Двойной антибактериальный эффект композитных нановолокон на основе электроспрядения куркумина для стерилизации устойчивых к лекарствам бактерий

Фон

Бактериальная инфекция без своевременного лечения вызывает сепсис, и, таким образом, сепсис серьезно угрожает жизни и здоровью [1,2,3]. Хотя антибиотик может убивать бактерии, использование антибиотика в долгосрочной перспективе приведет к развитию устойчивых к лекарствам бактерий, таких как метициллин-устойчивый золотистый стафилококк (MRSA) [4,5,6]. MRSA, как разновидность бактерий с множественной лекарственной устойчивостью, является одной из распространенных бактерий, вызывающих раневую инфекцию [7]. В этой ситуации необходимо найти стратегии безопасного уничтожения бактерий без развития резистентности. Уже доказано, что фотодинамическая терапия (ФДТ) является эффективным методом стерилизации [8,9,10,11]. Однако для большинства фотосенсибилизаторов для ФДТ требуется ультрафиолетовое или коротковолновое возбуждение [12, 13]. Поскольку глубина проникновения света в организм зависит от длины волны, глубина проникновения ультрафиолетового и видимого света мала, в то время как глубина проникновения света ближнего инфракрасного диапазона (БИК) относительно велика. Что еще хуже, ультрафиолетовый и коротковолновый свет могут серьезно обжечь ткани человека. Для обеспечения безопасного и антибактериального лечения глубоких тканей разработка фотосенсибилизаторов, возбуждаемых NIR-светом, является спросом и тенденцией. Наночастицы с апконверсией (UCNP) могут преобразовывать ближний ИК-свет в коротковолновый [14, 15]. Благодаря этому свойству фотосенсибилизаторы могут быть разработаны для объединения с повышающим преобразованием для достижения возбуждения в ближней инфракрасной области спектра. UCNP используются в качестве станции преобразования длины волны, которая преобразует ближний ИК-свет в коротковолновую, чтобы возбуждать фотосенсибилизаторы и производить синглетный кислород ( ¹ О ₂ ) [16,17,18,19]. Тем не менее, предыдущие исследования больше всего посвящены приготовлению фотосенсибилизаторов с покрытой структурой наночастиц. Фотосенсибилизаторы, обнаженные на внешнем слое наночастиц, легко выпадают [20, 21], а также имеют некоторые побочные эффекты на биологические ткани из-за прямого контакта, такие как ингибирование роста тканевого коллагена [22, 23]. Фактически, фотосенсибилизаторы могут достичь стерилизации за счет выработки синглетного кислорода, а это означает, что фотосенсибилизаторам нет необходимости в прямом контакте с бактериями или биологическими тканями. Поэтому мы можем разработать спейсер для отделения фотосенсибилизаторов от биологических тканей, чтобы избежать возможных побочных эффектов.

Электропрядение - это быстрый и эффективный метод получения нановолокон, включая органические и неорганические нановолокна [24,25,26,27,28]. В процессе изготовления нановолокна наночастицы легко объединяются с волокнами для образования композитных нановолокон. В основном существует два метода формирования композитных нановолокон. Один из них - легирование частиц внутри нановолокон [29], а другой - загрузка частиц на поверхность нановолокон [30, 31]. С учетом цели отделения фотосенсибилизаторов от биологических тканей включение фотосенсибилизаторов в нановолокна более предпочтительно по сравнению с фотосенсибилизаторами, нанесенными на поверхности волокон, которые легко отваливаются. Однако, если нановолокна являются гидрофобными и не могут проникать внутрь, синглетный кислород трудно производить и доставлять на поверхности волокон, достигая антибактериальных свойств [32]. Но гидрофильные нановолокна легко растворяются при загрязнении интерстициальной жидкостью. Следовательно, необходимо комбинировать NIR-фотосенсибилизаторы с нановолокнами и гарантировать, что фотодинамические нановолокна могут эффективно убивать бактерии, особенно бактерии, устойчивые к лекарствам.

