без AGuIX

Чтобы оценить различные реакции на лучевую терапию с введением или без введения AGuIX, ¹⁸ Визуализация F-FDG ПЭТ / КТ выполнялась для отслеживания метаболических изменений после облучения с инъекцией AGuIX или без нее в двух разных дозах. Уменьшение на ¹⁸ Поглощение F-FDG в ксенотрансплантатах наблюдалось у всех облученных мышей (рис. 3). SUVmax (B / A), основной показатель эффективности радиосенсибилизации, составлял 1,03 ± 0,03, 1,04 ± 0,04 и 1,24 ± 0,02 для мышей, получавших физиологический раствор, 1 мг AGuIX и 10 мг AGuIX соответственно (рис. 4). Для группы 10 мг AGuIX T / L (B / A) был значительно увеличен по сравнению с группой 1 мг AGuIX ( p <0,001, независимый тест образца) и с группой нормального физиологического раствора ( p <0,001, независимый выборочный тест). Не было существенной разницы в отношении T / L (B / A) между группами, получавшими 1 мг AGuIX и физиологический раствор ( p =0,83, независимый выборочный тест) (рис.5). Эти результаты предполагают, что метаболизм глюкозы в ксенотрансплантатах подавлялся в основном у облученных мышей, которым вводили 10 мг AGuIX; хотя лучевая терапия может вызвать воспаление, которое также может привести к поглощению ФДГ. В этом исследовании мы выбираем одну и ту же дозу облучения и одну и ту же временную точку пост-лучевой терапии для всех групп, чтобы компенсировать любые системные ошибки. Следовательно, степень воспаления, вызванного ЛТ, должна быть примерно одинаковой для всех трех групп, и вклад в поглощение ФДГ, вызванный воспалением, также должен быть примерно одинаковым. Чтобы избежать этой проблемы, можно использовать другие ПЭТ-зонды. Тем не менее, эти результаты подтверждают концепцию того, что AGuIX можно использовать в качестве сенсибилизатора опухолевого излучения у мышей с опухолью HepG2.

¹⁸ ПЭТ-изображения F-FDG мышей до и после облучения. ¹⁸ Изображения F-FDG PET сравнивали на каждой панели до (слева) и через 1 день (справа) после облучения, и на трех панелях были показаны изображения мышей, которым путем инъекции в хвостовую вену вводили физиологический раствор (левая панель), 1 мг AGuIX ( средняя панель) и 10 мг AGuIX (правая панель) соответственно. К каждому изображению была применена одна и та же цветовая шкала

¹⁸ Количественная оценка F-FDG PET до и после облучения. T / L (B) - отношение SUVmax (опухоль) к SUVave (печень) до облучения; T / L (A) - отношение SUVmax (опухоль) к SUVave (печень) после облучения; T / L (B / A), отношение T / L (B) к T / L (A); AGuIX (1 мг), 1 мг AGuIX для инъекций; AGuIX (10 мг), 10 мг AGuIX для инъекций

Наконец, доза излучения, поглощенная самим датчиком ядерной визуализации, также является критическим фактором при рассмотрении вопроса о переходе к клиническому использованию. Нынешняя форма наночастиц AGuIX была тщательно исследована на метаболизм и токсичность in vivo и одобрена для исследований на людях FDA [15]. Пометив либо ⁶⁸ Ga (период полураспада ~ 1 час) или ⁸⁹ Zr (период полураспада 78 часов), результаты исследования биораспределения у мышей с помощью внутривенной инъекции показали чрезвычайно высокое поглощение почками при более чем 20% ID / г уже через 30 минут к ⁶⁸ До 72 часов до ⁸⁹ Zr [11, 14]. Хотя быстрое выведение почками, как правило, полезно из-за чувствительности почек к радиации, неизвестны, могут ли почки переносить такое высокое поглощение и механизм удержания в течение такого длительного периода времени. В этом исследовании поглощение почками было на уровне ~ 5% ID / г, что ниже, чем в печени и опухоли на протяжении всего периода исследования. Можно предположить, что это различие связано с разными маршрутами нагнетания. При внутрибрюшинной инъекции наночастицы AGuIX непрерывно абсорбировались брюшиной, тогда как при внутривенной инъекции наночастицы быстро выводились почками. Поскольку радиационная чувствительность каждого органа и ткани разная, окончательное определение радиоактивных тераностических зондов для использования в клинической практике требует дальнейших подробных дозиметрических исследований.

Выводы

Наночастицы AGuIX были успешно помечены ⁶⁴ Cu с высоким выходом. Исследования биораспределения показали, что радиоактивный индикатор ⁶⁴ Cu-AGuIX продемонстрировал высокое накопление в опухолях и в течение длительного периода удерживался в ксенотрансплантате HepG2 голых мышей, что позволяет предположить, что они являются потенциальными тераностическими нанозондами для лучевой терапии под визуальным контролем при ГЦК. Значительное сокращение на ¹⁸ Поглощение F-FDG после лучевой терапии в группе голых мышей с опухолями, которым инъецировали AGuIX, предоставило доказательства того, что AGuIX можно использовать в качестве сенсибилизатора излучения опухоли для усиления лучевой терапии у мышей с опухолью HepG2. Необходимы дальнейшие дозиметрические исследования для определения радиационной токсичности для потенциального применения в клинической практике.