In situ электроспиннинг нановолокон куркумина: двойное антибактериальное действие для стерилизации резистентных бактерий

Аннотация

Бактериальная инфекция, особенно вызванная мультирезистентными бактериями, по-прежнему угрожает человеческой жизни. Фотординамическая терапия (PDT) может эффективно убивать бактерии, и нановолоконная PDT может эффективно снижать повреждение нормальных тканей. Однако текущие фотосенсибизаторы, покрытые на поверхности волокон, высвобождаются в рану, вызывая некоторые побочные эффекты. И нановолокна, приготовленные традиционным методом, демонстрируют плохую адгезию на ране, что сильно снижает эффект PDT из-за его короткодействующего эффекта. Здесь ядерно-оболочечные композитные нановолокна куркумина готовят методом in situ электроспиннинга через самодельное переносимое электроспиннинговое устройство. Полученные композитные нановолокна показывают превосходную адгезивность на разных биологических поверхностях по сравнению с традиционным методом приготовления. Под облучением 808 нм эти композитные нановолокна эффективно производят одиночный кислород (¹O₂) без отшествия куркумина. После воздействия этих композитных нановолокон на резистентные бактерии они демонстрируют двойное антибактериальное поведение и эффективно убивают резистентные бактерии. Эти нановолоконные мембраны с двойным антибактериальным действием и отличной адгезивностью могут способствовать применению инфекции ран как антибактериальные перевязки.

Фон

Бактериальная инфекция без своевременного лечения вызовет сепсис, и сепсис тем самым серьезно угрожает жизни и здоровью [1–3]. Хотя антибиотики могут убивать бактерии, длительное использование антибиотиков приведет к развитию резистентных бактерий, таких как метициллин-резистентный стафилококк ауреус (MRSA) [4–6]. MRSA, как вид мультирезистентных бактерий, является одной из распространенных бактерий, вызывающих инфекцию ран [7]. В этой ситуации необходимо найти стратегии безопасного убийства бактерий без развития резистентности. Уже доказано, что фотординамическая терапия (PDT) — эффективный метод стерилизации [8–11]. Однако большинство фотосенсибизаторов для PDT требуют ультрафиолетового света или коротковолнового возбуждения [12, 13]. Поскольку глубина проникновения света в организме зависит от длины волны, глубина проникновения ультрафиолетового и видимого света неглубокая, в то время как глубина проникновения ближнего инфракрасного (NIR) света относительно глубока. Что хуже, ультрафиолетовый и коротковолновой свет серьезно обжигают человеческие ткани. Для достижения безопасных и антибактериальных лечений в глубоких тканях разработка фотосенсибизаторов, возбуждаемых NIR светом, является потребностью и трендом. Наночастицы апконверсии (UCNPs) могут конвертировать NIR свет в коротковолновой [14, 15]. Благодаря этому свойству фотосенсибизаторы можно спроектировать для комбинирования с апконверсией для достижения NIR возбуждения. UCNPs используются как станция преобразования длины волны, конвертирующая NIR свет в коротковолновой для возбуждения фотосенсибизаторов и производства одиночного кислорода (¹O₂) [16–19]. Однако предыдущие исследования в основном касались приготовления структуры наночастиц с покрытыми фотосенсибизаторами. Фотосенсибизаторы, обнаженные на внешнем слое наночастиц, легко отшествуют [20, 21], и это также имеет некоторые побочные эффекты на биологические ткани из-за прямого контакта, такие как ингибирование роста тканевого коллагена [22, 23]. Фактически, фотосенсибизаторы могут достигать стерилизации благодаря производству одиночного кислорода, что означает, что нет необходимости в прямом контакте фотосенсибизаторов с бактериями или биологическими тканями. Поэтому мы можем спроектировать разделитель для отделения фотосенсибизаторов от биологических тканей, чтобы избежать возможных побочных эффектов.

