Биофлавоноиды, содержащие генистеин, наночастицы хитозана, нацеленные на фолатные рецепторы, для усиления противоракового эффекта при раке шейки матки

Фон

Рак шейки матки человека - один из самых популярных видов рака у женщин репродуктивного возраста во всем мире, который в основном возникает из-за вируса папилломы человека (ВПЧ) [1]. Международное агентство по изучению рака назвало снижение иммунной защиты, курение и нерегулярную половую активность основными причинами рака шейки матки [2]. Последние достижения в области медицинских технологий и диагностики имеют большое влияние на снижение смертности от рака шейки матки; тем не менее, этот класс рака все еще растет в развивающихся странах, таких как Китай. Две профилактические вакцины против ВПЧ (Гардасил и Церварикс) были проданы для лечения рака шейки матки; тем не менее, он показал эффективность только у взрослых пациентов и не оказал положительного воздействия на пациентов в целом [3, 4]. Поэтому регулярно используются такие варианты лечения, как химиотерапия, хирургия и лучевая терапия; однако ни один из них не эффективен при лечении рака шейки матки. Сообщалось, что химиотерапевтические агенты или другие небольшие молекулы повышают эффективность лечения рака, если их вводить специфически [5].

В последнее время природные соединения привлекли значительное внимание при лечении рака, поскольку известно, что они менее токсичны по сравнению с химиотерапевтическими препаратами [6]. В частности, сообщалось, что флавоноиды, присутствующие во многих растениях, обладают противовоспалительными и противораковыми свойствами. Генистеин (4 ', 5,7-тригидроксиизофлавон) (GEN) представляет собой потенциально эффективный изофлавон сои, которому уделяется повышенное внимание из-за его мощных противораковых свойств [7, 8]. Исследования показали, что GEN ингибирует протеинтирозинкиназы и NF-κB и останавливает клеточный цикл в фазе G2 / M. Это приведет к подавлению активности генов, связанных с пролиферацией клеток и ростом раковых клеток [9, 10]. Остановка фазы G2 / M подавляет миграцию раковых клеток, инвазию и индуцирует апоптоз и гибель клеток [11]. Однако клинический потенциал GEN был ограничен из-за его ограниченной растворимости (~ 1,45 мкг / мл) и ограниченной биодоступности [12]. Следовательно, существует неотложная необходимость в улучшении физико-химических свойств GEN и его противораковых свойств.

Применение нанотехнологий в медицине привлекает все большее внимание из-за их способности улучшать противораковые свойства различных малых молекул [13]. Инкапсуляция лекарственного средства в наночастице дает множество преимуществ, таких как высокая стабильность, повышенная нагрузка лекарственного средства, более высокая интернализация, благоприятное биораспределение и улучшенная фармакокинетика [14]. Важно отметить, что наночастицы усиливают противоопухолевый эффект инкапсулированного соединения за счет преимущественного накопления в опухолевых тканях. Кроме того, наночастицы могут обратить вспять множественную лекарственную устойчивость (МЛУ) опухолевых клеток [15, 16]. В настоящем исследовании мы использовали наночастицы хитозана природного происхождения из-за его превосходной биоразлагаемости и профиля биосовместимости. Кроме того, группа первичных аминов хитозана обладает некоторыми важными свойствами, включая растворимость в воде и гемосовместимость. Также аминогруппа может быть использована для изменения поверхности наночастиц [17]. Для повышения целевой специфичности мы нанесли конъюгированную фолиевую кислоту на поверхность наночастиц хитозана. Фолиевая кислота была выбрана в качестве лиганда нацеливания из-за ее сверхэкспрессии в клетках рака шейки матки. Рецепторы фолиевой кислоты присутствуют в большом или большом количестве в клетках рака шейки матки. Чтобы быть конкретным, FRs-α присутствует также в нормальных клетках, но не подвергается циркуляции крови, тогда как он сильно подвержен циркуляции крови в случае раковых клеток, что делает его привлекательной мишенью для наночастиц, конъюгированных с фолатом, которые могут интернализоваться посредством эндоцитоза. механизмы [18, 19].

