Доставка ДНК-тетраэдра усиливает индуцированный доксорубицином апоптоз клеток рака толстой кишки HT-29

Фон

Доксорубицин (Dox) является одним из наиболее широко используемых противоопухолевых средств, и многочисленные клинические исследования показали, что Dox может резко препятствовать росту опухолевых клеток в различных клеточных циклах роста, подавляя синтез РНК и ДНК [1, 2]. Предыдущие исследования показали, что пролиферация опухолевых клеток эффективно блокируется в фазе G1, а метастазирование также ингибируется Dox в определенной концентрации [3]. Кроме того, эффективное ингибирование может быть достигнуто в относительно меньшей дозе по сравнению с другими противоопухолевыми препаратами [4]. Однако Dox обычно вызывал побочные эффекты в результате отсутствия специфического нацеливания на опухолевые клетки и неселективного ингибирования ДНК и РНК, что серьезно ограничивало клиническое применение [5, 6]. Между тем, низкая поглощающая способность клеток снижает накопление Dox в опухолевых клетках [7]. Следовательно, необходимо разработать эффективную систему доставки Dox, чтобы сделать Dox более специфичным и эффективным, чтобы его было легче инкапсулировать, а также чтобы он обладал отличной способностью приема и биосовместимостью.

Наноразмерные носители лекарств, такие как липосомы и неорганические наночастицы, могут способствовать проникновению Dox через мембрану опухолевой клетки, повышая эффективность нацеливания [8]. Тем не менее, доставка на основе липосом не может уменьшить побочные эффекты для нормальных клеток из-за относительно плохого нацеливания; Между тем, неорганические носители, такие как наночастицы мезопористого диоксида кремния, не могут быть полностью биоразложены in vivo, что затрудняет процесс дальнейшего поглощения лекарственного средства и приводит к потенциальной биотоксичности. Для этих функциональных систем доставки сложность приготовления, негомогенизация структур наночастиц и низкая эффективность инкапсуляции препятствуют клиническому расширению [9,10,11]. В качестве наноразмерного носителя лекарства с превосходными характеристиками доставки лекарств структуры на основе ДНК, такие как тетраэдр ДНК (тетра ДНК), могут проникать через мембрану, избегая несовместимости между электроотрицательной ДНК и плазматической мембраной [12,13, 14,15,16,17]. Лекарства и нацеленные молекулы могут быть ковалентно присоединены к тетраэдру ДНК. Более того, легкая абсорбция и биодеградация тетраэдрических последовательностей ДНК позволяет избежать длительного удержания. Аптамерные препараты, богатые гуанином, такие как AS1411, успешно доставляются в опухолевые клетки A549 и используются в качестве нацеливающих агентов и ингибиторов [18]. Иммунорегулирующие факторы, такие как CpG и siRNA, также могут доставляться в опухолевые клетки через тетра-носитель ДНК для регулирования иммунных ответов [19]. Обладая такими преимуществами, как низкая токсичность, надлежащая биосовместимость и регулируемое нацеливание, тетра ДНК продемонстрировала биобезопасность и потенциал для доставки Dox.

В этом исследовании функциональные частицы тетраэдра ДНК, собранные с Dox в качестве противоракового препарата и фолиевой кислотой в качестве специфических молекул распознавания [20], были сконструированы, синтезированы и охарактеризованы. Противоопухолевую эффективность оценивали на раковых клетках толстой кишки, учитывая значительно повышенную регуляцию фолатных рецепторов на поверхности клеточной мембраны. В частности, уровень клеточного поглощения, степень апоптоза, вызванного Dox, и ингибирование клеточной пролиферации измеряли на клеточных линиях HT-29.

Методы

Регенты и снаряжение

Олигонуклеотидные цепи ДНК были приобретены у TAKARA в Даляне, Китай. Среда Игла, модифицированная Дульбекко (DMEM), и фетальная бычья сыворотка были приобретены у Gibco в Нью-Йорке, США. Пенициллин и стрептомицин были приобретены в компании Beyotime biotechnology в Шанхае, Китай. Фолиевая кислота, доксорубицин, 3- (4,5-диметил-2-тиазолил) -2,5-дифенил-2- H -тетразолий бромид (МТТ) и агароза были приобретены у Sigma-Aldrich в Миссури, США. Все антитела были приобретены у компании Abcam Company в Шанхае, Китай. Другие реагенты были приобретены у Sinopharm Chemical Regent Co., Ltd. в Шанхае, Китай.

