Эффективная наноинкапсуляция неонатальных свиных островков подобных кластеров клеток с использованием полимеросом на основе PEG-блок-PLA

Аннотация

В исследовании представлены методы наноинкапсуляции неонатальных свиных островков подобных кластеров клеток (NPCC) с использованием полимеросом (PSome), сформированных из полимеров полиэтиленгликоль-блок-полилактид. Разработана эффективная процедура наноинкапсуляции с минимальным повреждением и потерями NPCC. Для индуцирования связи аминогрупп внеклеточной матрицы, окружающей NPCC, на N-терминале PSome использовали N-оксисукцинимיד (NHS). В процедуре наноинкапсуляции применяли среду F-10 с сывороточным альбумином bovines (BSA) для минимизации повреждений и потерь NPCC. В завершение индуцировали перекрестное связывание между бифункциональными PSome (NHS-/NH₂-PSome). Среда F-10, содержащая 0,25% BSA при pH 7,3, минимизировала повреждения и потери NPCC после наноинкапсуляции по сравнению с основным буфером HBSS (pH 8,0). Также достигли эффективной наноинкапсуляции за счет конъюгации PSome с использованием бифункциональных PSome (NHS-/NH₂-PSome).

Введение

Применение алло-трансплантации островков в лечении сахарного диабета 1 типа ограничено из-за отсутствия подходящих доноров. Вместо этого наблюдается постепенный рост использования животных островков в ксенотрансплантации, при этом свиньи выступают оптимальным видом доноров [1]. При использовании свиней в качестве доноров при трансплантации можно использовать отдельные островки в зависимости от возраста свиней. Часто предпочитают неонатальные свиные островки подобные кластеры клеток (NPCC) взрослым свиным островкам (API) из-за их доступности и простоты изоляции. Кроме того, NPCC могут постепенно пролиферировать после трансплантации, продлевая их функцию in vivo [1, 2]. Однако при трансплантации NPCC в воротные вены человека или нечеловеческих приматов (NHP) межвидовые вариации могут вызывать иммунные реакции, такие как мгновенная кровно-опосредованная воспалительная реакция (IBMIR) или гиперострый отторжение, что приводит к ранней потере трансплантата [3]. Для решения этой проблемы требуется инкапсуляция NPCC, способная ингибировать различные иммунные реакции. Существует три типа инкапсуляции: макро-, микро- и наноинкапсуляция. Макроинкапсуляция использует устройство, содержащее островки, которое имплантируют вокруг сосудов для выделения инсулина через полупроницаемую мембрану в ответ на уровень глюкозы в крови. Микроинкапсуляция упаковывает небольшое количество островков в пористый капсулу. Хотя эти методы инкапсуляции могут защищать островки от иммунного отторжения, в in vivo испытаниях сообщались побочные эффекты, такие как коллапс мембраны или тромбоз. Островки также нарушают поток гормонов, питательных веществ или кислорода из-за увеличения диффузионного расстояния. Наноинкапсуляция — это стратегия модификации поверхности клеток, индуцирующая присоединение между клетками и экзогенными белками, преимущественно полиэтиленгликолем (PEG), при гемотрансфузии [4].

Наноинкапсуляция с использованием PEG широко применялась как метод модификации для улучшения эффективности и физикохимических свойств целевых белков или пептидов [5]. В частности, наноинкапсуляция островков может оказывать ингибирующий эффект в ответ на атаку иммунных клеток и распознавание антител. PEG широко используется для покрытия клеток благодаря своим биосовместимым свойствам: неиммуногенности, маскировке антигенов и антифоллинг-эффекту [6]. Среди наночастиц, используемых для наноинкапсуляции NPCC, «полимеросомы» (PSome) на основе PEG-блок-полилактида (PEG-b-PLA) наиболее подходят, так как они стабильны, просты в модификации и могут включить как гидрофильные, так и гидрофобные реагенты в свою сборку [7, 8]. Поверхностная модификация островков с использованием полимеров (содержащих PEG) осуществляется через ковалентное или нековалентное связывание между внеклеточной матрицей (ECM) островка и функциональной группой конъюгированного полимера [9].