Электроспиннинг — быстрый и эффективный метод приготовления нановолокон, включая органические и неорганические нановолокна [24–28]. В процессе приготовления нановолокон наночастицы легко комбинируются с волокнами для формирования композитных нановолокон. Существует два основных метода формирования композитных нановолокон. Один — легирование частиц внутри нановолокон [29], другой — загрузка частиц на поверхности нановолокон [30, 31]. Учитывая цель отделения фотосенсибизаторов от биологических тканей, включение фотосенсибизаторов в нановолокна более предпочтительно по сравнению с фотосенсибизаторами, загруженными на поверхности волокон, которые легко отшествуют. Однако если нановолокна гидрофобны и не могут инфильтроваться, одиночный кислород трудно производить и доставлять на поверхности волокон для достижения антибактериального свойства [32]. Но гидрофильные нановолокна легко растворяются при загрязнении интерстициальной жидкостью. Поэтому необходимо комбинировать NIR фотосенсибизаторы с нановолокнами и обеспечить, чтобы фотординамические нановолокна могли эффективно убивать бактерии, особенно резистентные бактерии.

В этом исследовании куркумин используется как фотосенсибизатор из-за его широких источников из растительных экстрактов. Ядерно-оболочечная наноструктура UCNPs используется как станция переноса длины волны и показывает высокую эффективность конверсии для производства ¹O₂. Композитные нановолокна UCNPs@Куркумин готовят методом in situ электроспиннинга через самодельное электроспиннинговое устройство. Адгезия композитных нановолокон, полученных этим методом, на разных биологических поверхностях лучше, чем традиционный метод электроспиннинга. Под облучением 808 нм эти композитные нановолокна могут эффективно производить ¹O₂ без отшествия куркумина. После загрязнения этими композитными нановолокнами резистентными бактериями MRSA они проявляют двойное антибактериальное поведение, эффективно убивая резистентные бактерии.

Методы

Материалы

Хлорид тулия, хлорид иттербия, хлорид неодима и хлорид иттрия закупали у Sigma-Aldrich. Метанол, этанол, циклогексан, куркумин, дихлорметан, ацетон, поливинилпирролидон (PVP), поликапролактон (PCL) и полиэтиленимин (PEI) купили у Sinopharm Chemical Reagents. Все материалы использовали без дополнительной очистки.

Синтез ядерно-оболочечных NaYF₄:Yb/Tm@NaYF₄:Nd@Куркумин

Наночастицы апконверсии (UCNPs) NaYF₄:Yb/Tm@NaYF₄:Nd синтезировали методами ко-осадления [33, 34]. После этого 200 мг приготовленных UCNPs, 90 мг PEI и 180 мг куркумина добавляли и растворяли в дихлорметане. Реагенты равномерно перемешивали 20 ч при комнатной температуре, полученные продукты очищали центрифугированием и вымывали дважды этанолом.

Приготовление композитных нановолокон куркумина через in situ электроспиннинг

1 г PCL, 0,16 г PVP и 0,1 г NaYF₄:Yb/Tm@NaYF₄:Nd@Куркумин добавляли в 5 мл ацетона. После 12 ч перемешивания получали однородный предшественник раствор для электроспиннинга. Беря 3 мл предшественника в 5-мл шприце, использовали самодельное ручное электроспиннинговое оборудование для электроспиннинга, состоящее из металлической иглы 0,4 мм диаметром, двух щелочных батареек и высоковольтного преобразователя, который может конвертировать 3 В батареи в 10 кВ для электроспиннинга. Расстояние электроспиннинга между коллектором и иглой составляло около 10 см.

Детектирование формирования ¹O₂

Датчик одиночного кислорода зеленый (SOSG) использовали для детектирования формирования ¹O₂. Квадрат 9×9 мм приготовленной нанокомпозитной волокнистой мембраны с разной концентрацией UCNPs@Куркумин добавляли в кварцевую кювету, затем 3 мл метанола, содержащего 25 мкМ SOSG, добавляли. После этого кювету облучали под 808-нм лазером с разным временем облучения. Флуоресцентный спектрофотометр с длиной волны возбуждения 504 нм использовали для измерения флуоресцентной интенсивности этого раствора, отражающей уровень одиночного кислорода.

Антибактериальный анализ

Резистентные бактерии MRSA и Escherichia coli использовали для оценки антибактериальной способности. Кратко, бактериальные штаммы культивировали в триптично-соевой бульонной среде. Культурные среды с бактериальными штаммами инкубировали при 37 °C 15 ч. После культивирования концентрация бактериального штамма составляла 1×10⁶ КОЕ/мл. Всего 100 мкл бактериального раствора помещали в каждую ячейку 96-колодчатой пластины на стерильном ультрачистом столе. Затем кусок круговой волокнистой мембраны 6 мм диаметром добавляли в каждую ячейку 96-колодчатой пластины. После 20 мин облучения 808-нм лазером бактериальный раствор в пластине разбавляли 10 раз со стерильной водой. 10 мкл разбавленного раствора помещали в питательную агаровую пластину для получения равномерно покрытой агаровой пластины. Обработанную агаровую пластину культивировали в бактериальной инкубаторе постоянной температуры при 37 °C 18 ч, а затем фотографировали. В контрольной группе шаги были теми же, кроме того, что 808-нм лазерное облучение не использовалось. Каждая группа повторялась с 5 пластинами.

