Потенциальная токсичность наночастиц диоксида титана для печени, мозга и эмбрионов у мышей

Аннотация

Наноразмерный диоксид титана (нано-TiO ₂ ) широко применяется в промышленности и медицине. Однако безопасность нано-TiO ₂ экспозиция остается неясной. В этом исследовании мы оценили токсичность для печени, мозга и эмбрионов, а также основной механизм действия нано-TiO ₂ с использованием моделей мышей. Результаты показали, что титан распределялся и накапливался в сердце, мозге, селезенке, легких и почках мышей после внутрибрюшинного (i.p.) введения нано-TiO ₂ воздействие дозозависимым образом. Соотношение массы органа / тела сердца, селезенки и почек было значительно увеличено, а соотношение массы мозга и легких уменьшилось. Высокие дозы нано-TiO ₂ значительно повреждает функции печени и почек, метаболизм глюкозы и липидов, как показали биохимические тесты крови. Нано-TiO ₂ вызывали повреждения митохондрий и апоптоз гепатоцитов, образование активных форм кислорода и нарушения экспрессии защитных генов в печени мышей. Мы обнаружили разорванные и потрескавшиеся нервные клетки и инфильтрацию воспалительных клеток в головном мозге. Мы также обнаружили, что активность конститутивных синтаз оксида азота (cNOS), индуцибельной NOS (iNOS) и ацетилхолинэстеразы, а также уровни закиси азота и глутаминовой кислоты изменялись в головном мозге после применения нано-TiO ₂ воздействие. Модели эмбрионов мыши ex vivo показали токсичность для развития и генетическую токсичность после высоких доз нано-TiO ₂ . Размер нано-TiO ₂ частицы могут влиять на токсичность, более крупные частицы вызывают более высокую токсичность. Таким образом, нано-TiO ₂ проявляет токсичность во многих органах мышей после внутрибрюшинного воздействия. инъекция и зонд. Наше исследование может предоставить данные для оценки риска нано-TiO ₂ воздействие на здоровье человека.

Фон

Наноразмерный диоксид титана (нано-TiO ₂ ) широко используется в пищевой промышленности. Он использовался для производства леденцов с покрытием, консервированных фруктов, жевательной резинки, газированных напитков, сухих напитков (в несладких лекарственных формах или в концентрированных), молока и молочных продуктов и других категорий пищевых продуктов [1, 2]. Концентрация нано-TiO ₂ в пищевых продуктах достигает 0,5–9 г / кг [1, 3], а многие пищевые продукты, которые, как утверждается, не содержат нано-TiO2, содержат нано-TiO2 [2]. Нано-TiO ₂ также широко используется в биомедицине, очистке от органических загрязнителей, материаловедении и косметике [4,5,6]. Однако безопасность нано-TiO ₂ экспозиция остается неясной.

Исследования показали, что нано-TiO ₂ может стать обогащенным и токсичным для многих органов после попадания в организм несколькими способами, такими как введение через брюшную полость или ингаляцию [7, 8]. Нано-TiO ₂ может быть токсичным для нескольких типов клеток, таких как лимфобластоидные клетки человека и клетки гепатомы [9, 10]. Он может вызывать острую стрессовую реакцию в глиальных клетках мозга мышей, приводя к повреждению и дисфункции нейронов [11]. Выживаемость клеточных линий нейронов, подвергшихся воздействию нано-TiO ₂ частиц значительно уменьшается в зависимости от времени и дозы [12].

Исследования выявили несколько механизмов, с помощью которых эти наночастицы вызывают токсичность. Нано-TiO ₂ частицы могут вызывать генетическую токсичность из-за изменения структуры молекулярного комплекса и проницаемости клеточной мембраны [13,14,15]. Нано-TiO ₂ может вызвать окислительный стресс. Во время окислительного стресса образуются активные формы кислорода (АФК), такие как гидроксильные радикалы, которые вызывают окисление ДНК с образованием 8-OHG, что приводит к ошибкам и мутациям в репликации ДНК [16, 17]. Более того, АФК могут вызывать воспаление и взаимное прямое взаимодействие между окислительным стрессом и воспалением, что приводит к повреждению ДНК и апоптозу клеток [18, 19]. Однако исчерпывающие систематические данные о токсичности нано-TiO ₂ остается ограниченным. Нашей целью было выявить эффект и лежащий в основе механизм нано-TiO ₂ воздействие на здоровье человека.

В этом исследовании мы оценили эффект и лежащий в основе механизм нано-TiO ₂ воздействие с использованием моделей мышей. Наши результаты показали, что нано-TiO ₂ могут быть обогащены и вызывать токсичность в некоторых органах, таких как печень, почки, селезенка, сердце, легкие и мозг, вызывая окислительно-восстановительный дисбаланс и нарушения экспрессии генов. Это также может нанести ущерб эмбриональному развитию. Наше исследование может предоставить данные для оценки потенциального риска для здоровья человека от нано-TiO ₂ экспозиция.

