Демонстрация гибкого биосенсора на основе графена для чувствительного и быстрого обнаружения клеток рака яичников

Введение

Рак яичников является вторым по распространенности гинекологическим раком и имеет самую высокую смертность среди гинекологических видов рака [1, 2]. До сих пор пациенты с раком яичников, как правило, диагностировались очень поздно из-за неспецифических симптомов рака яичников и отсутствия эффективных методов раннего скрининга. Визуализация в сочетании с углеводным антигеном CA125 может использоваться для обнаружения, диагностики рецидивов после хирургического вмешательства или химиотерапии. CA125 не является единственным точным маркером рака яичников, потому что на него влияет множество факторов, и он имеет высокую прогностическую ценность ложноположительных результатов. Чувствительность повышенного CA125 (> 35 Ед / мл), который мы использовали для диагностики рецидива рака яичников, составляет менее 70% [3]. Ультразвуковое исследование и радиологическое обследование также не обладают ни адекватной чувствительностью, ни специфичностью для раннего выявления и диагностики рецидивов. Пятилетняя выживаемость рака яичников на I и II стадии составляет 90% и 70% отдельно [4]. Несмотря на прогресс в хирургическом лечении и адъювантной терапии, 5-летняя выживаемость рака яичников на поздней стадии составляет менее 30% [4]. Раннее выявление рака яичников связано с очевидной более высокой 5-летней выживаемостью, и ранняя диагностика рецидива также важна. Сообщалось о нескольких новых подходах, таких как аутоантитела к TP53, анализы метилирования ДНК, алгоритмы микроРНК, Пап-подобный цитологический анализ для повышения чувствительности раннего выявления рака яичников [5]. Тем не менее, срочно, но все еще сложно разработать новый метод обнаружения с более высокой чувствительностью для всех стадий рака яичников.

Недавно исследователи обнаружили, что опухоли на ранних стадиях могут попадать в раковые клетки в кровоток и вызывать метастазы [6]. Клетки попадают в периферический кровоток через интравазу из первичных опухолей, рецидивов или метастазов, называемых циркулирующими опухолевыми клетками, которые могут использоваться в качестве диагностических или прогностических биомаркеров солидных опухолей [7]. ЦКО редко встречаются в периферической крови, и методы обнаружения требуют высокой чувствительности и специфичности. В последние годы для обнаружения ЦОК сообщалось об иммуномагнитном разделении, микрофлюидном разделении, методах на основе фильтров и лиганд-ориентированной ПЦР [8,9,10,11]. На сегодняшний день система поиска клеток компании Janssen Diagnostics является единственным одобренным Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA) методом обнаружения ЦКО, который может использоваться для мониторинга пациентов с метастатическим раком молочной железы, колоректального рака и рака простаты [12,13,14]. Обнаружение ЦОК при раке яичников представляет собой неинвазивный метод диагностики и дает преимущество, когда биопсия затруднена. Однако уровень обнаружения ЦКО на ранней стадии рака яичников все еще невысок. Все еще необходимы новые методы обнаружения ЦОК с более высокой чувствительностью. Если мы сможем легко обнаружить ЦОК у пациентов с раком яичников, это может быть полезно как для раннего обнаружения опухоли, так и для контроля рецидива и лечебного эффекта.

Графен, двумерный полупроводник, был выделен Андре Геймом и Костя Новоселовым в 2004 году [15]. В последнее время графеноподобные 2D-материалы широко применяются в зондировании и биологическом зондировании, преобразовании и хранении энергии, катализе, создании композитов и покрытий, электронике и биомедицине [15]. Графеновый сенсор является многообещающим кандидатом для обнаружения биомаркеров рака благодаря своей уникальной структуре и превосходным электрическим характеристикам, который был разработан для обнаружения карциноэмбрионального антигена, специфического антигена простаты, углеводного антигена 19–9 и 15–3 [16,17,18,19 ]. По сравнению с обычными биосенсорами на основе графена, изготовленными на жестком SiO ₂ / Si-подложки, полученные с помощью традиционной фотолитографии, испарения электродов, снятия и сборки сенсоров с использованием ценных средств, важно разработать недорогой и простой подход к изготовлению гибких биосенсоров на основе графена с высокой чувствительностью и быстрой скоростью обнаружения.

Для решения таких проблем в настоящем документе мы разрабатываем новый и простой подход к созданию гибкого биосенсора на основе графена на подложке из ПЭТ. Два электрода были непосредственно изготовлены на графене / ПЭТ с использованием серебряной пасты, а пул ячеек был непосредственно сконструирован с использованием силиконового геля; Этот гибкий биосенсор можно изготавливать вручную в любых лабораториях без необходимости фотолитографии и дорогостоящих средств. Удивительно, но наши гибкие биосенсоры на основе графена демонстрируют высокую чувствительность и могут быстро обнаруживать раковые клетки яичников. Насколько нам известно, пока нет сообщений о гибких биосенсорах на основе графена для обнаружения раковых клеток яичников.