Характеризация

TEM и SEM изображения получали на электронных микроскопах JEM-2010 и SU-1510. Флуоресцентный спектр измеряли на флуоресцентном спектрофотометре Edinburgh FLS1000. Абсорбционный спектр записывали на спектрометре Shimadzu UV2550. Фурье-преобразование инфракрасной спектроскопии брали на спектрометре Nicolet iS50. дзета-потенциал измеряли анализатором WJL-608. Гидрофильность сидячей капли тестировали оборудованием PT-602Atest.

Результаты и обсуждение

Характеризация наночастиц и композитных нановолокон

Рис. 1a показывает TEM изображение наночастиц NaYF₄:Yb/Tm@NaYF₄:Nd (UCNPs). Оно демонстрирует равномерное распределение размера UCNPs со средним диаметром около 45 нм. дзета-потенциал этих наночастиц дополнительно тестировали как +19 мВ (доп. файл 1: рис. S1). После покрытия UCNPs куркумином, рис. 1b показывает ядерно-оболочечную структуру и толщину оболочки куркумина около 5 нм. После этого эти ядерно-оболочечные наночастицы куркумина встраивали в PCL/PVP волокна. Рис. 1c показывает SEM изображение этих композитных нановолокон, приготовленных самодельным ручным электроспиннинговым устройством. Диаметр непрерывных и неразрывных нановолокон, приготовленных этим устройством, составляет около 400 нм, а однородность волокна похожа на традиционные электроспиннинговые устройства (доп. файл 1: рис. S2). Следует отметить, что это переносимое электроспиннинговое устройство может работать от двух сухих батареек 1,5 В (доп. файл 1: рис. S3), что устраняет ограничение использования городской электросети. В сочетании с его другими преимуществами легкого веса (160 г) и малого размера, это будет полезно для использования на открытом воздухе. Рис. 1d показывает TEM изображение этих композитных нановолокон, указывая на то, что наночастицы имеют хорошую дисперсию в нановолокнах.

Причина покрытия оболочки NaYF₄:Nd на ядре NaYF₄:Yb/Tm заключалась в том, что это может усилить фоtolюминесценцию (рис. 2a). Поскольку флуоресцентные спектры UCNPs хорошо перекрывались с UV-Vis абсорбционными спектрами куркумина (рис. 2b), это означало, что более сильная фоtolюминесценция UCNPs может передать больше энергии куркумину, что способствовало возбуждению фотосенсибизаторов. Кроме того, учитывая, что NIR свет с длиной волны 808 нм проникает глубже в живую ткань, чем NIR свет с длиной волны 980 нм, введение этой оболочки NaYF₄:Nd может модулировать длину волны возбуждения с 980 на 808 нм (доп. файл 1: рис. S4), тем самым снижая нежелательные ожоги нормальной ткани. FTIR измерения дополнительно проводили. Как видно на рис. 2c, растягивающие вибрации C=O при 1628 см⁻¹, C-O при 1282 см⁻¹ и C-O-C при 1028 см⁻¹ наблюдаются в нанокомпозитных частицах (оранжевая линия), которые происходят от куркумина (зеленая линия). В то же время есть растягивающая вибрация C-N при 1125 см⁻¹, которая исходит от PEI (синяя линия). Их молекулярные структурные диаграммы иллюстрированы в приложении (доп. файл 1: рис. S5). Более того, есть слабый C=C примерно при 1660 см⁻¹, который соответствует олеиновой кислоте в тот же момент синтеза UCNPs. Это может демонстрировать компоненты UCNPs@Куркумин композитных нановолокон.