УФ-видимый спектрофотометр (Thermo Evolution 201) и инкубатор с постоянной температурой были приобретены у Thermo Fisher в США; центробежная машина (GT10-1) была приобретена у Beijing Era Beili Centrifuge Co., Ltd .; флуоресцентный спектрофотометр (UV-1800) был приобретен у Shimadzu Corporation. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (Visitech) была приобретена у компаний Leica; прибор для полимеразной цепной реакции (ПЦР, Т100), электрофореза белков и электрофореза нуклеиновых кислот были приобретены у Bio-Rad Company; динамический анализатор размера легких частиц был приобретен у компании Beckman; Планшеты для культивирования клеток с 96 или 24 лунками были приобретены у Dow Corning Corporation. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ, Agilent 1200) с колонкой C18 была приобретена у Agilent Technologies.

Клеточная линия рака толстой кишки человека HT-29 поддерживалась в среде DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 100 Ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина в увлажненной атмосфере, содержащей 95% воздуха и 5% диоксида углерода при 37 ° C. .

Синтез и очистка тетраэдра ДНК

В этом исследовании синтез осуществлялся согласно схематическим процедурам на рис. 1, а последовательности одноцепочечной ДНК (оцДНК) тетраэдра ДНК также представлены на рис. Более подробно, каждую оцДНК растворяли в 0,5 × TE буфере, и соответствующее значение оптической плотности (OD) ДНК определяли с помощью УФ-спектрофотометра при 260 нм. Дополнительный буфер ТЕ был добавлен, чтобы получить четыре цепи с той же концентрацией. Соотношение смешивания четырех оцДНК составляло 1:1:1:1 при концентрации 1 мкМ в 100 мкл. Реакцию проводили в аппарате для полимеразной цепной реакции (ПЦР) с условиями цикла:95 ° C, 10 мин, естественное охлаждение до 4 ° C. Всю одноцепочечную ДНК очищали с помощью ВЭЖХ с характеристическим пиком поглощения 260 нм. В спектре ВЭЖХ время пика тетра ДНК было быстрее, чем у однонитевой, и продукт собирали в соответствующий момент времени.

Принципиальная схема тетрадокса фолиевой кислоты-ДНК, тетрадокса ДНК и тетра-ДНК фолиевой кислоты. Были предоставлены однонитевые последовательности ДНК тетраэдра ДНК. Был изображен процесс нацеливания на опухолевые клетки, проникновения через клеточную мембрану и встраивания ДНК

Синтез и характеристика тетрадокса фолиевой кислоты и ДНК

Свободные водородные группы докса и фолиевой кислоты были модифицированы азидной группой, а затем соединены с 3'-ОН оцДНК с помощью реакции щелочной химии [21]. При добавлении другого количества оцДНК, меченой функциональными группами, соотношение функциональных групп можно стехиометрически контролировать посредством специфической гибридизации боковых цепей. Для синтеза тетраэдра фолиевая кислота-ДНК молярное соотношение фолиевой кислоты и тетраэдра ДНК было установлено равным 1:1. Для синтеза ДНК-тетра-Докса молярное соотношение Докса и ДНК-тетраэдра было установлено равным 4:1. Для синтеза тетра-докса фолиевой кислоты и ДНК молярное соотношение фолиевой кислоты, тетраэдра ДНК и докса было установлено соответственно как 1:1:3. Весь синтез проводили на микромолярном уровне при 37 ° C, а затем хранили при 4 ° C [22].

В этом исследовании серию тетракомплексов ДНК характеризовали электрофорезом в полиакриламидном геле (PAGE) с 8% -ным разделительным гелем (39% Acr-Bis) для проверки чистоты и относительных размеров молекул. Образцы состояли из различных тетраструктур ДНК и 6-кратного загрузочного буфера с соотношением компонентов смеси 2:1. Образцы окрашивали и анализировали после гель-электрофореза в течение 90 мин при 110 В. Чтобы выяснить различия в размерах частиц, образцы тетра ДНК также сканировали с помощью приборов динамического светорассеяния (DLS) с динамическим светом.