В предыдущих исследованиях в качестве реакционного буфера для наноинкапсуляции островков использовали основной раствор Ханка (HBSS, pH 8,0) из-за его способности способствовать связыванию N-оксисукцинимида (NHS) с NH₂ [10,11,12]. Однако для минимизации клеточного повреждения NPCC во время наноинкапсуляции мы использовали среду F-10 (культурная среда NPCC) с физиологическим pH (pH 7,3). Кроме того, поскольку сохранение количества NPCC после наноинкапсуляции важно для трансплантации правильного количества клеток, мы добавили сывороточный альбумин bovines (BSA), который покрывает дно культурной чашки Петри длинноцепочечным полимером, для повышения выходной нормы [13]. В нашем предыдущем исследовании наноинкапсуляция NPCC с PSome проводилась через одиночные функциональные группы, такие как NHS или NH₂, используемые для индуцирования ковалентного связывания или электростатического взаимодействия с ECM NPCC соответственно. Однако по мере снижения аффинности связывания со временем требовались стратегии повышения эффективности покрытия [14]. PSome, имеющие бифункциональные группы, могут использоваться как кандидаты для повышения эффективности покрытия благодаря своей способности к агрегации. Поэтому мы индуцировали перекрестное связывание между PSome, содержащими бифункциональные группы (NHS-/NH₂-PSome), которые могут связываться не только с ECM NPCC, но и друг с другом через ковалентное или электростатическое взаимодействие, тем самым повышая эффективность наноинкапсуляции.

В данном исследовании мы изучали возможное применение наноинкапсуляции на NPCC через оптимизированный метод в области ксенотрансплантации свиных островков.

Материалы и методы

Животные

Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Института MGENPLUS co. ltd. (#2019–1), и все процедуры проводились в соответствии с рекомендациями комитета. Операции выполнялись под общей анестезией, принимались меры для обеспечения минимальной боли у животных. Свиней усыпляли перед панкреактомией.

Изоляция неонатальных свиных островков подобных кластеров клеток (NPCC)

NPCC изолировали из 3- до 5-дневных поросят. Кратко: поросят анестезировали введением кэтамина (10 мг/кг, Yuhan, Сеул, Корея) и гидрохлорида ксилазина (1 мг/кг, Rompun; Bayer Korea, Сеул, Корея) в бедренную мышцу, затем усыпляли введением хлорида калия (Sigma-Aldrich, MO, США) в сердце. Поджелудочную железу экспонировали через брюшной разрез, извлекли и поместили в сбалансированный раствор Ханка (HBSS, Biosesang, Кёнгидо, Корея) с 8,3 мМ бикарбоната натрия, 10 мМ N-(2-гидроксиэтил)пиперазин-N'-(2-этансульфоновая кислота) (HEPES) (Sigma-Aldrich, MO, США) и 0,5% антибиотик-антимикотик (Biowest, MO, США). Поджелудочную железу на切碎 на фрагменты 1–2 мм³ и переваривали в коллагеназе типа V (1 мг/мл, Sigma-Aldrich, MO, США) в HBSS в течение 10 мин. Холодный HBSS, содержащий 10% фетового бычьего сыворотки (FBS) (Biowest, MO, США), добавили к переваренной ткани поджелудочной железы для остановки ферментативной активности. Переваренные ткани промывали в HBSS, после ресуспензии ткани фильтровали через pluriStrainer 500 мкм (pluriSelect, Лейпциг, Германия) и промывали в HBSS. Наконец, NPCC посеяли и культивировали в 5% CO₂ при 37 °C в среде F-10 (Gibco, CA, США) с добавлением 0,25% сывороточного альбумина bovines (BSA) (genDepot, TX, США), 10 мМ никотинамида, 10 мМ D-глюкозы, 2 мМ L-глутамина, 2 мМ дигидрата хлорида кальция, 50 мкМ изоамилметилксантина (IBMX), 20 мкг/мл ципрофлоксацина (Sigma-Aldrich, MO, США) и 1% антибиотик-антимикотик. NPCC культивировали 5 дней [15], ежедневно добавляя 10 нМ эксендина-4 (Prospec, Нес-Циона, Израиль) в культурную среду.