В этом исследовании куркумин используется в качестве фотосенсибилизатора из-за его обширных источников из экстрактов организма. Наноструктура ядро-оболочка UCNP используется в качестве станции передачи длины волны, и она показывает высокую эффективность преобразования для получения ¹ О ₂ . Композитные нановолокна UCNPs @ Curcumin получают методом электроспиннинга in situ на самодельном устройстве для электропрядения. Адгезия композитных нановолокон, полученных этим методом, к различным биологическим поверхностям лучше, чем при традиционном методе подготовки методом электроспиннинга. При облучении 808 нм эти композитные нановолокна могут эффективно производить ¹ О ₂ без отвала куркумина. После того, как эти композитные нановолокна загрязнены лекарственно-устойчивыми бактериями MRSA, у них будет проявляться двойное антибактериальное поведение, которое эффективно убивает лекарственно-устойчивые бактерии.

Методы

Материалы

Хлорид тулия, хлорид иттербия, хлорид неодима и хлорид иттрия были приобретены у Sigma-Aldrich. Метанол, этанол, циклогексан, куркумин, дихлорметан, ацетон, поливинилпирролидон (PVP), поликапролактон (PCL) и полиэтиленимин (PEI) были закуплены у Sinopharm Chemical Reagents. Все материалы были использованы без дополнительной очистки.

Синтез NaYF Core – Shell ₄ :Yb / Tm @ NaYF ₄ :Nd @ Куркумин

Повышающее преобразование наночастиц (НЧЧ) NaYF ₄ :Yb / Tm @ NaYF ₄ :Nd были синтезированы методами соосаждения [33, 34]. После этого добавляли 200 мг свежеприготовленных UCNP, 90 мг PEI и 180 мг куркумина и растворяли в метилендихлориде. Реагенты равномерно перемешивали в течение 20 ч при комнатной температуре, полученные продукты очищали центрифугированием и дважды промывали этанолом.

Подготовка композитных нановолокон из куркумина с помощью электропрядения in situ

Один грамм PCL, 0,16 г PVP и 0,1 г NaYF ₄ :Yb / Tm @ NaYF ₄ :Nd @ Куркумин добавляли в 5 мл ацетона. После 12 ч перемешивания получали гомогенный раствор предшественника для электроспиннинга. Взяв 3 мл раствора прекурсора в 5-мл шприц, для электроспиннинга использовали самодельное ручное оборудование для электропрядения, которое состоит из металлической иглы диаметром 0,4 мм, двух щелочных батарей и высоковольтного преобразователя, способного преобразовывать Аккумулятор 3 В до 10 кВ для электроспиннинга. Расстояние для электропрядения между коллектором и иглой для электропрядения составляло около 10 см.

Обнаружение ¹ О ₂ Формирование

Датчик синглетного кислорода зеленого цвета (SOSG) был использован для обнаружения ¹ О ₂ формирование. Квадрат 9 × 9 мм свежеприготовленной мембраны из нанокомпозитного волокна с различной концентрацией УНЧ @ Куркумин добавляли в кварцевую кювету, а затем добавляли 3 мл метанола, содержащего 25 мкМ SOSG. После этого кювета облучалась лазером с длиной волны 808 нм с разной продолжительностью облучения. Флуоресцентный спектрофотометр с длиной волны возбуждения 504 нм использовался для измерения интенсивности флуоресценции этого раствора, которая отражает уровень синглетного кислорода.

Антибактериальный анализ

Для оценки антибактериальной способности использовали устойчивые к лекарствам бактерии MRSA и Escherichia coli. Вкратце, бактериальные штаммы культивировали в среде триптического соевого бульона. Питательные среды, содержащие штаммы бактерий, инкубировали при 37 ° C в течение 15 часов. После культивирования концентрация бактериального штамма составляла 1 × 10 ⁶ КОЕ / мл. Всего 100 мкл бактериального раствора помещали в каждую лунку 96-луночного планшета стерильного сверхчистого стола. Затем кусочек круглой волоконной мембраны диаметром 6 мм добавляли в каждую лунку 96-луночного планшета. После 20 мин облучения лазером с длиной волны 808 нм раствор бактерий в планшете разбавляли стерильной водой в 10 раз. 10 мкл разбавителя помещали в чашку с питательным агаром, чтобы получить равномерно покрытую чашку с агаром. Обработанную пластину с агаром культивировали в бактериальном инкубаторе с постоянной температурой при 37 ° C в течение 18 ч, а затем сделали фотографии. В контрольной группе этапы были такими же, как указано выше, за исключением того, что не использовалось облучение лазером с длиной волны 808 нм. Каждую группу повторяли с 5 чашками.