Тетра-фасилитированное клеточное поглощение ДНК

Для различных структур связывания, разработанных в этом исследовании, скорости поглощения клетками HT-29 сравнивали, чтобы определить эффективность доставки лекарств. Эффективность клеточного поглощения оценивалась и количественно определялась с использованием характеристического спектра флуоресценции Dox, то есть возбуждающего света при 470 нм и испускаемого света при 590 нм. Ячейки HT-29 размером 2 × 10 ⁵ / мл высевали в 24-луночные планшеты и культивировали в течение 24 часов. Клетки инкубировали с различными тетраструктурами ДНК при 10 мкМ еще 24 часа. Затем среду отбрасывали, и клетки трижды промывали PBS. Для фиксации клеток сразу же добавляли 4% параформальдегид при комнатной температуре для 30-минутной совместной инкубации, и клетки снова трижды промывали PBS. Наконец, 24-луночные планшеты наблюдались с помощью лазерного конфокального микроскопа, чтобы сравнить эффективность поглощения клетками на основе интенсивности испускаемого света.

Цитотоксичность и противораковая эффективность

Цитотоксичность и противоопухолевую эффективность оценивали с помощью анализа МТТ, при котором происходит окислительно-восстановительная реакция между МТТ в ДМСО и внутриклеточной сукцинатдегидрогеназой. Клетки HT-29 высевали в 96-луночные культуральные планшеты и культивировали в течение 24 часов.

Для цитотоксичности тетра ДНК в качестве носителя лекарственного средства среду, содержащую тетраструктуры ДНК в концентрации 0–100 мкМ, добавляли еще для 24- или 48-часовой инкубации. Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл раствора МТТ (5 мг / мл) и смесь инкубировали при 37 ° C в течение 4 часов. Затем жидкость удаляли, клетки лизировали и растворяли в 200 мкл ДМСО. Поглощение супернатанта измеряли при 570 нм с помощью Microreader. Необработанный образец HT-29 считался контрольной группой.

Для тетраэдра ДНК, соединенного с фолиевой кислотой или доксом, с одной стороны, исследования были сосредоточены на стабильности, биобезопасности и эффективности ингибирования; с другой стороны, также исследовалось, обладает ли Докс ДНК тетрадокс сравнимыми противоопухолевыми свойствами, как раньше. Таким образом, оценивали цитотоксичность и противоопухолевую эффективность тетракомплексов ДНК. Комплексы соответственно при 100 мкМ инкубировали с клетками HT-29. Образцы клеток собирали каждые 6 ч, а затем определяли с помощью МТТ-анализа для оценки влияния периода инкубации. Особое внимание было уделено разнице в противоопухолевой эффективности в результате изменения структур. Кроме того, влияние концентрации на ингибирование HT-29 после обработки тетрадоксом фолиевой кислоты и ДНК оценивалось при 0–200 мкМ с помощью тестов MTT.

Вестерн-блоттинг и проточная цитометрия

Чтобы охарактеризовать клеточный апоптоз, индуцированный Dox с помощью тетра-доставки ДНК, образцы белка из обработанных клеток нагревали и растрескивали с использованием пиролизной жидкости, анализировали с помощью 12% SDS-PAGE в условиях 100 В при постоянном токе для разделения образцов, а затем блотировали. к мембранам из ПВДФ диаметром 0,22 мкм в течение 1 ч. Пробы блокировали обезжиренным молоком на 1 ч. После трехкратной промывки PBST образцы инкубировали в течение ночи с кроличьими антителами против каспазы-3. Затем образцы зондировали вторичным антителом козы против кроличьего IgG в течение 1 ч, а затем промывали PBST и визуализировали с помощью системы визуализации белков Bio-Rad. Кроме того, GAPDH был выбран в качестве внутреннего эталонного белка, поскольку он стабильно экспрессируется в клетках.

