Восстановление miR-133a-3p или подавление PSAT1 ограничивают эндотелиальный урон при внутричерепных аневризмах через ингибирование пути GSK3β/β-катенин

Аннотация

Функциональная роль микроРНК-133a-3p (miR-133a-3p) внутричерепных аневризм (ИЧА) оставалась неясной. Цель работы — изучить регуляторную роль miR-133a-3p при эндотелиальном уронe, индуцирующем ИЧА, через сигнальный путь фосфосерин-аминотрансферазы 1 (PSAT1)/гликоген-синтазе-киназы 3β (GSK3β)/β-катенин. Нормальные ткани внутричерепных артериол и ткани ИЧА собрали у пациентов с черепно-мозговыми травмами и ИЧА. Экспрессию miR-133a-3p, PSAT1, GSK3β и β-катенина в тканях определили методом РТ-количественного ПЦР и вестерн-блоттингом. Эндотелиальные клетки (ЭК) человека с ИЧА культивировали и трансфицировали мимиком miR-133a-3p и si-PSAT1 для изучения их роли в миграции, апоптозе и пролиферации ЭК. Экспрессию miR-133a-3p, PSAT1, GSK3β, β-катенина, Ki-67, CyclinD1, Bax и Bcl-2 в ЭК анализировали РТ-количественным ПЦР или вестерн-блоттингом. Кроме того, создали крысиную модель ИЧА для оценки патологических изменений и экспрессии miR-133a-3p, PSAT1, GSK3β, β-катенина, VEGF и MMP-9 в тканях ИЧА in vivo. Экспрессия miR-133a-3p коррелировала с числом и размером аневризм. В ИЧА экспрессия miR-133a-3p снижена, а PSAT1, GSK3β и β-катенин — повышена. Восстановление miR-133a-3p и депрессия PSAT1 смягчали патологические изменения, снижали экспрессию PSAT1, GSK3β и β-катенина в ИЧА, подавляли апоптоз и стимулировали пролиферацию и миграцию ЭК ИЧА, а также уменьшали экспрессию VEGF и MMP-9 в тканях ИЧА in vivo. Наши данные показывают, что гиперекспрессия miR-133a-3p или даунрегуляция PSAT1 сдерживают повреждение эндотелиальных клеток и способствуют их пролиферации через ингибирование пути GSK3β/β-катенин при ИЧА. miR-133a-3p может стать перспективным маркером и терапевтической мишенью для ИЧА.

Представление гипотезы

В данном исследовании мы предполагали, что ось miR-133a-3p/PSAT1 может влиять на эндотелиальный урон, индуцирующий ИЧА, через модуляцию пути GSK3β/β-катенин.

Проверка гипотезы

Для верификации гипотезы мы собрали клинические образцы, эндотелиальные клетки (ЭК) человека с ИЧА и создали крысиные модели ИЧА, чтобы разъяснить функции miR-133a-3p и PSAT1 в процессе развития ИЧА.

Значение гипотезы

Наше исследование подтвердило гипотезу: гиперекспрессия miR-133a-3p или даунрегуляция PSAT1 сдерживают эндотелиальный урон и стимулируют пролиферацию ЭК через ингибирование пути GSK3β/β-катенин при ИЧА. Эти результаты открывают новый взгляд на мишень для терапии ИЧА.

Введение

Внутричерепная аневризма (ИЧА) — цереброваскулярное заболевание, характеризующееся патологическим выпячиванием мозговой артерии и субарахноидальным кровоизлиянием (САК) при разрыве аневризмы, несущим высокую летальность и инвалидность. Несмотря на тяжесть заболевания, его патогенез до конца не ясен. ИЧА бывает семейной, но чаще рассматривается как результат приобретённого сосудистого повреждения под действием гипертонии, курения и других факторов риска. Эндоваскулярная спирализация или микрохирургическое клипирование применяют для профилактики разрыва неразорванных аневризм у пациентов с высоким риском. Несмотря на прогресс в хирургии, послеоперационное восстановление часто остаётся неудовлетворительным. Сложность лечения ИЧА делает необходимым дальнейшее изучение механизмов и поиск новых терапевтических стратегий.