Рис. 2d демонстрирует кривые затухания флуоресценции UCNPs до и после покрытия куркумином. Показывает, что время жизни флуоресценции UCNPs уменьшилось с 700 до 390 мкс после покрытия оболочками куркумина. На основе γ = 1 - τ₂/τ₁, где τ₂ и τ₁ — время жизни UCNPs до и после оболочки куркумина, γ — эффективность переноса энергии [35]. Таким образом, γ рассчитана как 44,3%. Такая высокая эффективность переноса энергии получена, что с первого аспекта было из-за хорошего перекрытия между абсорбционными спектрами куркумина и фоtolюминесцентными спектрами UCNPs (рис. 2b), так что нерадиативный перенос энергии может происходить между ними. Второй аспект — UCNPs имели оболочку NaYF₄:Nd, усиливающую интенсивность флуоресценции, тем самым увеличивая их интегральную площадь спектрального перекрытия. Третий аспект — расстояние между куркумином и UCNPs было толщиной покрытия (<5 нм), и это маленькое расствие способствовало генерации высокоэффективного флуоресцентного резонанса переноса энергии (FRET). Метод FRET может получить до 44,3% эффективности переноса энергии, что также может способствовать последующему эффективному производству ¹O₂.

Производство ¹O₂ из композитных нановолокон

Для оценки способности нанокомпозитных волокон производить ¹O₂ использовали метод SOSG. Сначала мы взяли нанокомпозитные волокна с фиксированной концентрацией легирования и наблюдали генерацию ¹O₂ под разным временем облучения. Как показано на рис. 3a, для фиксированной концентрации, такой как 0,20 масс.%, время облучения является одним из факторов, влияющих на генерацию ¹O₂. Чем дольше время облучения, тем больше ¹O₂ производилось. Однако это также показывает, что хотя концентрация ¹O₂ постепенно увеличивается с увеличением времени облучения, скорость роста постепенно замедляется и почти остается постоянной после 20 мин, что проявляется плотным интервалом кривой. Это явление может быть связано с быстрым локальным потреблением кислорода производством ¹O₂ при устойчивом NIR облучении, результатом чего является относительно низкий уровень кислорода в локальной области, и таким образом снижается скорость роста производства ¹O₂.

Для наблюдения влияния концентрации легирования на производство ¹O₂, рис. 3b дополнительно изображен. Как показано на рис. 3b, для фиксированного времени облучения, такого как 20 мин, с увеличением концентрации легирования больше ¹O₂ производилось. Однако скорость роста ¹O₂ замедлялась, когда концентрация была больше 0,20 масс.%. Эти экспериментальные результаты предполагают, что нет необходимости бесконечно увеличивать время облучения и концентрацию легирования для производства большего ¹O₂. Оптимальный выбор — 0,20 масс.% с 20 мин и поэтому в следующих экспериментах возьмут эту концентрацию и время облучения.

Смоляемость и адгезивность in situ электроспинненой нановолоконной мембраны

Учитывая, что производство ¹O₂ — процесс, требующий взаимодействия наночастиц UCNPs@Куркумина в волокнах с кислородом в телесной жидкости, контактный угол этой волокнистой мембраны дополнительно тестировали. Рис. 4a показывает каплю воды, упавшую на поверхность этой композитной нановолоконной мембраны и ее смачиваемость через 20 с. По сравнению с чистой PCL нановолоконной мембраной (рис. 4b), композитная нановолоконная мембрана имеет лучшую смачиваемость. Интересно, после замачивания композитной нановолоконной мембраны в фосфатно-буферном растворе (PBS), в PBS не детектировалось UCNPs@Куркумин абсорбционным спектрометром, что означает, что куркумин не отшествовал из волокон. Причина может быть в том, что куркумин был покрыт на UCNPs, поэтому размер UCNPs@Куркумина (~50 нм) был слишком велик для проникновения через волокно. По сравнению с методами фотосенсибизаторов, покрытых на частицах или волокнах, увеличение размера куркумина сначала и затем легирование его в смачиваемые волокна может эффективно избежать отшествия фотосенсибизаторов и усилить генерацию и диффузию ¹O₂. Кроме того, учитывая короткодействующий эффект PDT и плохую адгезию волокнистой мембраны, приготовленной традиционным методом электроспиннинга, к поверхности раны (рис. 4c; доп. файл 1: рис. S6), фотординамический эффект был бы затронут из-за интервала между волокнистой мембраной и поверхностью. К счастью, эти композитные нановолокна куркумина могли быть приготовлены методом in situ электроспиннинга с хорошей морфологией (рис. 1c) и также демонстрировали хорошую адгезивность на разных поверхностях объектов (рис. 4d). Это означает, что метод in situ электроспиннингового осаждения для приготовления фотординамической волокнистой мембраны более предпочтителен, чем традиционный метод спиннинга, при котором волокнистая мембрана собирается на фольге, а затем прижимается к поверхности раны.