Далее проточная цитометрия использовалась для количественной оценки уровней апоптоза в выбранной концентрации и в выбранный момент времени с помощью анализов МТТ. Клетки HT-29 инкубировали с ингибиторами в течение определенного периода времени, а затем измеряли с помощью количественной проточной цитометрии с использованием метода двойного окрашивания аннексином V-PI.

Количественная оценка пролиферации клеток

Метод подсчета клеток использовался для количественной оценки пролиферации клеток с течением времени. Более подробно, после обработки фолиевой кислотой-ДНК-тетрадоксом в течение периода времени при 100 мкМ клетки переваривали 0,25% трипсином в течение 30 с, а затем добавляли равный объем полной среды для прекращения реакции. Супернатант удаляли после центрифугирования при 1000 об / мин в течение 3 мин, и клетки ресуспендировали в полной среде. Количество клеток в каждой точке обнаружения регистрировали под оптическим микроскопом с использованием планшетов для подсчета клеток, чтобы построить кривую клеточной пролиферации.

Статистический анализ

В этом исследовании значимость различий определялась с использованием t Стьюдента. тест (двусторонний; двухвыборочная одинаковая дисперсия). P <0,05 означает значительные различия между разными группами.

Результаты

Приготовление тетрадокса фолиевой кислоты и ДНК

В конкретном процессе синтеза Dox смешивали с тетраэдром ДНК в различных пропорциях для завершения загрузки и сборки Dox ( w _м =543,52) и фолиевой кислоты ( w _м =441,4). Как показано на рис. 2а, из-за того, что докс и фолиевая кислота являются мономерами с относительно низкой и близкой молекулярной массой, ДНК в тетраэдре и конъюгаты с одной функциональной молекулой имеют примерно эквивалентные молекулярные массы. Однако сборка докса или фолиевой кислоты со всеми четырьмя вершинами ДНК тетраэдра явно увеличивала молекулярный размер тетраэдра. Как показано на рис. 2b, большая часть тетраэдрического мономера ДНК имеет размер менее 15 нм. С увеличением групп связывания симметричная структура тетра ДНК разрушалась, и средние размеры частиц соединений значительно увеличивались. В частности, увеличение размера фолиевой кислоты-ДНК-тетрадокса увеличило диаметр среды до 20 нм.

Характеристика тетра ДНК с различными составляющими. а Слева направо:лестница ДНК, тетра ДНК, тетра-фолиевая кислота-ДНК, тетрадокс-ДНК фолиевая кислота-ДНК и тетрадокс ДНК, полученные в 8% SDS-PAGE. б Распределение по размерам тетрадокса ДНК, тетрадокса фолиевой кислоты-ДНК, тетрадокса фолиевой кислоты и тетрадокса ДНК, обнаруженных с помощью динамического светорассеяния

Эффективность доставки лекарств

После инкубации с различными тетраструктурами ДНК в течение 24 часов внутриклеточная эффективность Dox была оценена с помощью флуоресцентной визуализации, где внутриклеточная красная флуоресценция является характерной флуоресценцией Dox; следовательно, клетки, инкубированные с тетра-докс ДНК, не проявляли какого-либо флуоресцентного сигнала, как показано на рис. 3а, а красные сигналы клеток, инкубированных с комплексами фолиевая кислота-ДНК-тетрадокс и ДНК-тетра-докс, были явно выше, чем с доксом, что означает значительно повышенная эффективность клеточного поглощения докса в результате тетра ДНК способствует проникновению через мембрану, а также внутриклеточной стабильности конъюгатов докса и тетра ДНК.

Эффективность поглощения клетками HT-29 после инкубации с различными комплексами в течение 24 часов. а Обнаружение с помощью конфокальной микроскопии (красный цвет - возбуждающий флуоресцентный свет Dox, масштабная линейка =10 мкм). б Интенсивность клеточной флуоресценции. ** P <0,05 по сравнению с группой тетра ДНК

Дальнейший количественный анализ интенсивности флуоресценции (рис. 3b) подтвердил визуальные данные, и не было существенной разницы между комплексами фолиевая кислота-ДНК тетрадокс и ДНК тетра-докс ( P <0,05). Методология совместной инкубации лекарств и клеток препятствует полному проявлению целенаправленной способности фолиевой кислоты. Относительно высокая концентрация подтвердила специфическое распознавание рецепторов фолиевой кислоты, что теоретически более очевидно при применении in vivo со сложной системой кровообращения. Короче говоря, доставка тетра ДНК гарантировала противоопухолевую эффективность Докса.