Характеристика

Изображения ПЭМ и СЭМ были получены с помощью электронных микроскопов JEM-2010 и SU-1510. Спектр флуоресценции измеряли на флуоресцентном спектрофотометре Edinburgh FLS1000. Спектр поглощения регистрировали на спектрометре Shimadzu UV2550. Инфракрасную спектроскопию с преобразованием Фурье проводили на спектрометре Nicolet iS50. Дзета-потенциал измеряли с помощью анализатора WJL-608. Гидрофильность методом лежащей капли проверена на приборе ПТ-602Атест.

Результаты и обсуждение

Характеристика наночастиц и композитных нановолокон

На рисунке 1а показано ПЭМ-изображение NaYF ₄ . :Yb / Tm @ NaYF ₄ :Наночастицы неодима (УНЧ). Он демонстрирует равномерное распределение УХНЧ по размерам со средним диаметром около 45 нм. Дзета-потенциал этих наночастиц был дополнительно протестирован и составил +19 мВ (файл дополнения 1:рис. S1). После того, как UCNPs были покрыты куркумином, на рис. 1b показана структура ядро-оболочка, а толщина оболочки куркумина составляет около 5 нм. После этого наночастицы куркумина ядро-оболочка были встроены в волокна PCL / PVP. На рис. 1с показано изображение этих композитных нановолокон, полученных с помощью сканирующего электронного микроскопа, с помощью портативного устройства электропрядения собственной разработки. Диаметр непрерывных нановолокон без трещин, полученных с помощью этого устройства, составляет около 400 нм, а однородность волокна аналогична таковой у традиционных устройств электропрядения (дополнительный файл 1:рис. S2). Следует отметить, что это портативное электропрядильное устройство может работать от двух сухих аккумуляторов на 1,5 В (файл дополнения 1:Рис. S3), что снимает ограничение на использование городского источника питания. В сочетании с другими преимуществами легкого веса (160 г) и небольшого размера он будет полезен для использования на открытом воздухе. На рис. 1d показано изображение этих композитных нановолокон, полученное методом просвечивающей электронной микроскопии, что свидетельствует о хорошей диспергируемости наночастиц в нановолокнах.

TEM-изображения a NaYF ₄ :Yb / Tm @ NaYF ₄ :Наночастицы неодима (УНЧ) и b УХНЧ со структурой ядро ​​– оболочка @ наночастицы куркумина. c СЭМ-изображение композитных нановолокон куркумина, d ПЭМ-изображение композитных нановолокон куркумина

Причина нанесения покрытия NaYF ₄ :Оболочка Nd на NaYF ₄ Ядро:Yb / Tm заключалось в том, что оно может усиливать фотолюминесценцию (рис. 2а). Поскольку спектры флуоресценции UCNPs хорошо перекрываются со спектрами поглощения UV-Vis куркумина (рис. 2b), это означает, что более сильная фотолюминесценция UCNPs может передавать больше энергии куркумину, что способствует возбуждению фотосенсибилизаторов. Кроме того, учитывая, что ближний ИК-свет с длиной волны 808 нм проникает в живую ткань глубже, чем ближний ИК-свет с длиной волны 980 нм, введение этого NaYF ₄ Оболочка:Nd может модулировать длину волны возбуждения от 980 до 808 нм (дополнительный файл 1:рис. S4), тем самым уменьшая нежелательные ожоги здоровых тканей. Далее было проведено измерение FTIR. Как видно из рис. 2в, валентные колебания C =O при 1628 см ⁻¹ , C – O на 1282 см ⁻¹ , и C – O – C при 1028 см ⁻¹ происходят в частицах нанокомпозита (оранжевая линия), которые происходят от куркумина (зеленая линия). Между тем, наблюдается растягивающее колебание C – N на уровне 1125 см ⁻¹ . , который исходит из PEI (синяя линия). Диаграммы их молекулярной структуры проиллюстрированы в приложении (дополнительный файл 1:рис. S5). Кроме того, имеется слабая C =C примерно на глубине 1660 см ⁻¹ . , что соответствует олеиновой кислоте одновременно с синтезом УНЧ. Он может продемонстрировать компоненты композитных нановолокон UCNPs @ Curcumin.