In vitro оценка NPCC и наноинкапсулированных NPCC

После культивирования количество NPCC подсчитывали в эквивалентах островков (IEQ) с помощью окулярной микрометрической сетки. Жизнеспособность оценивали окрашиванием акридиновым оранжевым (AO, 0,67 мкМ, Sigma-Aldrich, MO, США) и йодидом пропидия (PI, 75 мкМ, Sigma-Aldrich, MO, США). Для проведения анализа глюкозостимулируемой секреции инсулина (GSIS) отбирали 20–30 NPCC и предварительно инкубировали их с низкой концентрацией D-глюкозы (2,8 мМ) в буфере Кребса-Рингера-бикарбоната (KRBB) в течение 1 ч. Затем NPCC инкубировали с низкой D-глюкозой (2,8 мМ) в буфере KRBB в течение 1 ч, затем с высокой D-глюкозой (28,0 мМ) в KRBB в течение 1 ч. Сверхнатанты собирали для измерения секреции инсулина при низких и высоких концентрациях глюкозы [11]. Количество секретированного инсулина из каждого образца измеряли с помощью комплекта Human/Canine/Porcine Insulin Quantikine ELISA Kit (R&D systems, MN, США). Индекс стимуляции (SI) рассчитывали делением количества инсулина при высокой глюкозе (28,0 мМ) на то при низкой (2,8 мМ) концентрации.

Подготовка полимеросом (PSome)

Для подготовки PSome растворяли либо N-оксисукцинимид-поли(этиленгликоль)-блок-поли(лактид) кополимеры (10 мг/мл, NHS-PEG-b-PLA), либо амин-поли(этиленгликоль)-блок-поли(лактид) кополимеры (10 мг/мл, NH₂-PEG-b-PLA; Nanosoft polymers, NC, США) в 1 мл диметилсульфоксида (DMSO, Sigma-Aldrich, MO, США). Для подготовки бифункциональных PSome каждый кополимер (NHS или NH₂-PEG-b-PLA), растворенный в DMSO, смешивали в пропорциях. Дистиллированную воду (DH2O) добавляли к полимерному раствору для получения конечной концентрации 1 мг/мл. Полимерный раствор ультразвуково обрабатывали в ультразвуковом очаге (Sea han ultrasonic, Сеул, Корея) в течение 5 мин. 1,1'-Диоктадецил-3,3,3',3'-тетраметилиндодикарбоцианин, хлорид 4-хлорбензенсульфоната (DiD; Biotium, CA, США) добавляли к полимерному раствору во время ультразвуковой обработки для визуализации. Наконец, смесь диализировали в DH2O в течение 3 дней.

Наноинкапсуляция

PSome разбавляли в реакционном буфере наноинкапсуляции (HBSS (pH 7,3 или pH 8,0) или чистая среда F-10 без добавок (pH 7,3 или pH 8,0), с или без 0,25% BSA). Наноинкапсуляцию проводили добавлением PSome к NPCC в культурной среде. Для этого 10 000 IEQ NPCC посеяли в 6-колбенную культурную чашку Петри (SPL, Кёнгидо, Корея), добавили разбавленные PSome к NPCC и инкубировали в 5% CO₂ при 37 °C в течение 1 ч. Группа негативного контроля (NC) (непокрытые NPCC без PSome) инкубировали в тех же условиях, что и экспериментальная группа. После инкубации наноинкапсулированные NPCC собирали и культивировали в среде F-10.

Эффективность наноинкапсулированных NPCC

ДиD-конъюгированные PSome наноинкапсулированные NPCC визуализировали с помощью флуоресцентной микроскопии (Leica, Ветцлар, Германия) или конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM; Carl Zeiss, Оберкохен, Германия). Интенсивность DiD-конъюгированных PSome-связанных NPCC kvantифицировали вычислением средней флуоресцентной интенсивности (MFI) с помощью программного обеспечения ImageJ (NIH, Бетесда, США). Ядра в клетках контрастировали с 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI).