Двойное антибактериальное действие композитных нановолокон куркумина

Нанокомпозитные волокна, приготовленные устройством, доказаны нетоксичными MTT анализом (доп. файл 1: рис. S7). Дальше, для доказательства того, что волокна имеют хорошие антибактериальные свойства, использовали метод подсчета для оценки антибактериальных свойств композитных нановолокон. Как показано на рис. 5,无论是否照射808-nm光 на чистые волокна, нет антибактериального свойства (рис. 5a, b). Эти результаты показывают, что 808-нм свет сам по себе не имеет бактерицидного эффекта. Когда волокна легированы UCNPs, бактерии не уменьшаются, что подтверждает, что UCNPs не имеют бактерицидного эффекта (рис. 5a′, b′). Интересно, когда волокна легированы куркумином, число бактерий уменьшается до определенной степени, что доказывает, что куркумин сам по себе показывает определенную антибактериальную активность (рис. 5c, c′). Более того, явный бактерицидный результат произошел в волокнах, легированных UCNPs@Куркумин под NIR облучением (рис. 5d′, e′). В сочетании с результатами рис. 3, эти бактерицидные результаты указывают на то, что ¹O₂, произведенный из UCNPs@Куркумин под 808-нм облучением, мог эффективно убивать бактерии. С другой стороны, антибактериальная активность куркумина была одинаковой при наличии и отсутствии 808-нм облучения, потому что абсорбция куркумина была в видимом диапазоне (рис. 2b), поэтому 808-нм свет не был эффективен. Это также была причина, почему куркумин спроектировали для покрытия поверхности UCNPs. Кроме того, рис. 5d, e показывает волокна, легированные UCNPs@Куркумин при 0,15 масс.% и 0,20 масс.% соответственно. Сравнением обнаруживается, что группа 0,20 масс.% демонстрировала лучшие бактерицидные свойства при 20 мин облучения, и антибактериальный эффект достиг 95%. Это потому, что ¹O₂, произведенный фотосенсибизатором куркумина в фотординамическом эффекте, может убивать резистентные бактерии. Этот результат также согласуется с результатом ¹O₂ на рис. 3. Эти данные дополнительно указывают на то, что волокна, легированные UCNPs@Куркумин, могут убивать MRSA благодаря его двойной антибактериальной активности, а именно волокна, легированные UCNPs@Куркумин и PDT, и PDT имеет лучший антибактериальный эффект, чем волокна, легированные UCNPs@Куркумин. Кроме того, мы также проводили эксперименты с Escherichia coli, которые также подтвердили, что in situ электроспинненые композитные нановолокна куркумина имеют двойные антибактериальные эффекты на резистентные бактерии (доп. файл 1: рис. S8). И противовоспалительный эффект нановолокон дополнительно верифицировался H&E окраской MRSA (доп. файл 1: рис. S9). После разных лечений инфекции раны, большое количество нейтрофилов собиралось в группе без нанокомпозитных волокон, которые были фиолетовыми и синими кластерами клеток из-за повреждения тканей и гнойной инфекции. Однако небольшое количество грануляционной ткани и красных кровяных телец появлялось в группе нановолокон, что косвенно отражало антибактериальные свойства нанокомпозитных волокон. Оно имеет блокирующий эффект на воспаление инфекции раны.

Заключение

В заключение, ядерно-оболочечные композитные нановолокна куркумина приготовлены методом in situ электроспиннинга через самодельное переносимое электроспиннинговое устройство. Полученные композитные нановолокна показывают превосходную адгезивность на разных биологических поверхностях по сравнению с традиционным методом приготовления. Метод, сначала увеличивающий размер куркумина, а затем легирующий его в смачиваемое волокно, может эффективно избежать отшещения фотосенсибизаторов, тем самым усиливая производство ¹O₂ и его диффузию, что может дать вдохновение для проектирования других фотординамических наноматериалов. После загрязнения этими композитными нановолокнами резистентными бактериями они демонстрируют двойное антибактериальное поведение и эффективно убивают резистентные бактерии. Эти нановолоконные мембраны с двойным антибактериальным действием имеют отличную адгезивность и могут использоваться как антибактериальные перевязки в сочетании с гемостазом, тем самым обеспечивая наружный гемостаз.