а Спектр флуоресценции ядро ​​– оболочка NaYF ₄ :Yb / Tm @ NaYF ₄ :Nd, возбужденный на 808 нм, b спектр флуоресценции УНЧ и спектр поглощения куркумина в УФ-видимой области, c FTIR-спектры UCNPs @ Куркумин, куркумин и PEI, d спектры флуоресценции с временным разрешением UCNPs и UCNPs @ Curcumin

На рисунке 2d показаны кривые ослабления флуоресценции UCNP до и после покрытия куркумином. Это показывает, что время жизни флуоресценции УХНЧ уменьшилось с 700 до 390 мкс после покрытия оболочкой куркумина. На основе γ =1 - τ ₂ / τ ₁ , где τ ₂ и τ ₁ - время жизни UCNP до и после куркумина, γ - эффективность передачи энергии [35]. Таким образом, γ было рассчитано 44,3%. Столь высокая эффективность передачи энергии была получена, что, по первому аспекту, было связано с хорошим перекрытием между спектрами поглощения куркумина и спектрами фотолюминесценции УХНЧ (рис. 2b), так что между ними может происходить безызлучательный перенос энергии. Второй аспект заключался в том, что UCNP имели NaYF ₄ :Nd, усиливающая интенсивность флуоресценции и увеличивающая интегральную площадь их спектрального перекрытия. Третий аспект заключался в том, что расстояние между куркумином и UCNP было толщиной покрытия (<5 нм), и это небольшое расстояние способствовало генерации высокоэффективной резонансной передачи энергии флуоресценции (FRET). Метод FRET может обеспечить КПД передачи энергии до 44,3%, что также может принести пользу при следующем эффективном производстве ¹ О ₂ .

Выпущено ¹ О ₂ из композитных нановолокон

Чтобы оценить способность нанокомпозитных волокон производить ¹ О ₂ , использовался метод SOSG. Сначала мы взяли нанокомпозитные волокна с фиксированной концентрацией легирования и наблюдали генерацию ¹ О ₂ при разном времени облучения. Как показано на рис. 3а, для фиксированной концентрации, такой как 0,20 мас.%, Время облучения является одним из факторов, влияющих на образование ¹ О ₂ . Чем больше время облучения, тем больше ¹ О ₂ был произведен. Однако он также показывает, что, хотя концентрация ¹ О ₂ постепенно увеличивается с увеличением времени облучения, скорость нарастания постепенно замедляется и почти остается постоянной через 20 мин, что проявляется в виде плотного интервала кривой. Это явление может быть связано с быстрым локальным потреблением кислорода путем производства ¹ О ₂ с устойчивым излучением ближнего ИК-диапазона, что приводит к относительно низкому уровню кислорода в определенной области и, таким образом, снижает скорость роста производства ¹ О ₂ .

Производство синглетного кислорода композитной нановолоконной мембраны, легированной UCNPs @ Curcumin, подвергнутой воздействию света с длиной волны 808 нм при различных a концентрация и б время облучения

Наблюдать за влиянием концентрации легирования на производство ¹ О ₂ , Рис. 3b изображен дополнительно. Как показано на рис. 3b, для фиксированного времени облучения, например 20 мин, с увеличением концентрации легирования больше ¹ О ₂ был произведен. Однако скорость роста ¹ О ₂ замедляется, когда концентрация превышает 0,20 мас.%. Эти экспериментальные результаты показывают, что нет необходимости бесконечно увеличивать время облучения и концентрацию легирования для получения большего количества ¹ О ₂ . Оптимальный выбор - 0,20 мас.% В течение 20 минут, поэтому в следующих экспериментах будет использоваться эта концентрация и время облучения.