Методы

Химические вещества и реагенты

Микромасштаб TiO ₂ (микро-TiO ₂ ) и 5 нм TiO ₂ в форме анатаза были приобретены у Sigma-Aldrich (Шанхай, Китай) и 10, 60 и 90 нм TiO ₂ (анатаз) были приобретены в Run He Ltd. (Шанхай, Китай). Формальдегид, азотная кислота, перекись водорода и гепарин натрия были реактивными сортами и были приобретены у Sigma-Aldrich (Шанхай, Китай). Фосфатный буфер (PBS), пенициллин и стрептомицин были приобретены у Gibco (Сан-Диего, США). Наборы для экстракции тотальной РНК были приобретены в Takara (Далянь, Китай). Наборы для анализа активных форм кислорода были приобретены у Jianchen Ltd. (Нанкин, Китай). Stock TiO ₂ суспензию (1%) в растворе Хэнка стерилизовали при 121 ° C в течение 30 мин. Суспензию обрабатывали ультразвуком и разбавляли до желаемой концентрации непосредственно перед использованием.

Животные и модели

Для исследования токсичности для печени и мозга мышей ICR (импринтинг контрольной области) (22 ± 3 г, половина самцов и половина самок) были приобретены в центре животных Китайского медицинского университета. Все экспериментальные процедуры с участием животных были предварительно одобрены Институциональным этическим комитетом Тяньцзиньского университета науки и технологий и проводились в соответствии с международными рекомендациями по уходу и использованию лабораторных животных. Для изучения токсичности эмбрионов мышей ICR (45 самок, 20–35 г; 15 самцов, 35–40 г) были приобретены у Beijing Weitong Lihua Ltd. (Пекин, Китай). Все мыши были здоровыми и половозрелыми. За пять дней до лечения мышей содержали в отдельных клетках в птичнике с хорошей вентиляцией, 12-часовым циклом свет / темнота, 20 ± 2 ° C, относительной влажностью 60 ± 10% и неограниченным доступом к пище и воде. / P>

Режим дозирования 1 был разработан для теста общей токсичности и токсичности для мозга. Мышей случайным образом разделили на шесть групп и дополнительную контрольную группу по 10 мышей на группу. Наноразмерный TiO ₂ (нано-TiO ₂ ) суспензию вводили (внутрибрюшинно (внутрибрюшинно) в дозах 5, 10, 50, 100, 150 и 200 мг / кг) один раз в сутки в течение 14 дней. Физиологический раствор вводили мышам контрольной группы. За мышами наблюдали каждый день, и ни одно животное не погибло во время исследования. На 15-е сутки брали кровь из глазничной пазухи. Всех мышей взвешивали индивидуально, анестезировали 2% фенобарбиталом (60 мл / кг, внутрибрюшинно), а затем умерщвляли путем смещения шейных позвонков. Были собраны все образцы тканей (ткань мозга, выделенная из коры и гиппокампа), и хранились при -80 ° C. Каждое сердце, печень, селезенка, легкое и почка разрезали на две части. Одну порцию замачивали в 10% растворе формалина при 4 ° C для патологического исследования. Другую часть хранили при -20 ° C для определения содержания титана.

Режим дозирования 2 был разработан для теста на токсичность для печени. Мыши были разделены на три экспериментальные группы и одну контрольную группу. Нано-TiO ₂ (5, 10, 50 мг / кг) вводили один раз в день через желудочный зонд в течение 60 дней. Мыши контрольной группы получали 0,5% КМЦ (карбоксиметилцеллюлозу). За мышами наблюдали каждый день, и ни одно животное не погибло во время исследования. На 60-й день мышей анестезировали 2% фенобарбиталом (60 мл / кг, внутрибрюшинно), а затем их умерщвляли путем смещения шейных позвонков, печень немедленно собирали и обрабатывали для исследования с помощью электронной микроскопии, определения ROS и окисления липидов. и анализ экспрессии генов.

Определение содержания титана в тканях-мишенях

Кусок замороженного образца ткани весом 0,1–0,5 г был разрезан и разморожен при комнатной температуре, а затем обработан в HNO ₃ (0,5 мл) и H ₂ О ₂ (0,5 мл) при 160 ° C. После разбавления до 3 мл 3% азотной кислотой концентрацию титана в растворе определяли с помощью масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (ICP-MS). Затем было рассчитано содержание титана в тканях-мишенях.

Биохимические анализы крови и расчет соотношения веса органа и тела

Уровни ферментов в образцах сыворотки анализировали с помощью автоматического биохимического анализатора (TBA-2000FR, Toshiba, Tokyo, Japan). Эти ферменты являются биомаркерами, связанными с функцией печени и почек.