МикроРНК (miRNA) — класс некодирующих РНК, модулирующих экспрессию мишеневых генов путем ингибирования трансляции на посттранскрипционном уровне или посредством деградации мРНК. Показано, что miR-133a-3p выступает супрессором опухолей в нескольких злокачественных неоплазиях, и его гиперекспрессия ингибирует рост клеток колиоректального рака (КРК). Предыдущее исследование показало, что miR-133a-3p, блокируя аутофагию-опосредованный глутаминолиз, подавляет метастазирование и рост желудочного рака. Также miR-133a-3p участвует в регуляции развития сердца и кардиальной гипертрофии. Исследование демонстрировало, что урегуляция miR-195-5p снижает ангиогенез и резистентность к цисплатину при раке яичника через подавление PSAT1-зависимого пути GSK3β/β-катенин. Другое исследование сообщает, что miR-365 ингибирует инвазию и рост клеток плоскоклеточного рака пищевода (ПКП) через модуляцию PSAT1. PSAT1 — фермент серинового биосинтеза, изначально выделенный из мозгов овец и высокоэкспрессируемый во многих тканях. Документировано, что PSAT1 медиатирует прогрессию клеточного цикла при раке молочной железы через модуляцию пути GSK3β/β-катенин. Лю и соавт. также указывают, что PSAT1 влияет на развитие ПКП и прогнозирует неблагоприятный исход, поэтому может быть перспективной мишенью для антиопухолевой терапии. Учитывая вышеизложенное, данное исследование призвано внести вклад в понимание функциональной роли оси miR-133a-3p/PSAT1/GSK3β/β-катенин при ИЧА.

Материалы и методы

Этическое заявление

Исследование одобрено Этического комитетом Первого клинического больницы Тяньцзинского университета традиционной китайской медицины. Все участники подписали информированное согласие. Все эксперименты на животных соответствовали Руководству по уходу и использованию лабораторных животных Международных комитетов.

Объекты исследования

С января 2016 по март 2018 г. отобрали случаи САК, вызванные ИЧА, леченные в неврохрургии Первого клинического больницы Тяньцзинского университета ТКМ. Патологические образцы 75 случаев ИЧА, полученные при микрохирургии, сформировали группу ИЧА (29 мужчин, 46 женщин, 31–55 лет, средний возраст 44,98 ± 6,79 лет). Пациенты с черепно-мозговыми травмами, оперированные в тот же период, образовали контрольную группу. Также собрали 75 образцов нормальных внутричерепных артериол при травматических операциях или декомпрессии (43 мужчины, 32 женщины, 34–56 лет, средний возраст 48,14 ± 8,68 лет). Исключали пациентов с анамнезом гипертонии, диабета или опухолей. Статистически значимых различий по полу и возрасту между группами не было (оба P > 0,05).

Обработка и сохранение образцов

После ресекции часть образцов в обеих группах фиксировали формальдегидом, обезвоживали градиентными спиртами и парафинизировали. Затем делали срезы для гемоксилин-эозиновой (ГЭ) окраски и иммуногистохимической окраски. Часть образцов быстро помещали в жидкий азот, затем переносили в холодильник –80 °C для вестерн-блоттинга и РТ-количественного ПЦР. Часть фиксировали глютаральдегидом для электронной микроскопии, а часть использовали для изоляции ЭК.

Электронная микроскопия

Образцы фиксировали 3% глютаральдегидом, затем рефиксировали 1% тетраоксидом осмия. Обезвоживали ацетоном, включали в Эпон812, резали полутонкие срезы толщиной 3 мкм. Двойную окраску уранилацетатом и цитратом свинца наблюдали на передаточном электронном микроскопе H-600IV (Hitachi, Токио, Япония).

ГЭ-окраска

Парафиновые срезы термостатировали при 60 °C 30 мин. Затем фиксировали в ксилоле, обезвоживали градиентным абсолютным спиртом, промывали фосфатно-буферным раствором (ФБР). Окрашивали гемоксилином, обрабатывали аммиаком несколько секунд, окрашивали эозином 2 мин, обезвоживали, прозарачивали. Накрывали нейтральным бальзамом и стеклами. Наблюдали и фиксировали изображения на микроскопе (Nikon, Токио, Япония).