Анализ проницаемости полимеросом

NHS-PSome наноинкапсулированные NPCC в F-10 или F-10 (0,25% BSA) инкубировали с флуоресcein изотиоцианатом (FITC)-конъюгированным декстраном различных молекулярных масс (10, 20, 70 и 250 кДа) в течение 2 ч. Проникновение FITC-конъюгированного декстана в NHS-PSome наноинкапсулированные NPCC подтверждали для каждой молекулярной массы с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа.

Анализ жизнеспособности клеток с полимеросом

NHS-PSome наноинкапсулированные THP-1 (человеческая моноцитарная клеточная линия) в RPMI 1640 (Biowest, MO, США) инкубировали в течение 1 ч. Жизнеспособность NHS-PSome наноинкапсулированных THP-1 измеряли согласно протоколу комплекта MTT cell proliferation assay kit (iNtRon Biotechnology, Соннам-си, Корея).

Статистический анализ

Непрямой t-тест выполняли в GraphPad Prism 6.0. Статистическая значимость выражалась как *, ** ***, и **** указывающие на значение P ≤ 0,05, ≤ 0,01, ≤ 0,001 и ≤ 0,0001.

Результаты

Культивирование и функциональная оценка NPCC

NPCC культивировали 5 дней и проводили контроль качества, включая жизнеспособность и GSIS. Общее количество NPCC составило 21 014,0 IEQ/г/поджелудочная железа. Жизнеспособность, определенная окрашиванием AO/PI, составила 89,9%. GSIS, проведенный для подтверждения отзывчивости NPCC к концентрации глюкозы, дал средний индекс стимуляции (SI) 2,3 (Таблица 1, Дополнительный файл 1: Рис. S1).

Концентрация PSome, необходимая для эффективной наноинкапсуляции NPCC

Для определения концентрации PSome, необходимой для эффективной наноинкапсуляции, добавляли варьирующие концентрации NHS-PSome к NPCC. NHS-PSome хранили при концентрации 1 мг/мл в DH₂O и разбавляли в пропорциях 1:5, 1:10, 1:20 и 1:40, получая конечные концентрации от 0,2 до 0,025 мг/мл. Эффективность наноинкапсуляции измеряли по MFI DiD-загруженных PSome наноинкапсулированных NPCC. Конечная концентрация 0,1 мг/мл (разбавление 1:10) показала наивысшую флуоресцентную интенсивность на 2-й день после наноинкапсуляции (Рис. 1a и b), и последующая наноинкапсуляция NPCC проводилась при этой концентрации.

Повышение эффективности наноинкапсуляции в среде F-10 с физиологическим pH

Наноинкапсуляция поджелудочных островков (содержащих NPCC) часто выполняется в основном буфере HBSS (pH 8,0 или выше) для усиления аффинности связывания между NH2 в ECM островков и NHS, конъюгированным в полимере. Однако наноинкапсуляция в основном буфере HBSS может потенциально повредить NPCC. Таким образом, для минимизации повреждений NPCC и определения влияния pH на связывание NHS-NH₂, NPCC наноинкапсулировали через NHS-PSome в буферах HBSS или в чистой культуре F-10 (используемой в данном исследовании для культивирования NPCC) с pH 7,3 (физиологическим) или pH 8,0 (основным) соответственно. При наноинкапсуляции в F-10 нормальная морфология NPCC сохранялась (Рис. 2a), а эффективность наноинкапсуляции на основе MFI значимо увеличивалась по сравнению с группой HBSS независимо от pH на 0 и 6 день (Рис. 2b). Хотя группы HBSS показывали значимую разницу между pH 7,3 и 8,0 на 6-й день, интенсивность наноинкапсуляции значимо снижалась по сравнению с группой F-10. Поэтому в последующих экспериментах использовали физиологическую среду F-10 (pH 7,3) в качестве реакционного буфера наноинкапсуляции для минимизации потенциального повреждения NPCC.