Отношение веса органа к весу тела рассчитывали на основании веса органа и тела. Массу тела измеряли перед анестезией и умерщвлением. Органы были взвешены после изоляции от анестезированных и умерщвленных мышей.

Патологическое исследование и просвечивающая электронная микроскопия

Патологическое исследование тканей печени или мозга, пропитанных формалином, проводили под световым микроскопом после окрашивания гематоксилином. Для просвечивающей электронной микроскопии (ТЕМ) ткани печени залили эпоксидной смолой EPON 812 и разрезали на срезы толщиной менее 500 мкМ после фиксации глутаральдегидом и осмиевой кислотой. Срезы окрашивали насыщенным раствором урана уксусной кислоты (pH 3,5) и цитратом свинца (pH 12) в течение 1–2 ч. Окрашенные срезы исследовали с помощью ПЭМ.

Определение уровней активных форм кислорода, активности их метаболических ферментов и уровней нейротрансмиттеров

Для тканей печени супероксид-анион (O ₂ ^- ) уровни определяли с помощью XTT. Активность каталазы (CAT) определяли с использованием значений OD при 240 нм в соответствии с опубликованными процедурами [20]. Уровни перекисного окисления липидов определяли по содержанию малонового диальдегида (МДА) в соответствии с опубликованными процедурами [21].

После выделения ткани головного мозга гомогенизировали предварительно охлажденным 1% -ным раствором поливинилполипирролидона (50 мМ при pH 7,6 PBS). Супернатанты собирали после центрифугирования при 15000 об / мин в течение 20 минут (Eppendorf 5418, Гамбург, Германия) и использовали для последующего анализа активности супероксидного фермента (SOD), CAT, аскорбатпероксидазы (APX) и глутатионпероксидазы (GSHPx). Активность СОД определяли с помощью NBT (тест на нитротетразолий хлорид синий). Активность каталазы определяли с использованием набора (набор для анализа CAT, A007-2, Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Нанкин, Китай). Активность APX измеряли с использованием набора (набор для анализа APX, A123, Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Нанкин, Китай). Активность GSHPx определяли с использованием набора (набор для анализа GSHPx, A005, Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Нанкин, Китай). Активность конститутивной синтазы оксида азота (cNOS), индуцибельной синтазы оксида азота (iNOS) и ацетилхолинэстеразы (AChe) определяли с помощью коммерческих наборов (набор для анализа AChe, A024, Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Нанкин, Китай).

Уровни АФК в тканях мозга определяли добавлением 2 ', 7' диацетата дихлорфлуоресцина до конечной концентрации 10 мкМ в гомогенате ткани мозга и инкубированием при 37 ° C в течение 30 мин; затем ткани были подвергнуты анализу с помощью проточной цитометрии.

Определение относительных уровней мРНК

Тотальную РНК экстрагировали из образцов ткани печени с использованием коммерческого набора (TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit, 9767, Takara, Dalian, China). Комплементарную ДНК синтезировали с использованием обратной транскрипции со случайным праймером. Относительные уровни мРНК SOD, CAT, GSHPx, MT, HSP70, CYPA, P53, GST и TF определяли с использованием набора для количественной ПЦР в реальном времени (qPCR) (One Step SYBR® PrimeScript ™ RT-PCR Kit, PR066A, Такара, Далянь, Китай). Все праймеры (таблица 1) были синтезированы и приобретены в Shanghai Sangon Ltd.

Тест на токсичность эмбрионов Ex vivo

Эмбрионы 8,5 эмбриональных дней были изолированы от самок мышей после шейного дислокации, а затем культивированы в 50,0-мл растворе Хэнкса, содержащем 3 мл немедленно центрифугированной сыворотки (ICS) от крыс, микро-TiO ₂ , или нано-TiO ₂ (0,0, 50,0, 100,0 и 200,0 мкг / мл) с 3 эмбрионами в каждой бутылке в течение 48 часов.

Для определения эффекта микро-TiO ₂ или нано-TiO ₂ время воздействия на эмбрионы, эмбрионы культивировали в 50,0-мл растворе Хэнкса, содержащем 3 мл ICS от крыс, микро-TiO ₂ , или нано-TiO ₂ (200,0 мкг / мл) с 3 эмбрионами в каждой бутылке в течение 16, 26 и 48 часов, а затем промывали в течение 48 часов предварительно нагретым до 37 ° C раствором Хэнка и культивировали в 50,0-мл растворе Хэнка, содержащем 3 мл ICS из крысы.