Иммуногистохимическая окраска

Набор для иммуногистохимии от Zymed Laboratories (Сан-Франциско, США). Парафиновые срезы депарафинизировали и гидратировали: ксилол 5 мин × 3 раза, 100% спирт 3 мин × 2 раза, затем 95–75% спирт по 3 мин. После депарафинизации инкубировали с 3% перекисью водорода 15 мин для инактивации эндогенной пероксидазы. Наносили блокирующий раствор и инкубировали с рабочим раствором нормального козьего сывороточного белка 15 мин, затем — с первичными антителами против MMP-9 (5 мкг/мл) и VEGF (1:250, Abcam, Кембридж, США) (ФБР для негативного контроля) 1–2 ч. Затем инкубировали с биотинилированным вторичным антителом 30–60 мин. Добавляли стрептавидн-пероксидазный комплекс, капали свежеприготовленным раствором диамино Бензидина (DAB), контрастировали и фиксировали. Изображения получали системой Nikon SPOT FlexTM. Площадь экспрессии белков MMP-9 и VEGF измеряли программой иммуногистохимического количественного анализа. В каждом образце случайно выбирали 5 полей высокого увеличения в зоне накопления положительных клеток, средняя абсорбция использовалась как среднее значение для статистики.

Изоляция и культура ЭК

ЭК изолировали из нормальных тканей внутричерепных артериол и тканей ИЧА. Ткань резали на фрагменты 3 мм² и инкубировали 25 мин в 0,1% коллагеназе B / 0,1% диспазе (Roche, Базель, Швейцария). Ткань механоразрушали пипеткой 2 мл 2 мин, фильтровали через ситечко 100 мкм (BD Biosciences, NJ, США) для изоляции ЭК. Клеточную суспензию центрифугировали и ресуспендировали в среде MV2 с факторами роста и 20% фетовой бычьей сыворотки (PromoCell, Хайдельберг, Германия). Посевали клетки на посудины, покрытые фибронектином (Sigma Aldrich, St. Louis, США) с плотностью 10⁴ клеток/см² (1 мкг/см²) и выращивали 1 сутки при 5% CO₂. На следующий день промывали ФБР для удаления неадгерировавших клеток и заменяли среду. При достижении 80–100% конфлюэнтности проводили иммуносепарацию Ulex europaeus Agglutinin I (UEA)-покрытыми бусинами (Dynabeads M-450 Tosylactivated, Oxoid, Hampshire, UK) для получения чистой популяции ЭК. ЭК, связанные с лектиновыми бусинами, собирали магнитным концентратором, несвязанные удаляли двойным промыванием базальной средой. UEA-позитивные клетки ресуспендировали в культурной среде и посевали на фибронектиновые посудины для улучшения адгезии и роста. Культуры достигали конфлюэнтности за 4–6 дней.

Идентификация ЭК

ЭК идентифицировали иммуноцитохимической окраской с антителами к поверхностному маркеру CD31 и антигену, связанному с фактором VII. Клетки промывали ФБР дважды, фиксировали 4% параформальдегидом, инкубировали с 3% H₂O₂ 10–15 мин для инактивации эндогенной пероксидазы, затем с 0,1% Triton X-100 10 мин для пермеабилизации. Наносили первичные антитела: Фактор VII (1:200), CD31 (1:400, Roche, Базель, Швейцария) и инкубировали при 4 °Covernight. Затем наносили вторичное антитело к иммуноглобулину G (1:50), маркированное перекисным ферментом. Инкубировали при 37 °C 45 мин, развивали DAB в темноте 4 мин. Останавливали окраску дистиллированной водой, фотографировали под микроскопом. Наблюдали под флуоресцентным инвертированным фазово-контрастным микроскопом, считали положительные и общее число клеток в 10 случайных полях. Коэффициент положительной окраски = (число положительных клеток / общее число клеток) × 100%. Соответствующую контрольную группу организовывали заменой первичного антитела на ФБР, остальные этапы аналогичны.

Группировка и трансфекция клеток

Для изучения взаимодействия miR-133a-3p и PSAT1 в ЭК ИЧА, клетки разделили на группы: контрольная (нормальные сосудистые ЭК без трансфекции), группа ИЧА (ЭК ИЧА без трансфекции), mimic NC (трансфицированы мимиком NC miR-133a-3p), miR-133a-3p mimic (трансфицированы мимиком miR-133a-3p), si-NC (трансфицированы si-PSAT1 NC), si-PSAT1 (трансфицированы si-PSAT1), miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 (ко-трансфекция miR-133a-3p mimic и oe-PSAT1). Mimic NC, miR-133a-3p mimic, si-PSAT1, si-NC, oe-PSAT1 разработала и синтезировала GenePharma Co., Ltd. (Шанхай, Китай). Трансфекцию проводили строго по протоколу реагента Lipofectamine^TM 2000 (Thermo Fisher Scientific, MA, США).