Цитотоксичность и противораковая эффективность

Во-первых, жизнеспособность клеток HT-29, совместно инкубированных с различными концентрациями тетра ДНК, исследовали с помощью анализа МТТ. Не было очевидной цитотоксичности обработки ДНК тетра в клетках HT-29 в концентрации 0–100 мкМ в течение 24 и 48 часов (рис. 4а). Следовательно, наноразмерный тетраэдр ДНК обеспечил биобезопасную платформу-носитель лекарств.

Цитотоксичность и противоопухолевая эффективность комплексов Dox и тетра ДНК для клеток HT-29. а Жизнеспособность клеток HT-29, инкубированных с тетра ДНК в различных концентрациях в течение 24 или 48 часов. б Противоопухолевая эффективность комплексов Докс при 100 мкМ. c Жизнеспособность клеток HT-29, инкубированных с тетрадоксом фолиевой кислоты и ДНК при различных концентрациях в течение 24 или 48 часов

Во-вторых, в результате разницы в эффективности доставки Dox, тетра-Dox фолиевая кислота-ДНК и тетра-Dox ДНК показали более значительную эффективность ингибирования в течение 48 часов (рис. 4b). Из-за отсутствия эффективных противоопухолевых компонентов тетрафолиевая кислота ДНК приводит к незначительному снижению (<10%) жизнеспособности во время 48-часовой совместной инкубации. Из-за того, что Dox не может объективно проникать через мембрану, снижение жизнеспособности клеток, вызванное Dox, было меньше, чем в других группах. В частности, тетра-Докс фолиевая кислота-ДНК показал более раннее и значительное снижение через 6 часов после инкубации, доказывая, что нацеливание фолиевой кислоты помогает лекарствам локализоваться на мембране и заставляет Докс действовать более своевременно. Напротив, ДНК-тетрадокс начал проявлять очевидный эффект через 12 часов после инкубации, демонстрируя важность целевых групп.

Кроме того, клетки HT-29 обрабатывали тетрадоксом фолиевая кислота-ДНК в концентрации 0–200 мкМ для определения эффективной концентрации (рис. 4c). Жизнеспособность клеток HT-29 быстро снижалась с увеличением концентрации (0–100 мкМ) комплекса, но не было значительных различий между концентрациями 100 и 200 мкМ, что указывает на дозозависимый характер тетрациклического соединения фолиевой кислоты и ДНК. Dox, где 100 мкМ можно рассматривать как эффективную концентрацию для противоопухолевого эффекта. Кроме того, жизнеспособность клеток значительно изменилась с 24 до 48 часов для групп 10, 20 и 50 мкМ, что указывает на то, что период инкубации также был фактором, влияющим на противораковую эффективность на основе фолиевой кислоты и ДНК тетрадокса. P>

Апоптоз, вызванный тетрадоксом фолиевой кислоты и ДНК

Соответственно, на основании анализа вестерн-блоттинга (рис. 5а) было обнаружено значительное увеличение экспрессии каспазы-3, индуцированной фолиевой кислотой-ДНК-тетрадоксом и ДНК-тетрадоксом, что доказывает, что апоптоз был основным путем доксалицирования. индуцированная гибель клеток.

Клеточная экспрессия связанной с апоптозом каспазы-3 после обработки различными комплексами ( a ) и проточная цитометрия клеток HT-29 после инкубации с ДНК тетра, докс, ДНК тетрадокс и фолиевая кислота-ДНК тетрадокс ( b - е )

Проточная цитометрия (рис. 5b-e) дополнительно подтвердила, что 6-часовая инкубация с фолиевой кислотой-ДНК-тетрадоксом при 100 мкМ индуцировала апоптоз на 68,7%. Между тем, уровни апоптоза, вызванные Dox и ДНК-тетрадоксом, составляли только 32,8 и 60,5% при тех же условиях инкубации.