Повышение выходной нормы NPCC после наноинкапсуляции

Хотя клеточное повреждение NPCC минимизировалось в F-10, количество NPCC, собранных после наноинкапсуляции, заметно снижалось. Для решения этой проблемы добавляли 0,25% BSA в среду F-10 во время культивирования и наноинкапсуляции NPCC с использованием NHS-PSome. Изначально подтверждали, влияет ли добавление 0,25% BSA в среду F-10 на эффективность покрытия и селективную проницаемость, позволяющую прохождению малых молекул (10 и 20 кДа FITC-конъюгированный декстран) при блокировке более крупных молекул (70 и 250 кДа FITC-конъюгированный декстран), как существенную функцию PSome. В результате конформальное покрытие демонстрировалось на изображениях CLSM (Рис. 3a, Mid), а селективная проницаемость сохранялась нормально (Рис. 3b, FITC-конъюгированный декстран) в NHS-PSome наноинкапсулированных NPCC с F-10, содержащим 0,25% BSA, по сравнению с F-10, хотя MFI незначительно снижался (Рис. 3b). Количество NPCC, собранных после наноинкапсуляции, показывало значимо более высокую выходную норму (71,9%) в F-10 с 0,25% BSA, чем в F-10 без BSA (42,3%) (Рис. 3c). Жизнеспособность (NC: 89,5%, NHS-PSome: 90,3%) и глюкозостимулируемая секреция инсулина (NC: 2,1, NHS-PSome: 1,6) NPCC в F-10 с 0,25% BSA также сохранялись после наноинкапсуляции (Рис. 4a, b, Дополнительный файл 1: Рис. S2). Наши результаты указывают на то, что добавление 0,25% BSA может значимо повысить выходную норму NPCC после наноинкапсуляции и не влияет на эффективность покрытия или функцию PSome.

Повышение стабильности наноинкапсуляции за счет перекрестного связывания PSome

Для индуцирования более стабильной наноинкапсуляции NPCC мы пытались сконъюгировать PSome, имеющие две различные функциональные группы. Во-первых, проводили наноинкапсуляцию NPCC одновременным добавлением различных пропорций PSome, содержащих NHS и NH₂ бифункциональные группы (NHS-/NH₂-PSome) в одном PSome (Схема 1). Эффективность наноинкапсуляции подтверждали по MFI DiD, конъюгированного в PSome наноинкапсулированных NPCC. Полученные изображения флуоресцентной микроскопии не показывали значимых различий между группами 9:1, 5:5 и 1:9 NHS-/NH2-PSome наноинкапсулированных NPCC (9:1, 5:5, 1:9) на 0-й день и день (Рис. 5a). Однако в результатах CLSM группа 5:5 казалась перепокрытой, а 1:9 показывала недостаточное покрытие, в то время как группа 9:1 формировала конформальное покрытие на 1-й день (Рис. 5b). Поэтому определили оптимальное соотношение NHS-/NH2 в PSome как 9:1. При функциональных анализах для группы 9:1 наши результаты показали, что жизнеспособность группы 9:1 значимо снижалась по сравнению с контролем NC (92,1%), но жизнеспособность сохранялась на нормальном уровне (87,8%). Функция SI группы 9:1 была нормальной (3,0) по сравнению с контролем NC (3,7) (Рис. 5c,d).

Обсуждение

Сахарный диабет, обычно известный как диабет, — это метаболическое заболевание, характеризующееся высоким уровнем глюкозы в крови. Сахарный диабет 1 типа возникает из-за невозможности бета-клеток поджелудочной железы производить достаточно инсулина [16]. Трансплантация поджелудочных островков, содержащих инсулин-продуцирующие β-клетки, недавно использовалась для лечения сахарного диабета 1 типа. Однако алло-трансплантация островков ограничена из-за дефицита доноров; вместо этого ксенотрансплантация с использованием островков от нечеловеческих животных возникла как альтернативный источник донорской ткани. Благодаря их физиологическому сходству с людьми, легкости массового разведения и возможности разведения в свободных от патогенах помещениях, свиньи считаются оптимальной животной моделью для ксенотрансплантации островков [1]. Особенно NPCC ценны не хуже API. Хотя зрелость NPCC ниже, чем у API, NPCC имеют некоторые преимущества перед API, включая относительно простую и недорогую процедуру изоляции островков, способность развивать устойчивость к гипоксическим средам и пролиферировать in vivo после трансплантации [1,2,3]. По этим причинам в данном исследовании в качестве источника островков использовали 3–5-дневных неонатальных поросят.