Материалы и методы

Рост и перенос графеновой пленки

В данной работе графеновая пленка была выращена на поверхности Cu-фольги (Alfa Aesar, № 13382) методом химического осаждения из газовой фазы (CVD) [20]. Сначала поверхностный оксид медной фольги удаляли 20% -ным раствором соляной кислоты в течение 5 мин; затем медную фольгу несколько раз очищали деионизированной водой, а затем сушили в токе азота. Очищенную медную фольгу помещали в кварцевую лодочку и помещали в кварцевую трубку печи CVD. Камера печи была откачана до 1 × 10 ^–2 Па. Температура печи была увеличена до 1000 ° C в течение 20 минут с использованием 50 sccm 99,999% H ₂ . , а затем 50 sccm метана 99.999% было введено в трубку для роста пленки графена большой площади в течение 20 мин. Наконец, печь CVD охлаждали до комнатной температуры с помощью CH ₄ . / H ₂ расход газа.

Фольга графен / медь большой площади разрезалась на множество желаемых кусочков. Затем ПММА наносили центрифугированием на поверхность графен / медной фольги, образуя сэндвич-подобную структуру ПММА / графен / Cu. Впоследствии нижележащая медная фольга была протравлена ​​1 M FeCl ₃ . решение. ПММА / графен очищали в деионизированной воде в течение 30 мин, а затем переносили на подложку из ПЭТ. Наконец, PMMA был удален ацетоном, и был получен образец графена / ПЭТ.

Изготовление биосенсоров на основе графена

Процедура изготовления биосенсоров на основе графена описывается следующим образом. Сначала графеновая пленка размером примерно 1 см × 2 см на медной фольге была перенесена на подложку из ПЭТФ размером 1 см × 2 см методом влажного переноса с использованием ПММА. Затем были изготовлены два электрода около центра пленки графен / ПЭТ с использованием серебряной пасты. Наконец, чтобы проверить электрический отклик раствора раковых клеток, пул клеток с длиной и шириной в несколько миллиметров и высотой около 1 мм был построен из силиконового геля на краю электрода. После того, как силиконовый гель пула клеток полностью затвердеет, можно использовать полупроводниковый анализатор Agilent 4155B, чтобы проверить, может ли графеновый биосенсор нормально работать.

Культура раковых клеток яичников SKOV3

Серия клеток рака яичников SKOV3 (предоставлена ​​общественной лабораторией Второй аффилированной больницы Западного Китая) культивировалась в полной среде RPMI-1640 (Transgene, Франция), содержащей 10% телячьей сыворотки (MRC, США) при условии 5% CO. ₂ и 37 ° С.

Подготовка раствора клетки и электрические измерения

Раковые клетки разбавляли до определенной концентрации средой для культивирования клеток. Отнесите 50 мкл раствора клеток с помощью пипетки в канавку для измерения. Электрический сигнал регистрировался полупроводниковым анализатором Agilent 4155B.

Результаты и обсуждение

Фотография 10 × 10 см ² Графеновая пленка большой площади, выращенная методом CVD на медной фольге, показана на рис. 1а. Из рис. 1а видно, что по сравнению с чистой медной фольгой яркого металлического цвета цвет графен / медь немного темнее. Соответствующий рамановский спектр графена / Cu показан на рис. 1б. Как показано на рис. 1b, пики комбинационного рассеяния при 1580 см ⁻¹ и 2680 см ⁻¹ соответствуют G- и 2D-пикам графеновой пленки. Чтобы дополнительно проверить качество графеновой пленки, мы измерили рамановский спектр однослойной графеновой пленки, перенесенной на SiO ₂ / Si, как показано на рис. 1в. Можно заметить, что соотношение между I _G и я _2D меньше 0,5, что подтверждает монослойность графена; можно также заметить, что пик D очень низкий и почти не наблюдается, что говорит о том, что качество графеновой пленки очень высокое, а дефектов очень мало.

а Фотография голой медной фольги (левая панель) и графена, выращенного на медной фольге (правая панель), b Рамановский спектр графена / Cu и c Рамановский спектр графена / SiO ₂ / Si

Фотографии гибких графеновых биосенсоров на подложках из ПЭТ показаны на рис. 2. Раствор раковых клеток может быть добавлен в пул клеток, а электрический сигнал графенового биосенсора может быть получен с двух электродов из серебряной пасты. Измеряли электрический отклик для среды для культивирования клеток и раствора ЦКО.