Эмбриональное развитие оценивали с помощью шкалы Maele-Fabry Van [22]. Диаметр желточного мешка, длину макушки и крупа эмбриона, длину головы и количество срезов тела исследовали под препарирующим микроскопом. Степень порока развития развивающихся эмбрионов оценивалась на основе баллов морфологических изменений переднего мозга, среднего мозга, заднего мозга, зачатка передних конечностей, зачатка задней конечности, слуховой и зрительной систем и сердца. Для контроля было выделено более 10 эмбрионов от 2 мышей ICR на 10,5-й день эмбриона.

Статистический анализ

Данные анализировали с помощью SPSS 13 (IBM, Иллинойс, США). Разница между экспериментальной и контрольной группой была проанализирована с использованием t Даннета. контрольная работа. Различия между группами анализировали с помощью дисперсионного анализа. Сравнение двух из нескольких образцов было проанализировано с использованием тестов LSD и SNK. Категориальные данные были проанализированы с использованием теста хи-квадрат и теста суммы рангов. Если P <0,05, разница считалась значимой.

Результаты

Распределение титана в тканях у мышей после наноразмерного воздействия диоксида титана

Мы лечили мышей нано-TiO ₂ (внутрибрюшинно, 5, 10, 50, 100, 150 и 200 мг / кг) в течение 14 дней и определяли содержание титана в органах мышей. Результаты показали, что титан накапливался в органах мышей, получавших разные дозы нано-TiO ₂ (Рисунок 1). Величина накопления зависела от дозы (рис. 1). Печень была органом, в котором титан был больше всего обогащен, за ней следовали почки. Величина накопления титана была примерно одинаковой в селезенке, легких, головном мозге и сердце (рис. 1). Результаты показывают, что нано-TiO ₂ может всасываться через желудочно-кишечный тракт и распределяться по тканям через систему кровообращения и откладываться в органах печени, почках, селезенке, легких, головном мозге и сердце.

Титан накапливался в органах мышей, подвергшихся воздействию нано-TiO ₂ . Мышей лечили нано-TiO ₂ суспензия или физиологический раствор по показаниям путем внутрибрюшинной инъекции один раз в день в течение 14 дней. * по сравнению с контролем, P <0,05, # по сравнению с контролем, P <0,01

Общая токсичность наноразмерного диоксида титана для мышей

Мы лечили мышей разными дозами нано-TiO ₂ в течение 14 дней и обнаружили, что не было различий в приросте массы тела среди групп мышей, получавших разные дозы (данные не показаны). Низкие дозы нано-TiO ₂ (5 и 10 мг / кг) не изменяли соотношение массы тела и органа в печени, почках, селезенке, легких, сердце и головном мозге у мышей после внутрибрюшинного введения. выдержка в течение 14 дней (рис. 2). Однако высокие дозы нано-TiO ₂ (50, 100, 150 и 200 мг / кг) значительно увеличили отношение массы тела к органу в печени, почках, селезенке и сердце и уменьшили отношение веса легких и головного мозга у мышей в зависимости от дозы (рис. 2). ).

Соотношение веса органов и тела у мышей, подвергшихся воздействию нано-TiO ₂ . Мышей лечили нано-TiO ₂ суспензия или физиологический раствор по показаниям путем внутрибрюшинной инъекции один раз в день в течение 14 дней. * по сравнению с контролем, P <0,05; # по сравнению с контролем, P <0,01

Более низкие дозы (5, 10, 50 и 100 мг / кг) нано-TiO ₂ не изменили показателей биохимии крови (рис. 3). Высокие дозы нано-TiO ₂ (От 150 до 200 мг / кг) повышенные биомаркеры функции печени:щелочная фосфатаза (ALP) и аланинаминотрансфераза (ALT), альбумин (ALB), лейцинаминопептидаза (LAP), бутирилхолинэстераза (PChe), общий билирубин (TBIL) и общий белок ( TP) уровней (рис.3). Высокие дозы снижали уровни мочевой кислоты (UA) в сыворотке и азота мочевины в крови (BUN), которые являются биомаркерами функции почек. Они повысили уровни аспартатаминотрансферазы (AST), креатинкиназы (CK), лактатдегидрогеназы (LDH) и альфа-гидроксибутиратдегидрогеназы (HBDH) в сыворотке крови, которые являются показателями повреждения миокарда (рис. 3).

Индекс биохимии крови мышей, подвергшихся воздействию нано-TiO ₂ . Мышей лечили нано-TiO ₂ суспензия или физиологический раствор по показаниям путем внутрибрюшинной инъекции один раз в день в течение 14 дней. * по сравнению с контролем, P <0,05; # по сравнению с контролем, P <0,01. а Биохимический индекс биомаркеров функции печени. б Биохимический индекс биомаркеров функции почек. c Биохимический индекс биомаркера повреждения миокарда

Эти результаты предполагают, что высокие дозы TiO ₂ может вызвать серьезные повреждения печени, почек, сердца и других органов в зависимости от дозы.