В настоящем исследовании мы в первую очередь нацелены на усиление противоопухолевых свойств GEN по отношению к FR-α-сверхэкспрессированным клеткам рака шейки матки HeLa путем инкапсуляции в наночастицы хитозана, конъюгированные с ЖК. Наночастицы были охарактеризованы с точки зрения размера, формы и кинетики высвобождения in vitro. Направляющее действие FA было изучено с помощью анализа клеточного поглощения в раковых клетках HeLa. Противораковое действие GEN и наночастиц, нагруженных GEN, было изучено с помощью анализа цитотоксичности, анализа живых / мертвых и анализа апоптоза.

Методы

Материалы

Генистеин был приобретен у Aladdin Chemicals (Шанхай, Китайская Народная Республика). Фолиевая кислота, хитозан (деацетилированный на 85%), была приобретена в Sigma-Aldrich, Китай. EDC и NHS были также приобретены у Sigma-Aldrich, Китай. Все остальные химические вещества относятся к категории реактивов и используются без каких-либо модификаций.

Приготовление наночастиц хитозана, конъюгированных с GEN, фолиевой кислотой

Перед приготовлением наночастиц был приготовлен конъюгат фолиевой кислоты и хитозана. Вкратце, 44,1 мг фолиевой кислоты растворяли в ДМСО вместе со смесью гидрохлорида 1- (3-диметиламинопропил) -3-этилкарбодиимида (EDAC.HCl) и N-гидроксисукцинимида (NHS) (молярное соотношение 1:1,5:1,5. ). Смесь перемешивали в течение 30 минут для активации функциональной группы. Органический раствор добавляли по каплям в раствор хитозана (0,5% мас. / Мас.) При непрерывном перемешивании. Перемешивание продолжали в течение ночи в темноте. Доводили pH до 8 за счет добавления 1 М гидроксида натрия. В конце смесь центрифугировали для отделения желтого осадка и промывали карбонатом натрия, а затем снова диализовали водой.

Для приготовления наночастиц GEN, хитозан и конъюгат хитозан-FA (10:1) растворяли в ДМСО. Затем раствор ДМСО по каплям добавляли к 0,5% раствору Твина 80 при непрерывном перемешивании. Смесь перемешивали в течение 3 часов и после испарения всех растворителей суспензию центрифугировали в течение 30 минут при 10000 об / мин при 4 ° C. Супернатант удаляли и оценивали методом ВЭЖХ. Образцы были количественно определены с помощью ВЭЖХ (LC 1100, Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния, США) с использованием обращенно-фазовой колонки C-18 при 25 ° C. Подвижная фаза метанол / вода (60/40, v / v) использовали в качестве подвижной фазы при скорости потока 1 мл / мин.

Анализ размера частиц и морфологии поверхности

Размер частиц и распределение наночастиц по размерам наблюдали с помощью Malvern Mastersizer 2000 (Zetasizer Nano ZS90, Malvern Instruments Ltd., UK). Перед анализом образцы разбавляли подходящим образом. Все измерения были выполнены в трех экземплярах.

Морфологию поверхности наночастиц оценивали с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ТЕМ, JEM-1230, JEOL, Токио, Япония). Вкратце, дисперсия наночастиц была смешана с 2% PTX, нанесена на сетку ПЭМ и высушена в течение 10 мин при слабом инфракрасном излучении. Образцы контрастно окрашивали фосфотунгиновой кислотой (2%) и наблюдали с помощью ПЭМ при ускоряющем напряжении 100 кВ.

Исследование выпуска лекарств in vitro

Исследование высвобождения лекарства проводили методом диализа. Вкратце, 5 мг эквивалента наночастиц GEN суспендировали в 1 мл буфера для высвобождения (PBS, pH 7,4) и переносили в диализную трубку (MWCO:3500). Пробирку для диализа помещали в пробирку Falcon, содержащую 25 мл буфера для высвобождения. Пробирку Falcon помещали в шейкер при осторожном перемешивании при 37 ° C. Через заранее заданные интервалы отбирали определенный объем образца и заменяли свежим буфером или средой. Лекарство, высвобожденное из высвобождающей среды, исследовали с помощью ВЭЖХ.