К сожалению, когда свиные островки имплантируют в сосуды человека или нечеловеческих приматов, часто возникают тяжелые иммунные реакции, такие как IBMIR или гиперострый отказ. IBMIR обычно возникает из-за нескольких тканевых факторов (TF), экспрессируемых в свиных островках, которые опосредовывают коагуляцию в человеческих сосудах через активацию экстринзического пути. Альфа-галактоза или не-галактозные антигены, экспрессируемые на поверхности свиных клеток, также могут быть мишенями естественных человеческих антител, за которыми следует активация каскада комплемента, называемая гиперострым отказом. В результате трансплантаты теряются из-за гипоксии тромбозом от коагуляционного пути и гибелью клеток от активации комплемента в хозяине [3]. Для решения этих проблем пробовали инкапсуляцию — метод покрытия поджелудочных островков биосовместимыми материалами для защиты от атаки антител или реакций комплемента. Во-первых, макроинкапсуляция использует устройство с полупроницаемой мембраной, содержащим островок, и имплантирует его рядом с кровеносными сосудами, где оно выделяет инсулин в кровоток в ответ на уровень глюкозы в крови [4]. Во-вторых, микроинкапсуляция, преимущественно с использованием альгината, обладает селективной проницаемостью и может пропускать кислород и питательные вещества через свою пористую поверхность, блокируя множественные цитокины и инфильтрацию иммунных клеток. Однако, поскольку они используют капсулы одного размера независимо от размера островков, сложно конформально покрыть островки. Кроме того, после трансплантации может возникнуть фиброз, окружающий трансплантат [17]. В-третьих, поверхностная модификация островков (наноинкапсуляция) преимущественно использует полиэтиленгликол (PEG), который обладает свойством «stealth-эффекта», блокирующим взаимодействие материалов, покрытых «stealth» полимером (PEG), и компонентов крови (иммунных клеток) in vivo [11, 18]. Наша стратегия наноинкапсуляции NPCC использует модифицированные кополимеры PEG (PEG-b-PLA, Полимеросома, PSome). Также PSome обладает как гидрофильными, так и гидрофобными свойствами и может включать иммунодепрессанты или факторы, вовлеченные в дифференциацию или рост клеток [8].

Наноинкапсуляция островков с использованием PEG проводилась в основном буфере HBSS (pH 8,0 или выше) для усиления аффинности связывания между NHS на PEG и NH₂ на ECM островка [10,11,12]. Однако, поскольку эти условия не обеспечивают подходящую клеточную культуру, мы пытались провести наноинкапсуляцию в среде, имитирующей условия культивирования NPCC. Для решения вышеуказанных проблем мы протестировали чистую среду F-10, базовую среду NPCC, с физиологическим pH (без добавок) в качестве реакционного буфера наноинкапсуляции. Наноинкапсуляция в F-10 с физиологическим pH показала схожую эффективность покрытия и сохраняла нормальную морфологию NPCC по сравнению с условиями культивирования с использованием основного буфера HBSS (Рис. 3). Следовательно, мы можем предложить платформу, минимизирующую повреждение NPCC во время наноинкапсуляции в среде, имитирующей культуру NPCC.

Хотя метод наноинкапсуляции для минимизации повреждения NPCC был установлен, остаточное количество NPCC, собранных после наноинкапсуляции, снижалось при проведении наноинкапсуляции в чашках Петри. Это означает, что для наноинкапсуляции для трансплантации требуется больше NPCC. Согласно предыдущим отчетам, выходная норма островков улучшалась в некоторых линиях мышей за счет использования BSA при изоляции [19]. Также BSA использовали в качестве суспензионной культуры путем предварительного покрытия поверхности культурных чашек Петри в культурах гепатомы крыс [13]. Поэтому для увеличения количества NPCC после наноинкапсуляции 0,25% BSA добавляли в реакционный буфер наноинкапсуляции F-10, в той же концентрации BSA, что и для культивирования NPCC. В результате выходная норма NPCC значимо увеличилась после наноинкапсуляции (Рис. 4). Это означает, что правильное количество островков (содержащих NPCC) после наноинкапсуляции можно предсказать и пересадить, минимизируя потери островков (содержащих NPCC). Подводя итог, данное исследование с использованием F-10 с 0,25% BSA для наноинкапсуляции показало, что (i) нормальная морфология NPCC сохранялась, (ii) связывание между NHS-конъюгированным PSome и NH2 в ECM NPCC не мешалось и (iii) выходная норма NPCC после наноинкапсуляции увеличивалась.