Токсичность нано-TiO ₂ для печени в мышах

Мы также оценили токсичность нано-TiO ₂ для печени. . Используя световую микроскопию, мы обнаружили, что не было значительных изменений в печени мышей, подвергшихся воздействию низкой дозы (внутрибрюшинно в течение 14 дней, 5 мг / кг) нано-TiO ₂ (Рис. 4а, б). Мы наблюдали выраженную обструкцию и расширение сосудов (фиг. 4c, 50 мг / кг), увеличение базофилов (фиг. 4d, 100 мг / кг), частичную ишемию в печени (фиг. 4e, 150 мг / кг) и обструкцию. центральных вен (рис. 4f, 200 мг / кг) у мышей, подвергшихся воздействию нано-TiO ₂ (внутрибрюшинно).

Гистология печени мышей, получавших нано-TiO ₂ подвергается воздействию нано-TiO ₂ . Мышей лечили нано-TiO ₂ суспензия или физиологический раствор по показаниям путем внутрибрюшинной инъекции один раз в день в течение 14 дней. а Контроль. б TiO ₂ , 5 мг / кг. c TiO ₂ , 50 мг / кг. г TiO ₂ , 100 мг / кг. е TiO ₂ , 150 мг / кг. е TiO ₂ , 200 мг / кг

Однако с помощью ПЭМ мы обнаружили небольшое набухание митохондрий в гепатоцитах и присутствие конденсированного хроматина и апоптотических клеток в тканях печени у мышей, подвергшихся воздействию низкой дозы нано-TiO ₂ (через желудочный зонд в течение 60 дней, 5 мг / кг) (рис. 5а, б). Мы наблюдали нано-TiO ₂ в митохондриях гепатоцитов, набухающих митохондриях и вакуолях в митохондриях клеток печени мышей, получавших 10 мг / кг нано-TiO ₂ (через желудочный зонд в течение 60 дней, рис. 5в). Мы также наблюдали коллапс ядрышка, рассеянный хроматин, очевидный апоптоз и / или апоптотические тельца в клетках печени мышей, получавших 50 мг / кг нано-TiO ₂ (через желудочный зонд в течение 60 дней, рис. 5г). Результаты показали, что нано-TiO ₂ может привести к патологическому повреждению клеток печени на субклеточном и клеточном уровнях.

Ультрамикроскопическая структура гепатоцитов мышей, подвергшихся воздействию нано-TiO ₂ . Мышей лечили нано-TiO ₂ как указано через желудочный зонд один раз в день в течение 60 дней. Мыши контрольной группы получали 0,5% КМЦ (карбоксиметилцеллюлозу). а Контроль (× 8000). б TiO ₂ (5 мг / кг) (× 8000). c TiO ₂ (10 мг / кг) (× 10 000). Стрелки указывают митохондрии и вакуоли в митохондриях. г TiO ₂ (50 мг / кг) (× 10 000)

Лечение мышей 5 мг / кг нано-TiO ₂ в течение 60 дней не меняли уровни АФК типа O ^2- , H ₂ О ₂ , оксид азота (NO) и MDA (рис. 6), или уровни мРНК генов SOD, CAT, GSHPx, MT, GST, HSP70, P53 и TF в тканях печени (рис. 7). Обработка мышей 10 или 50 мг / кг нано-TiO ₂ в течение 60 дней привело к значительному увеличению уровня O ^2- , H ₂ О ₂ , NO и MDA (рис.6), снижение уровней мРНК генов SOD, CAT, MT, GST, HSP70, P53, TF и GSHPx и повышение уровня мРНК генов CYP1A в печени мышей ( Рис.7). Результаты показали, что высокие дозы нано-TiO ₂ -индуцированный окислительный стресс и изменения в экспрессии защитных генов в печени подвергшихся воздействию мышей.

Скорость производства АФК и уровни перекисного окисления липидов в печени мышей, подвергшихся воздействию нано-TiO ₂ . Мышей лечили нано-TiO ₂ как указано через желудочный зонд один раз в день в течение 60 дней. Мыши контрольной группы получали 0,5% КМЦ (карбоксиметилцеллюлозу). * по сравнению с контролем, P <0,05, нормализовано к общему белку

Относительные уровни экспрессии генов в печени мышей, подвергшихся воздействию нано-TiO ₂ . Мышей лечили нано-TiO ₂ как указано через желудочный зонд один раз в день в течение 60 дней. Мыши контрольной группы получали 0,5% КМЦ (карбоксиметилцеллюлозу). * по сравнению с контролем, P <0,05; # по сравнению с контролем, P <0,01, нормализовано к β-актину

Токсичность наноразмерного диоксида титана для мозга у мышей

Мы дополнительно оценили токсичность нано-TiO ₂ для мозга. . Сначала мы исследовали соотношение веса мозга и тела у мышей, подвергшихся воздействию нано-TiO ₂ (внутрибрюшинно в течение 14 дней). Низкие дозы (5, 10, 50 мг / кг) не изменяли соотношения массы мозга / тела, а более высокие дозы (100, 150, 200 мг / кг) значительно снижали соотношение массы мозга / тела в зависимости от дозы. способом (рис. 2). Концентрация Ti в тканях мозга значительно увеличивалась в зависимости от дозы (рис. 1).