Цитометрия потока

Среду из посудин удаляли, клетки промывали ФБР дважды. Отделяли 0,25% трипсином, центрифугировали 800 об/мин 5 мин, ресуспендировали в 1× binding buffer, концентрацию регулировали до 1×10⁷ клеток/мл. 100 мкл суспензии инкубировали с 5 мкл Пропидиевого йодида (PI, 20 мкг/мл) и annexin V-FITC 20 мин, затем добавляли 400 мкл 1× binding buffer. Цитометром потока (BD FACSArial I) определяли апоптоз в течение 1 ч. На диаграмме рассеяния: левый нижний квадрант (Q4) — живые клетки (FITC⁻/PI⁻), правый нижний (Q3) — ранняя апоптоз (FITC⁺/PI⁻), правый верхний (Q2) — поздняя апоптоз и мёртвые клетки (FITC⁺/PI⁺); уровень апоптоза = % Q3 + % Q2.

MTT-тест

Клетки трипсинизировали для получения суспензии. Считали в инвертированном микроскопе. Концентрацию регулировали до 5×10⁴ клеток/мл. Посевали в 96-колодчатую пластинку. Через 48 ч инкубировали с 20 мкл MTT-раствора 4 ч. MTT в каждой колодке растворяли 150 мкл диметилсульфоксида. Оптическую плотность (OD) измеряли на длине волны 570 нм. Пролиферативную активность ЭК рассчитывали по OD.

Тест «почеса» (scratch test)

Клетки каждой группы посевали в 24-колодчатую пластинку по 2×10⁵ клеток/колодку. В каждой группе 3 параллельные колодки. При достижении ~90% конфлюэнтности клеточный монолейстр царапали стерильным одноразовым кончиком микропипетки 1 мл; в каждой колодке одна царапина одинаковой длины и глубины. После царапания удаляли отсоединившиеся клетки, меняли среду на свежую, через 24 ч культуры оценивали заживление царапины под микроскопом. Площадь заживления измеряли программой National Instrument Vision Assistant 8.6. Миграция клеток = площадь заживления / площадь исходной царапины × 100%.

Экспериментальные животные и создание модели ИЧА у крыс

Отобрали 84 крысы линии Sprague-Dawley (SD) возрастом 7 недель, массой 180–200 г (Центр лабораторных животных, Академия военных медицинских наук, Пекин, Китай). Содержали в вивариуме при 22–25 °C, влажности 50–60%, естественное освещение. По 4 крысы в стандартную клетку. Вода и корм стандартные. Подстилку меняли каждые 3 дня, клетки мыли и стерилизовали. Модель ИЧА создавали по протоколу [15]. Разрыв аневризмы диагностировали по следующим симптомам [16]: 1) снижение пития/питания с потерей ~10% массы за 24 ч; 2) сгибание туловища и передних конечностей при подъёме; 3) ходьба с боком при нормальной позе; 4) наклон к боку в покое, отсутствие спонтанной активности. Крысы с этими симптомами эвтаназировали через 3 месяца после операции. Ткани ИЧА получали во время операции, перекачивали ФБР, затем перфузировали синий краситель с глутаминовой кислотой в мозговые артерии.

Лечение и интервенция крыс с ИЧА

84 крысы случайно разделили на 7 групп по 12 особей. Методы лечения: нормальная группа (без моделирования); группа ИЧА (стереотаксическая инъекция 100 мкл смеси ФБР и Lipofectamine 2000); mimic NC (100 мкл смеси miR-133a-3p mimic NC и Lipofectamine 2000); miR-133a-3p mimic (100 мкл смеси miR-133a-3p mimic и Lipofectamine 2000); si-NC (100 мкл смеси si-PSAT1 NC и Lipofectamine 2000); si-PSAT1 (100 мкл смеси si-PSAT1 и Lipofectamine 2000); miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 (100 мкл смеси miR-133a-3p mimic, oe-PSAT1 и Lipofectamine 2000). Все инъекции делали 1 раз в сутки, крысы содержали в SPF-вивариуме 12 недель. По истечении 12 недель крыс нааркозировали, открывали грудную клетку. Через левый желудочек интубировали аорту, выпускали кровь перерезав полую вену. Одновременно перфузировали 30 мл физиологического раствора с гепарином натрия (37 °C), затем медленно вводили 10% полиформальдегид/0,1 М фосфатный буфер (pH 7,4) в мозг. После фиксации перфузией открывали череп, отдечали и удаляли артериальное кольцо у основания черепа под операционным микроскопом, оценивали изменения аневризм и патологические признаки. Mimic NC, miR-133a-3p mimic, si-NC, si-PSAT1, oe-PSAT1 синтезировала Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd. (Шанхай, Китай).