Наконец, мы пытались повысить стабильность наноинкапсуляции через (i) конъюгацию между PSome и (ii) связывание между PSome и ECM NPCC. Во-первых, NHS- и NH2-PEG-b-PLA полимеры смешивали пропорционально для формирования бифункционального PSome (NHS-/NH2-PSome), который может связываться и с PSome, и с ECM NPCC. Мы предположили, что конъюгация может быть эффективно достигнута бифункциональными группами внутри одного PSome, а не конъюгацией двух PSome с монофункциональными группами из-за потенциального прерывания, вызванного связыванием между PSome с одинаковой функциональной группой (NHS-NHS и NH2-NH2). Как видно из результатов, конформальное покрытие NPCC достигалось при пропорции 9:1 NHS-/NH2-PSome наноинкапсулированных NPCC, и жизнеспособность и функциональность сохранялись (Рис. 5). Однако дальнейшие исследования необходимы для количественной оценки силы связи PSome, чтобы доказать, что наноинкапсуляция с бифункциональными PSome приводит к более стабильной инкапсуляции, чем с монофункциональными PSome. Поэтому мы предлагаем, что наши эффективные условия наноинкапсуляции, имитирующие среду культуры NPCC, могут использоваться в стратегии наноинкапсуляции с использованием островков, содержащих NPCC (Дополнительный файл 1).

Заключение

Это исследование проводилось для определения оптимального метода наноинкапсуляции поджелудочных островков (NPCC) с использованием полимеросом на основе PEG (PSome). Во-первых, использование среды F-10 с pH 7,3 может сохранить нормальную морфологию NPCC после наноинкапсуляции по сравнению с использованием основного буфера HBSS (pH 8,0), тем самым минимизируя повреждение NPCC во время инкапсуляции. Во-вторых, добавление 0,25% BSA в среду F-10 улучшило выходную норму NPCC примерно в 1,7 раза после наноинкапсуляции. В-третьих, мы индуцировали более стабильную наноинкапсуляцию через конъюгацию бифункциональных PSome (NHS-/NH2-PSome). Представленные в этой статье методы наноинкапсуляции могут быть применимы в наноинкапсуляции поджелудочных островков с использованием наночастиц на основе PEG.

Доступность данных и материалов

Не применимо.

Аббревиатуры

DiD:

1,1'-Диоктадецил-3,3,3',3'-тетраметилиндодикарбоцианин, хлорид 4-хлорбензенсульфоната

AO:

Акридиновый оранжевый

APIs:

Взрослые свиные островки

BSA:

Сывороточный альбумин bovines

BF:

Яркое поле

CLSM:

Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия

DAPI:

4',6-диамидино-2-фенилиндол

DMSO:

Диметилсульфоксид

DH2O:

Дистиллированная вода

ELISA:

Иммуноферментный анализ

FBS:

Фетовый бычий сыворотка

FITC:

Флуоресcein изотиоцианат

GSIS:

Глюкозостимулируемая секреция инсулина

HBSS:

Сбалансированный раствор Ханка

IBMIR:

Мгновенная кровно-опосредованная воспалительная реакция

IEQ:

Эквивалент островка

IBMX:

Изобутилметилксантин

KRBB:

Буфер Кребса-Рингера-бикарбоната

MFI:

Средняя флуоресцентная интенсивность

HEPES:

N-(2-гидроксиэтил)пиперазин-N'-(2-этансульфоновая кислота)

NC:

Негативный контроль

NPCCs:

Неонатальные свиные островки подобные кластеры клеток

NHS:

N-оксисукцинимид

NHP:

Нечеловеческие приматы

PLA:

Полилактид

PEG:

Полиэтиленгликол

PSomes:

Полимеросомы

PI:

Йодид пропидия

SI:

Индекс стимуляции

TF:

Тканевый фактор