Культура клеток

Клеточная линия карциномы шейки матки человека (клетки HeLa) была получена от ATCC, MS, USA и выращена в среде DMEM, содержащей 10% FBS и смесь антибиотиков, при 37 ° C в увлажненной атмосфере, содержащей 5% диоксида углерода.

Использование сотовой связи

Эффективность нацеливания наночастиц (GCN и FGCN) изучалась с помощью анализа клеточного поглощения. В этом исследовании использовался флуоресцентный зонд кумарин-6. Клетки помещали в 96-луночный планшет и оставляли для прикрепления на 24 часа. Культуральную среду удаляли и заменяли свежей средой, содержащей GCN и FGCN, и инкубировали в течение различных интервалов. Затем клетки промывали PBS, лизировали (Triton-X), центрифугировали и собирали супернатант. Супернатант использовали для оценки интенсивности флуоресценции с помощью ридера для микропланшетов (GENios, Tecan, Швейцария). Поглощение измеряли при длине волны возбуждения 430 нм и длине волны испускания 485 нм.

Визуализация клеточного поглощения

Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп (Olympus Fluoview FV-1000, Токио, Япония) использовался для определения качественного клеточного поглощения в раковых клетках. 2 × 10 ⁵ клетки высевали в 6-луночный планшет и инкубировали в течение 24 часов. Среду удаляли и заменяли свежей средой, содержащей GCN и FGCN, и инкубировали в течение 2 часов. Клетки промывали PBS, фиксировали и снова промывали. Затем клетки наблюдали с помощью CLSM.

Анализ цитотоксичности

Эффективность уничтожения клеток свободными GEN, GCN и FGCN изучали с помощью протокола анализа МТТ. Клетки HeLa при плотности посева 1 × 10 ⁴ клетки помещали в 96-луночный планшет и оставляли для прикрепления на 24 часа. На следующий день клетки обрабатывали свободными GEN, GCN и FGCN в 100 мкл свежей среды и инкубировали в течение 24 часов. После этого среду удаляли и дважды промывали PBS. Десять микролитров DMEM, содержащей МТТ (5 мг / мл), помещали в 96-луночный планшет и оставляли на 4 часа. Раствор МТТ сливали и добавляли ДМСО для растворения кристаллов формазана, которые соответствуют живым клеткам. Поглощение формазана изучали при длине волны 570 нм с использованием планшет-ридера (Bio-Tek Instruments Inc., США). IC50 также рассчитывали с использованием программного обеспечения GraphPad Prizm (версия 17).

Анализ живых / мертвых

Клетки HeLa при плотности посева 2 × 10 ⁵ клетки высевали в 6-луночный планшет и инкубировали в течение 24 часов. На следующий день клетки обрабатывали свободными GEN, GCN и FGCN в 100 мкл свежей среды и инкубировали в течение 24 часов. После этого среду удаляли и дважды промывали PBS. Клетки обрабатывали согласно инструкции производителя (Molecular Probes, США). Кальцеин AM и гомодимер этидия представляют собой соответствующие красители живых и мертвых клеток, которые используются для окрашивания.

Статистический анализ

Данные были статистически проанализированы с использованием t контрольная работа. А P значение менее 0,05 использовалось для демонстрации статистической значимости. Все эксперименты были выполнены в трех экземплярах.

Результаты и обсуждение

Рак шейки матки человека является одним из самых популярных видов рака у женщин репродуктивного возраста во всем мире, который в основном возникает из-за вируса папилломы человека. Поэтому регулярно используются такие варианты лечения, как химиотерапия, хирургия и лучевая терапия; однако ни один из них не эффективен при лечении рака шейки матки. Сообщалось, что химиотерапевтические агенты или другие небольшие молекулы улучшают эффективность лечения рака, если они доставляются специфически. В последнее время значительное внимание при лечении рака привлекли природные соединения, поскольку известно, что они менее токсичны по сравнению с химиотерапевтическими препаратами. Геништейн получил повышенное внимание из-за его мощного противоракового свойства. Однако клинический потенциал GEN был ограничен из-за его плохой растворимости (~ 1,43 мкг / мл) и низкой биодоступности. В настоящем исследовании мы в первую очередь нацелены на усиление противоопухолевых свойств GEN по отношению к сверхэкспрессируемым FR-α клеткам рака шейки матки HeLa путем инкапсуляции в наночастицы хитозана, конъюгированные с ЖК (рис. 1).