Смачиваемость и адгезивность нановолоконной мембраны из электропряденого на месте

Учитывая производство ¹ О ₂ представляет собой процесс, который требует, чтобы наночастицы UCNP @ куркумина в волокнах взаимодействовали с кислородом в жидкости организма, поэтому угол контакта этой волоконной мембраны был дополнительно протестирован. На рис. 4а показана капля воды, упавшая на поверхность этой композитной мембраны из нановолокна, и ее смачиваемость через 20 с. По сравнению с мембраной из чистого нановолокна PCL (рис. 4b) композитная мембрана из нановолокна имеет лучшую смачиваемость. Интересно, что после замачивания композитной нановолоконной мембраны в фосфатном буферном растворе (PBS) абсорбционный спектрометр не обнаружил UCNPs @ Curcumin в PBS, что означает, что куркумин не выделялся из волокон. Причина может заключаться в том, что куркумин был нанесен на UCNPs, поэтому размер UCNPs @ Curcumin (~ 50 нм) был слишком большим, чтобы проникнуть в волокно. По сравнению с методами нанесения фотосенсибилизаторов на частицы или волокна, сначала увеличение размера куркумина, а затем добавление его в смачиваемые волокна может эффективно предотвратить выделение фотосенсибилизаторов и улучшить образование и распространение ¹ О ₂ . Кроме того, учитывая, что короткодействующий эффект ФДТ и плохая адгезия волоконной мембраны, изготовленной традиционным методом электроспиннинга, к поверхности раны (рис. 4c; дополнительный файл 1:рис. S6), будет затронут фотодинамический эффект. за счет промежутка между волокнистой мембраной и поверхностью. К счастью, эти композитные нановолокна куркумина могут быть получены методом электроспиннинга in situ с хорошей морфологией (рис. 1c), а также обладают хорошей адгезией к различным поверхностям объектов (рис. 4d). Это означает, что метод осаждения методом электроспиннинга на месте для изготовления фотодинамической волоконной мембраны более предпочтителен, чем традиционный метод прядения, при котором волокнистая мембрана собирается на фольге, а затем прижимается к поверхности раны.

Измерение угла смачивания водой композитной нановолоконной мембраны с матрицей из a PCL / PVP и b PCL, c традиционная электропряденая мембрана из нановолокна и мембрана из электропряденого нановолокна для осаждения на месте, d Электропрядение для осаждения на месте на поверхности различных объектов