Мы также исследовали гистологические изменения в головном мозге мышей, подвергшихся воздействию нано-TiO ₂ (внутрибрюшинно в течение 14 дней) с окрашиванием гематоксилином. Мы заметили, что низкие дозы нано-TiO ₂ (50 мг / кг) не изменили гистологию ткани головного мозга мышей после внутрибрюшинного введения. выдержка в течение 14 суток (рис. 8а, б). Обработка мышей 100 мг / кг нано-TiO ₂ привело к разрыву и растрескиванию нервных клеток в ткани мозга (рис. 8c). Обработка мышей 150 мг / кг нано-TiO ₂ привело к инвазии воспалительных клеток в ткани головного мозга (рис. 8d). Результаты показали, что высокие дозы нано-TiO ₂ может вызвать морфологическое повреждение ткани головного мозга, что приведет к воспалительной реакции.

Патологические изменения в мозговой ткани мышей, подвергшихся воздействию нано-TiO ₂ . Мышей лечили нано-TiO ₂ суспензия или физиологический раствор по показаниям путем внутрибрюшинной инъекции один раз в день в течение 14 дней. а Контроль. б 50 мг / кг. c 150 мг / кг. г 200 мг / кг

Мы определили эффекты нано-TiO ₂ на окислительно-восстановительное состояние и сигнальные молекулы в ткани мозга мышей, подвергшихся воздействию нано-TiO ₂ (внутрибрюшинно в течение 14 дней). Мы заметили, что низкая доза (5 мг / кг) нано-TiO ₂ не изменилось O ^2- , H ₂ О ₂ и уровни MDA, не изменяли активность антиоксидантных ферментов APX, CAT, GSHPx и SOD или уровни неферментативных антиоксидантов ASA / DASA и GSH / GSSG. Это также не повлияло на активность синтазы оксида азота (NOS) и уровни NO в тканях мозга (рис. 9 и 10). Более высокие дозы нано-TiO ₂ увеличился O ^2- , H ₂ О ₂ , и уровни MDA, снижали активность антиоксидантных ферментов APX, CAT, GSHPx и SOD, снижали уровни неферментативных антиоксидантов ASA / DASA и GSH / GSSG, повышали уровни NO и активности NOS и снижали уровни AchE и глюкозы в крови (GLU) в тканях мозга (рис. 9 и 10). Эти результаты показывают, что нано-TiO ₂ может вызвать повреждение мозга у мышей после внутрибрюшинного введения. экспозиция.

Соотношения ASA / DASA и GSH / GSSG в мозге у мышей, подвергшихся воздействию нано-TiO ₂ . Мышей лечили нано-TiO ₂ суспензия или физиологический раствор по показаниям путем внутрибрюшинной инъекции один раз в день в течение 14 дней

Изменения АФК, антиоксидантных ферментов, активности NO, глутамата и AchE в мозге мышей, подвергшихся воздействию нано-TiO ₂ . Мышей лечили нано-TiO ₂ суспензия или физиологический раствор по показаниям путем внутрибрюшинной инъекции один раз в день в течение 14 дней. N =10, * по сравнению с контролем, P <0,05; # по сравнению с контролем, P <0,01. а Изменение ROS (O2-, H2O2 и MDA) в мозге мышей, подвергшихся воздействию нано-TiO2. б Изменение антиоксидантных ферментов (SOD, CAT, APX и GSHPx) в мозге мышей, подвергшихся воздействию нано-TiO2. c Изменение сигнальных компонентов NO (cNOS, iNOS и NO) в мозге мышей, подвергшихся воздействию нано-TiO2. г Изменение содержания глутамата и активности AchE в мозге мышей, подвергшихся воздействию нано-TiO2

Токсический эффект нано-TiO ₂ на эмбрионах мышей Ex Vivo

Оценить токсичность нано-TiO ₂ для развития , мы сначала сравнили рост и развитие эмбрионов in vivo и эмбрионов ex vivo. Результаты показали, что рост и развитие эмбрионов ex vivo были аналогичны росту и развитию эмбрионов in vivo (данные не показаны). Поэтому мы использовали эмбрионы ex vivo для изучения токсических эффектов нано-TiO ₂ на эмбрионах.