Схематическое изображение получения наночастиц хитозана, конъюгированных с фолиевой кислотой, содержащих генистеин

Физико-химическая характеристика системы наночастиц, нагруженных GEN

Размер и дзета-потенциал системы частиц играет решающую роль в интернализации клеток и системной эффективности противоопухолевых препаратов. Динамическое рассеяние света (DLS) использовалось для определения размера частиц и гранулометрического состава наночастиц, нагруженных GEN (рис. 2). Средний размер частиц GCN составлял ~ 140 нм, в то время как FGCN составлял ~ 165 нм с превосходным индексом полидисперсности. Средний гидродинамический диаметр FGCN составляет менее 200 нм, что достаточно для проникновения в ткани опухоли с использованием усиленных эффектов проницаемости и удерживания. Небольшой размер частиц может препятствовать быстрому удалению наночастиц из тела (RES) [20]. Поверхностный заряд считается ключевым показателем стабильности частиц в виде суспензии. Средний дзета-потенциал GCN составлял +26 мВ, в то время как FGCN составлял +21,5 мВ. Незначительное уменьшение поверхностного заряда может быть связано с замещением аминогруппы хитозана. Более того, GCN и FGCN показали высокую эффективность улавливания, превышающую> 95%, что указывает на их пригодность для системного применения. Размер частиц и дзета-потенциал FGCN оставались неизменными при хранении в течение 3 месяцев, что указывает на его высокую стабильность при хранении (рис. 3).

Просвечивающий электронный микроскоп ФГКН

Профиль высвобождения GCN и FGCN in vitro в фосфатно-солевом буфере (pH 7,4). Количество высвободившегося лекарственного средства определяли количественно методом ВЭЖХ, и эксперимент проводили в трех повторностях

Анализ морфологии поверхности

Морфология поверхности оптимизированного FGCN была охарактеризована с помощью ПЭМ. Наночастицы имели морфологию сферической формы и равномерно распределялись в медной сетке. Размер частиц, наблюдаемый при анализе ПЭМ, соответствовал наблюдению DLS (рис. 4).

Анализ клеточного поглощения GCN и FGCN в клетках рака шейки матки HeLa. а Количественный анализ клеточного поглощения наночастиц флуоресцентным методом. б Анализ клеточного поглощения на основе конфокального лазерного сканирующего микроскопа (CLSM). Кумарин-6 использовали в качестве флуоресцентного зонда

Кинетика высвобождения лекарства in vitro

Высвобождение GEN из GCN и FGCN осуществляли методом диализа. PBS использовали для проведения исследования высвобождения для моделирования физиологических условий. Как и ожидалось, профиль выпуска GCN и FGCN был почти одинаков. Оба препарата демонстрировали профиль контролируемого высвобождения GEN и демонстрировали кинетику монофазного высвобождения. Примерно 35-40% лекарственного средства высвободилось из обеих систем наночастиц в конце 24 часов. Тенденция к скорости высвобождения GEN продолжалась до конца периода исследования, и, наконец, было высвобождено ~ 90% препарата. Конъюгирование фолиевой кислоты на поверхности влияет на низкое высвобождение лекарственного средства, что указывает на влияние присутствия конъюгированного материала. Сообщалось, что контролируемое высвобождение лекарственного средства из NP приписывалось удлинению пути лекарственного средства к внешней среде высвобождения. В целом, контролируемое высвобождение лекарства в условиях pH 7,4 предполагает, что большая часть лекарства останется нетронутой и со временем будет накапливаться в тканях опухоли.