Фотография биосенсора графен / ПЭТ

Временная зависимость отклика по току для таких жидкостей регистрируется при фиксированном напряжении 0,01 В до и после помещения их в пул ячеек. Как показано на рис. 3, можно заметить, что перед погружением такой жидкости ток остается постоянным; когда такие жидкости помещаются в пул ячеек, сила тока быстро уменьшается, а затем медленно сохраняется новый баланс. Ответ определяется как η =( Я ₀ - Я ) / Я ₀ * 100%, где I ₀ - сила тока непосредственно перед погружением в жидкость, а I - максимальное (или минимальное) значение после некоторого погружения в жидкость. Видно, что после нанесения таких жидкостей сопротивление графема возрастает. Электрический отклик для чистой среды для культивирования клеток и раствора ЦОК до и после погружения в раствор 200 с составляет 2,96% и 37,04% соответственно. Очевидно, что по сравнению с чистой средой для культивирования клеток, электрический ответ для раствора ЦКО даже при 30 клетках / мл очень значителен, что позволяет предположить, что гибкий биосенсор на основе графена очень чувствителен для обнаружения раковых клеток.

а Электрический отклик для среды для культивирования голых клеток и b раковый раствор с 30 клетками

Зависимость от времени электрического сигнала для чистой среды для культивирования клеток и раствора ЦОК с 30 раковыми клетками / мл дополнительно анализируется на рис. 3. Как показано на рис. ответ на раствор ЦКО (даже 30 клеток / мл) очень чувствительный и быстрый. После погружения в раствор клеток требуется всего 2,1, 2,0, 4,5, 7,5, 10,5, 28,5 с, чтобы достичь отклика 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, в то время как отклик соответствующей культуры клеток средний только увеличивается с 0,15 до 1,3%. Это означает, что гибкий графеновый биосенсор очень подходит для быстрого и чувствительного обнаружения в течение 5 секунд.

Зависимость электрического ответа от времени для среды для культивирования клеток и раствора ЦКО

Мы дополнительно исследовали электрический ответ для двух видов раковых клеток CTC (клетки SUDHL8 и клетки OCILYS) с одинаковыми концентрациями 10 000 (10 K) / мл. Как показано на рис. 5, временная зависимость тока для двух разных раковых клеток с немного различающейся тенденцией и большой разницей в электрическом ответе. Это означает, что графеновый биосенсор многообещающе будет использоваться для идентификации различных раковых клеток.

Зависимость электрического ответа от времени для различных раковых клеток: a SUDHL8 и b OCILYS

Также была исследована зависимость от времени электрического тока и ответа для раствора раковых клеток SUDHL 8 с различными концентрациями клеток 10 000 (10 К) / мл и 100 К / мл. Как показано на рис. 6, можно наблюдать, что раствор с более низкой концентрацией раковых клеток показывает более высокий ток, что говорит о том, что раковые клетки имеют тенденцию быть изолирующими, а многие другие клетки не являются проводящими. Временная зависимость отклика для двух растворов с концентрацией показывает аналогичные тенденции изменения, а отклик для раствора с более низкой концентрацией немного выше, чем для раствора с более высокой концентрацией. Эти результаты показывают, что биосенсор можно использовать для идентификации раковых растворов с различными концентрациями.

Зависимость электрического тока от времени ( a ) и ответ ( b ) для раковых клеток SUDHL8 с различными концентрациями 10 К и 100 К клеток / мл

Как упоминалось выше, результаты показывают, что дешевый и гибкий биосенсор на основе графена демонстрирует различную реакцию на среду для культивирования клеток и раствор рака, различные раковые клетки и раствор раковых клеток с разными концентрациями, что предполагает, что такой гибкий биосенсор на основе графена является многообещающим. используется для обнаружения и идентификации ЦОК раковых клеток яичников.

Заключение

Чтобы разработать эффективный метод раннего обнаружения, в частности, рака яичников, мы разрабатываем очень простой гибкий биосенсор на основе графена на подложке из ПЭТ. Этот гибкий биосенсор состоит из пула клеток и двух электродов и сравнивает электрический сигнал до и после добавления раствора клеток, что показывает высокую чувствительность и быструю скорость обнаружения. Он показывает очевидные разные ответы на среду для культивирования клеток и раствор раковых клеток, различные раковые клетки и раствор раковых клеток с разными концентрациями. Наша работа показывает, что гибкий биосенсор на основе графена многообещающе для использования для чувствительного и быстрого обнаружения / идентификации клеток рака яичника ЦОК.

Доступность данных и материалов

Авторы могут подтвердить, что все соответствующие данные включены в статью и файлы с дополнительной информацией к ней.

Сокращения

CA:

Углеводный антиген

CTC:

Циркулирующая опухолевая клетка

ПЭТ:

Полиэтилентерефталат

FDA:

Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов

CVD:

Химическое осаждение из паровой фазы