Мы исследовали эффекты различных доз (конечные концентрации 0,0, 50,0, 100,0 и 200,0 мкг / мл) и разного времени воздействия микро-TiO ₂ / нано-TiO ₂ на рост и развитие эмбриона, а также на морфологию тканей и органов путем изучения диаметра VXY эмбриона, длины макушки до крупа, длины головы и количества частей тела. Результаты показали, что микро-TiO ₂ не изменил эти показатели ни при каких дозах (Таблица 2).

Для разных размеров нано-TiO ₂ , обработка эмбрионов 5–10 нм, 60 нм, 90 нм 50,0 мкг / мл TiO ₂ не влияли на диаметр VXY зародыша, длину макушки-крупа, длину головы и количество секций тела (табл. 2). Более высокие дозы (100,0 и 200,0 мкг / мл) уменьшали диаметр VXY, длину макушки и крупа, длину головы и количество частей тела, а также увеличивали частоту пороков развития (таблица 2). Для одной и той же дозы не было очевидной разницы между группами, получавшими нано-TiO ₂ разного размера. , 50,0 или 100 мкг / мл. Обработка эмбрионов 200 мкг / мл нано-TiO ₂ значительно уменьшился диаметр VXY, длина макушки до крупа, длина головы и количество частей тела эмбрионов мышей с увеличением размера нано-TiO ₂ частицы (Таблица 2).

Обработка эмбрионов мышей микро-TiO ₂ (200,0 мкг / мл) в течение 16, 24 и 48 ч не изменили диаметр VXY, длину макушки, длину головы и количество секций тела (таблица 3). Обработка эмбрионов мышей нано-TiO ₂ (5–10 нм и 60 нм, 90 нм, 200,0 мкг / мл) в течение 16 ч также не изменили диаметр VXY, длину макушки до крупа, длину головы и количество секций тела (Таблица 3). Однако обработка эмбрионов мышей нано-TiO ₂ (5–10 nm and 60 nm, 90 nm, 200.0 μg/mL) for 24 and 48 h decreased VXY diameter, crown–rump length, head length, the number of body sections, and increased the malformation rate (Table 3). For the same exposure time, there was no difference in VXY diameter, crown–rump length, head length, the number of body sections, or malformation rate among groups of different sizes of nano-TiO₂ particles (Table 3).

In summary, these results indicate that nano-TiO₂ had toxic effects on the growth and development of mouse embryos in dose-dependent and time-dependent manners. The sizes of the nano-TiO₂ particles may affect toxicity with a trend of increasing toxicity associated with larger nano-TiO₂ particles.

Discussion

Nano-TiO₂ has been widely used in industry and medicine. However, the safety of nano-TiO₂ exposure remains unclear. In the present study, we investigated the potential toxicity of nano-TiO₂ , using mice models. We find that nano-TiO₂ accumulates in the heart, liver, kidney, spleen, lung, and brain of mice after exposure (i.p. injection) in a dose-dependent manner. High doses of nano-TiO₂ significantly increase the organ/body weight ratios of the liver, kidney, spleen, and heart, and decrease those of the lung and brain in a dose-dependent manner. Moreover, high doses of nano-TiO₂ significantly increase the levels of ALT, ALP, LAP, PChE, TP, ALB, and TBIL, which are indices for liver function. They decrease the levels of UA and BUN, which are renal function indicators. Further, high doses significantly increase the activities of CK, LDH, AST, and HBDH, and significantly increase the levels of GLU, trigylceride, total cholesterol, and high-density lipoprotein. Low doses of nano-TiO₂ do not change these biochemical parameters. Our data support that nano-TiO₂ may be toxic and may affect the liver, kidney, heart, GLU, and lipid metabolism at high doses in a dose-dependent manner.

In the present study, we investigated the mechanism of liver toxicity of nano-TiO₂ . We find that high doses of nano-TiO₂ may cause swelling of hepatocytes with obvious vacuoles in cells, and nuclear condensation in hepatocytes, and apoptosis and necrosis of hepatocytes in liver tissues. This is consistent with previous studies [7, 23, 24]. After the treatment of mice with high doses of nano-TiO₂ , we find that the levels of CAT, GSHPx, and SOD are significantly decreased, and there is nano-TiO₂ in the mitochondria of hepatocytes, revealed by TEM. This is consistent with previous studies [7, 25,26,27,28] suggesting that nano-TiO₂ generates excess ROS and reduces the antioxidant capacity of the cells through damaging the mitochondria. This is further supported by observation that nano-TiO₂ can significantly decrease the mRNA levels of SOD, CAT, GSHPx, MT and HSP70, CYP1A1, p53, GST, and TF genes in the mouse liver. SOD, CAT, GSH PX, and MT are involved in liver cell detoxification, CYP1A1 is involved in toxic-substance metabolism and defense against invasion from harmful substances, and HSP70 and p53 are involved in repairing liver cell DNA damage [10, 29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39]. These findings support that the mechanisms for nano-TiO₂ liver toxicity are damaging mitochondria, generating ROS, and causing expression disorders of protective genes.