Исследование клеточного поглощения in vitro

Внутриклеточная концентрация GEN очень важна для проявления его цитотоксического действия в раковых клетках. Следовательно, потенциал клеточного поглощения системой NP очень важен с точки зрения терапевтической эффективности. GCN и FGCN, нагруженные кумарином-6, инкубировали с раковыми клетками в разные моменты времени. Обе системы NP демонстрировали зависящее от времени клеточное поглощение с максимальным клеточным поглощением через 4 часа. Как и ожидалось, FGCN, нацеленный на рецепторы фолиевой кислоты, показал статистически ( p <0,05) более высокий клеточный захват в раковых клетках HeLa. Опять же, преобладающее поглощение FGCN в большинстве случаев будет связано с наличием FA на поверхности частицы, которая может облегчить взаимодействие лиганда с соответствующими рецепторами и которая присутствует в больших количествах в клетках HeLa [21].>

Поглощение клетками дополнительно подтверждается микроскопическими изображениями. Клетки инкубировали с соответствующими препаратами и инкубировали в течение 2 часов. Как видно, высокая интенсивность флуоресценции наблюдалась для раковых клеток, подвергшихся воздействию FGCN, по сравнению с таковой для клеток, обработанных GCN. Эти результаты показали, что FGCN, конъюгированный с фолиевой кислотой, обладает специфическим сродством к злокачественным клеткам HeLa благодаря распознаванию рецептора лиганда (FA-FR-α).

Цитотоксичность in vitro

Цитотоксическая активность GEN, GCN и FGCN in vitro на раковые клетки HeLa изучалась с помощью протокола анализа MTT. Как видно, наноформулировки GEN были более эффективны в уничтожении раковых клеток по сравнению с таковыми из свободного GEN. Однако все композиции проявляли типичный дозозависимый цитотоксический эффект в отношении раковых клеток. Как и ожидалось, наноформы, меченные фолиевой кислотой, показали статистически ( p <0,05) более высокий цитотоксический эффект по сравнению с нецелевыми препаратами. Превосходный противораковый эффект FGCN был приписан специфической рецептор-опосредованной интернализации наночастиц в раковых клетках, которая может увеличивать концентрацию лекарства во внутриклеточной среде. Кроме того, способность наночастиц контролировать высвобождение инкапсулированного соединения также способствует высокой цитотоксичности FGCN. Значение IC50 использовали для оценки реального цитотоксического действия препаратов на раковые клетки. Как правило, это концентрация, которая требуется для уничтожения половины исходных клеток. Результаты показали, что значение IC50 GEN уменьшилось с 33,8 до 26,5 мкг / мл при обработке GCN. Важно отметить, что значение IC50 снизилось до 14,6 мкг / мл при обработке FGCN после 24 ч инкубации. Сообщалось, что наночастицы снижают эффект МЛУ, и, таким образом, ожидается, что они увеличат противоопухолевую эффективность GEN за счет уменьшения его оттока из клеток, опосредованного P-гликопротеином. Превосходный противораковый эффект FGCN согласуется с его высоким клеточным захватом в раковых клетках HeLa [22].

Микроскопический анализ

Морфологический анализ раковых клеток проводился после лечения противоопухолевыми препаратами. Композиции подвергали воздействию раковых клеток и инкубировали в течение 24 часов. Контрольные клетки были нормальными и распределялись на покровном стекле планшета с лунками, тогда как клетки в группе, обработанной препаратами, уменьшились в размерах. В соответствии с анализом цитотоксичности морфология раковых клеток была различной для разных составов. Как показано, клетки, обработанные FGCN, имели меньшее количество и округлую морфологию, что указывает на более высокую цитотоксичность составов. GCN также вызывал заметные изменения в раковых клетках из-за его достаточно высокого поглощения в раковых клетках. Результаты ясно показывают, что наночастицы, покрытые хитозаном, будут полезны для лечения рака шейки матки (рис. 5).