Подавление пролиферации клеток

Основываясь на анализах МТТ, 100 мкМ была эффективной концентрацией для индукции апоптоза и была выбрана в эксперименте по пролиферации клеток. Как показано на кривой клеточной пролиферации (фиг. 6), из-за длительного процесса клеточного поглощения, ингибирование клеточной пролиферации не было полностью показано на ранней стадии совместной инкубации. Значительный ингибирующий эффект проявлялся после инкубации с тетрадоксом фолиевой кислоты и ДНК в течение более 6 часов, что доказывает существование тетра-усиленного эндоцитоза ДНК. Между тем, 6 часов - это сравнительный период времени с эффективным периодом времени, показанным на рис. 4b.

Ингибирование пролиферации клеток, индуцированное инкубацией с тетрадоксом фолиевой кислоты и ДНК в концентрации 100 мкМ в течение различных периодов времени

Обсуждение

Как обычное средство модификации ДНК, щелочная химическая реакция имела преимущества высокой эффективности реакции, контроля скважины и легкости работы [21]. Электрофореграмма, отображаемая с одной торговой маркой (рис. 2а), указывает на то, что продукты с высокой чистотой были получены ковалентным связыванием с помощью реакции щелочной химии. Флуоресцентные свойства Dox позволяют отслеживать его in vitro и in vivo; Между тем флуоресценция внутри опухолевых клеток косвенно доказывала стабильность тетрадокса фолиевой кислоты и ДНК в процессе проникновения через клеточную мембрану. Таким образом, тетрадокс фолиевой кислоты и ДНК был пригоден и стабилен для биомедицинских применений.

Тетра ДНК обладает способностью доставлять лекарства в клетки. Все последовательности ДНК, использованные в этом исследовании, не были закодированы для какой-либо генетической информации. Таким образом, во всех исследованиях не сообщалось о побочных эффектах как на экспрессию генов, так и на клеточный метаболизм. Между тем, из-за высокой экспрессии рецептора фолиевой кислоты на поверхности опухолевых клеток, фолиевая кислота выбрана в качестве специфических нацеливающих молекул системы доставки лекарств для повышения эффективности поглощения тетра-комплексов ДНК. Однако в условиях, когда тетра ДНК находится в относительно высокой концентрации, преимущество нацеливания на рецепторы фолиевой кислоты не было полностью отражено in vitro. Соответственно, для применения in vivo фолиевая кислота потенциально могла повысить эффективность нацеливания в сложной системе кровообращения.

В настоящее время противоопухолевые препараты обычно вызывают неожиданные побочные эффекты, поэтому исследования по повышению способности к нацеливанию на опухолевые клетки и эффективности доставки были горячей темой [23,24,25]. Предыдущие исследования показали, что способность тетраэдра ДНК переносить лекарства основана на его хорошей совместимости. Тетраэдр ДНК - это искусственный сосуд благоприятной модификации и надлежащей биосовместимости. В этом исследовании успешное сочетание докса и фолиевой кислоты с тетраэдром ДНК привело к удовлетворительному ингибирующему эффекту и привело к очевидному апоптозу клетки HT-29. Благодаря тому, что тетра ДНК может быть модифицирована и соединена с лекарствами и нацеливающими молекулами, было реализовано повышение локальной концентрации лекарственного средства в опухолевой клетке. Вышеупомянутые результаты доказали хорошее распознавание опухолевых клеток и соответствующий усиленный ингибирующий эффект за счет доставки тетра ДНК, и эта наноразмерная система доставки лекарств может использоваться более широко.

Выводы

В качестве недавно разработанной стратегии доставки лекарств наноразмерные структуры ДНК имеют низкую стоимость, высокую стабильность и возможность синтеза; Между тем, он является биобезопасным из-за отсутствия экзогенной иммунной активности. Стратегия связывания тетраэдра ДНК способствует целевой доставке Dox, повышает противоопухолевую эффективность Dox в отношении клеток рака толстой кишки и дает многообещающее вдохновение и идею для разработки лекарств.