In the present study, we investigated the mechanism of brain neurotoxicity of nano-TiO₂ . We find that high doses of nano-TiO₂ can produce lipid peroxidation and decrease antioxidant capacity, including SOD, CAT, APX, and GSHPx activities, resulting in oxidative stress, which may damage unsaturated fatty acids and brain tissue [24, 26, 37, 40]. We observed rupture and cracking in nerve cells and the infiltration of inflammatory cells in the brain. We further found that the activities of cNOS and iNOS are increased, and NO is excessively released. Glutamic acid levels and AChe activity are decreased in the brain. This is consistent with the effect of Fe₂ О ₃ nanoparticles on olfactory bulb cells [40] and the effect of nano-TiO₂ on mouse hippocampal neurons [31, 41]. Glutamate is the most abundant amino acid in excitatory neurotransmitters of the nervous system. It is critical for the brain’s development and function [42]. Acetylcholinesterase is a key enzyme for levels of acetylcholine, which is critical for the function of the peripheral and central nervous systems. Nitric oxide regulates many central nervous functions, such as synaptic plasticity, the sleep–wake cycle, and hormone secretion [43]. Therefore, nano-TiO₂ may cause oxidative stress and may disrupt orders of neurochemical metabolism in brain tissue and therefore have neurotoxicity in the central nervous system.

We find that the micro-TiO₂ and low doses of nano-TiO₂ (5–10 nm and 60 nm and 90 nm) do not exhibit toxicity on ex vivo mouse embryos, while high doses of nano-TiO₂ (100–200.0 μg/ml) exhibit toxicity on ex vivo mouse embryos, as revealed by evaluation of morphology of exposed embryos. Whole embryo culture is a useful tool to assess the developmental toxicity of chemicals [44, 45]. Previous studies show that exposure of 14-day pregnant mice to a single dose of nano-TiO₂ in the nasal cavity increase the sensitivity of inflammatory response in F1 generation [46, 47]. Nano-TiO₂ does not affect white pregnant Kunming mice but inhibits growth, increases the rate of stillbirth, and exhibits developmental toxicity [48]. These studies indicate the presence of the developmental and genetic toxicity of nano-TiO₂ . This is further supported by studies that show cleavage and oxidative damage of DNA by nano-TiO₂ , for example, in Zebra fish [16, 49, 50]. Additionally, another shows an increase in the sister chromatid exchange rates in Chinese hamster ovary cells [51]. Nano-TiO₂ may also prevent chromosome formation during metaphase in the ovary when TiO₂ concentration is high [51]. These studies consistently show that exposure to high doses of nano-TiO₂ is linked with developmental and genetic toxicity. Furthermore, our data indicated that the size of nano-TiO₂ particles may affect its toxicity, with the trend of increasing toxicity being associated with larger nano-TiO₂ particles (Table 2).

In the current study, we found that titanium accumulates in a dose-dependent manner in the heart, liver, kidney, spleen, lung, and brain of mice after i.p. injection of nano-TiO₂ . This is consistent with published reports that absorption and distribution of nano-TiO₂ is dependent on blood circulation. Nanoparticles can be absorbed in mesenchymal cells through being ingested by airway epithelial cells; they can then penetrate into the blood or lymph, thus gradually being distributed to the whole body [52, 53]. It is worth noting that nano-TiO₂ in the abdomen cavity can be absorbed and transported to the brain by the circulatory system, and nano-TiO₂ can enter directly into the central nervous system without crossing the blood–brain barrier. This is consistent with previous studies [41, 54]. Nanoparticles can also be absorbed by the terminal nerve cell in the respiratory tract and then be transferred to the ganglion through the axon, eventually entering central nervous cells [8, 55]. Nano-TiO₂ can be absorbed in the nasal cavity through the olfactory epithelium, and then be transported to other parts of the brain, such as the hippocampus, through the olfactory nerve [41, 54]. Therefore, the brain may be directly exposed to nano-TiO₂ . Damage in the brain may be caused directly or indirectly by nano-TiO₂ .

Conclusions

Ingested nano-TiO₂ can be distributed to and accumulated in the heart, brain, spleen, lung, and kidney. It exhibits toxicity and causes disorders of the GLU and lipid metabolism. Nano-TiO₂ causes liver and brain toxicity mainly through increasing oxidative stress, decreasing antioxidant levels, and changing the expression of the protective genes in the liver. In addition, nano-TiO₂ has adverse effects on the growth and development of mouse embryos and the morphology of the tissues and organs. The size of nano-TiO₂ particles may affect their toxicity, with a trend of increasing toxicity being associated with larger nano-TiO₂ particles. These toxic effects are dose-dependent. Our study may provide data for the assessment of the risk of nano-TiO₂ exposure on human health.