Анализ цитотоксичности in vitro генов GEN, GCN и FGCN в раковых клетках HeLa. Клетки обрабатывали соответствующими составами и инкубировали в течение 24 часов. ** p <0,01 - статистическая разница между FGCN и GEN.A

Анализ живых / мертвых

Цитотоксический потенциал отдельных составов был дополнительно изучен анализом живых / мертвых. Количество живых и мертвых клеток после обработки препаратом (в течение 24 ч) визуализировали по интенсивности зеленой флуоресценции. Кальцеин AM и краситель бромистого этидия являются типичными маркерами живых и мертвых клеток, которые наносят на клетки, обработанные препаратами. Оставшиеся живые клетки, присутствующие после лекарственной обработки, поглощают кальцеин и излучают зеленое флуоресцентное излучение (488 нм). Как показано, необработанные клетки показали высокую интенсивность флуоресценции (зеленая флуоресценция), и обработка свободным GEN также не уменьшала рост клеток. С другой стороны, FGCN показал меньше живых клеток и больше мертвых клеток (низкая интенсивность флуоресценции), что указывает на мощный эффект. Высокий уровень гибели клеток в группе, получавшей FGCN, был приписан более высокой интернализации наночастиц в раковых клетках. Результат согласуется с результатами анализа цитотоксичности (рис. 6).

Морфологический анализ раковых клеток HeLa после обработки GEN, GCN и FGCN

Анализ апоптоза

В этом исследовании мы разработали уникальную систему доставки, нацеленную на рецепторы фолиевой кислоты, которая может увеличить внутриклеточную концентрацию GEN и улучшить противораковый эффект в клетках рака шейки матки. Следовательно, чтобы проанализировать свойство индукции апоптоза свободных GEN, GCN и FGCN NP, клетки оценивали с помощью проточной цитометрии после двойного окрашивания аннексином V / PI. На фигуре 7 показано, что клетки, обработанные свободным GEN, не вызывали заметного апоптоза раковых клеток, в то время как GCN (~ 22%) был эффективен в индукции апоптоза в этих раковых клетках. Как и ожидалось, FGCN продемонстрировал заметный апоптоз раковых клеток (~ 55%), что указывает на его превосходный противораковый эффект. Более высокий противораковый эффект составов был обусловлен специфическим сродством лиганда к соответствующим рецепторам, что, в свою очередь, увеличивало концентрацию лекарственного средства в раковых клетках. Результаты ясно показывают, что наночастицы, покрытые хитозаном, будут полезны для лечения рака шейки матки. Платформа нанотехнологий для противоопухолевых препаратов увеличила токсичность раковых клеток и повысила терапевтическую эффективность противоопухолевых агентов (рис. 8).

Анализ живых / мертвых раковых клеток HeLa после обработки GEN, GCN и FGCN. Зеленая флуоресценция указывает на живые клетки

Анализ апоптоза раковых клеток HeLa после обработки GEN, GCN и FGCN. Проточный цитометр использовали для анализа доли апоптоза клеток. ** p <0,01 - статистическая разница между FGCN и GEN

Выводы

В этом исследовании новая наночастица хитозана, конъюгированная с фолиевой кислотой, была разработана для специфической доставки биофлавоноида генистеина (GEN) в клетки рака шейки матки. FGCN демонстрирует более высокий потенциал интернализации в клетках HeLa, чем GCN. Результаты показали, что FGCN обладает определенным сродством к клеткам HeLa, что способствует лучшему лечению. Наноформы, меченные фолиевой кислотой, проявляли лучший цитотоксический эффект по сравнению с нецелевыми составами. Соответственно, значение IC50 GEN снизилось с 33,8 до 14,6 мкг / мл при обработке FGCN после 24 ч инкубации. Исследования апоптоза показали, что наночастицы FGCN были либо GCN, либо свободным GEN с точки зрения противораковой активности. В целом, результаты показали, что конъюгация фолиевой кислоты с системой доставки может иметь большое влияние на выживаемость при раке шейки матки, что будет полезно для лечения рака в целом. Исследование на клинической модели животных станет следующим шагом настоящего исследования.

Сокращения

EPR:

Улучшенная проницаемость и удерживание

FGCN:

наночастицы хитозана, конъюгированные с фолиевой кислотой, нагруженные GEN

FR:

Рецепторы фолиевой кислоты

GCN:

Наночастицы хитозана, содержащие GEN

GEN:

Геништейн