Двойной антибактериальный эффект композитных нановолокон куркумина

Нанокомпозитные волокна, полученные с помощью устройства, оказались нетоксичными с помощью анализа МТТ (файл дополнения 1:рис. S7). Кроме того, чтобы доказать, что волокна обладают хорошими антибактериальными свойствами, был использован метод подсчета для оценки антибактериальных свойств композитных нановолокон. Как показано на рис. 5, независимо от того, излучается ли свет с длиной волны 808 нм на чистые волокна, антибактериальные свойства отсутствуют (рис. 5a, b). Эти результаты показывают, что сам по себе свет с длиной волны 808 нм не оказывает бактерицидного действия. Когда волокна легированы UCNP, бактерии не уменьшаются, что подтверждает, что UCNPs не обладают бактерицидным действием (рис. 5a ', b'). Интересно, что когда волокна легированы куркумином, количество бактерий в определенной степени уменьшается, что доказывает, что сам куркумин проявляет определенную антибактериальную активность (рис. 5c, c '). Кроме того, очевидный бактерицидный результат наблюдался у волокон, легированных UCNPs @ Curcumin, при облучении светом NIR (рис. 5d ', e'). В сочетании с результатами на фиг. 3 эти бактерицидные результаты показывают, что ¹ О ₂ произведенный из UCNPs @ Куркумин при облучении 808 нм может эффективно убивать бактерии. С другой стороны, антибактериальная активность куркумина была одинаковой как в присутствии, так и в отсутствие излучения на длине волны 808 нм из-за того, что поглощение куркумина находилось в диапазоне видимого света (рис. 2b), поэтому свет на длине волны 808 нм был одинаковым. не был эффективным. Это также стало причиной того, что куркумин был разработан для покрытия поверхности UCNP. Кроме того, на рис. 5d, e показаны волокна, легированные УНЧ @ куркумином в концентрации 0,15 мас.% И 0,20 мас.% Соответственно. Для сравнения было обнаружено, что группа с 0,20 мас.% Проявляла лучшие бактерицидные свойства через 20 мин светового облучения, а антибактериальный эффект достигал 95%. Это потому, что ¹ О ₂ вырабатываемый фотосенсибилизатором куркумин в результате фотодинамического эффекта может убивать устойчивые к лекарствам бактерии. Этот результат также согласуется с ¹ О ₂ результат на рис. 3. Эти данные также показывают, что волокна, допированные UCNPs @ Curcumin, могут убивать MRSA из-за своей двойной антибактериальной активности, а именно волокна, допированные UCNPs @ Curcumin и PDT, и PDT обладают лучшим антибактериальным действием, чем волокна, допированные UCNPs @ Curcumin . Кроме того, мы также провели эксперименты с Escherichia coli, которые также подтвердили, что композитные нановолокна из электроспряденного куркумина in situ обладают двойным антибактериальным действием на устойчивые к лекарствам бактерии (файл дополнения 1:рис. S8). Противовоспалительный эффект нановолокон был дополнительно подтвержден окрашиванием MRSA H&E (файл дополнения 1:рис. S9). После различного лечения раневой инфекции было собрано большое количество нейтрофилов в группе волокон без нанокомпозитов, которые представляли собой кластеры пурпурных и синих клеток из-за повреждения ткани и гнойной инфекции. Однако в группе нановолокон появилось небольшое количество грануляционной ткани и эритроцитов, что косвенно отражало антибактериальные свойства нанокомпозитных волокон. Обладает блокирующим действием на воспаление раневой инфекции.

Антибактериальные свойства нановолокна, легированного различными образцами, против MRSA a - е без и a ′ - e ′ при освещении 808 нм: a , a ′ контрольная группа, b , b ′ Группа UCNPs, c , c ′ группа куркумина, d , d ′ UCNPs @ Куркумин в группе низких доз и e , e ′ группа с высокими дозами

Выводы

Таким образом, композиционные нановолокна куркумина ядро-оболочка получают методом электроспиннинга in situ с помощью самодельного портативного устройства для электропрядения. Полученные композитные нановолокна демонстрируют превосходную адгезию на различных биологических поверхностях, чем при традиционном методе приготовления. Этот метод, во-первых, увеличение размера куркумина с последующим добавлением его в смачиваемое волокно, может эффективно избежать выделения фотосенсибилизаторов, тем самым увеличивая производство ¹ О ₂ и его распространение, что может послужить источником вдохновения для разработки других фотодинамических наноматериалов. После того, как эти композитные нановолокна загрязнены устойчивыми к лекарствам бактериями, они проявляют двойное антибактериальное поведение и эффективно убивают устойчивые к лекарствам бактерии. Эти двойные антибактериальные мембраны из нановолокна обладают отличной адгезией и могут использоваться в качестве антибактериальных повязок в сочетании с гемостазом, что обеспечивает гемостаз на открытом воздухе.

Доступность данных и материалов

Наборы данных, созданные во время и / или проанализированные в ходе текущего исследования, доступны у соответствующих авторов по разумному запросу.

Сокращения

PDT:

Фотодинамическая терапия

¹ О ₂ :

Синглетный кислород

MRSA:

Метициллин-устойчивый золотистый стафилококк

NIR:

Ближний инфракрасный порт

UCNPs:

Апконверсия наночастиц

PVP:

Поливинилпирролидон

PCL:

Поликапролактон

PEI:

Полиэтиленимин

SOSG:

Синглетный кислородный датчик зеленый

FRET:

Флуоресцентный резонансный перенос энергии

PBS:

Фосфатный буферный раствор