Определение гемодинамики

Скорость кровотока в конце левой общей сонной артерии измеряли за 3 дня до операции и через 12 недель после интервенции. Крысу помещали в раму анестезиологического аппарата для вдыхания, настраивали параметры. После стабилизации дыхания и отсутствия реакции на прикосновение к хвосту, фиксировали крысу на операционном столе резиновыми лентами. Стригли шерсть на шее электрическим бритвой. Включали цветной допплеровский ультразвуковой детектор, измеряли скорость кровотока в конце левой общей сонной артерии после нанесения контактного геля. После измерения аккуратно возвращали крысу в клетку до пробуждения от анестезии.

РТ-количественный ПЦР

Общую РНК извлекали по протоколу набора RNA simple total RNA extraction kit (TIANGEN Biotechnology, Пекин, Китай). Качество РНК подтверждали УФ-анализом и электролорезом в формальдегидном геле. РНК реверсно транскрибировали в кДНК набором PrimeScript RT reagent Kit. ПЦР проводили с SYBR Premix Ex Taq^II (Takara, Далянь, Китай). Праймеры разработала и синтезировала Beijing ComWin Biotech Co., Ltd. (Пекин, Китай) (таблица 1). U6 использовали как внутренний контроль для miR-133a-3p; PSAT1, GSK3β, β-катенин, Bax, Bcl-2, Ki-67, CyclinD1 — с GAPDH. Данные обрабатывали методом 2^−ΔΔCt.

Вестерн-блоттинг

Общие белки извлекали из клеток и тканей, концентрацию определяли набором BCA (Beyotime Institute of Biotechnology, Шанхай, Китай). Образцы смешивали с 1/4 объёма 5× образцового буфера и кипятили 5 мин. Электрофорез в 10% разделяющем и 5% концентрирующем гелях. Мембрану блокировали 5% обезжиренным сухим молоком 60 мин. Инкубировали с первичными антителами: PSAT1 (1:500), GSK3β (1:500), β-катенин (1:5000), Bax (1:1000), Bcl-2 (1:1000), CyclinD1 (1:200), Ki-67 (1:5000), MMP-9 (1 мкг/мл), VEGF (1:1000) (все Abcam, Кембридж, США). Затем инкубировали с вторичным антителом (1:2000) 60 мин. Мембрану погружали в хемилюминесцентный субстрат (Beyotime) 1 мин, накрывали пищевой плёнкой после удаления жидкости. Экспонировали на рентгеновской пленке, визуализировали после проявки и фиксации. GAPDH (1:10000, Abcam) использовали как контроль загрузки. Анализ изображений программой ImageJ2x.

Двойной люциферазный репортерный тест

Мишеневое взаимодействие miR-133a-3p и PSAT1 и сайт связывания miR-133a-3p с 3' некодирующей областью (3'UTR) PSAT1 предсказывали биоинформатическим сервисом (https://cm.jefferson.edu/rna22/Precomputed/). Последовательность промоторной области 3'UTR PSAT1, содержащая сайт связывания miR-133a-3p, амплифицировали и клонировали в плазму pGL3-basic luciferase (Takara Bio Inc., Оцу, Япония) для построения дикого типа (WT) плазмиды PSAT1 3'UTR (PSAT1-WT), а мутантную (MUT) рекомбинантную плазму PSAT1-MUT получили точечной мутацией сайта связывания miR-133a-3p на PSAT1-WT с набором для точечной мутации (Takara Bio Inc.). Васкулярные ЭК в логарифмической фазе роста посевали в 96-колодчатую пластинку. При достижении ~70% конфлюэнтности ко-трансфицировали плазмиды PSAT1-WT и PSAT1-MUT с mimic NC и miR-133a-3p mimic реагентом Lipofectamine 2000. Через 48 ч после трансфекции собирали клетки, лизировали и определяли люциферазную активность набором (Promega Corporation, Мэдисон, США).

Статистический анализ

Все данные обрабатывали в SPSS 21.0 (IBM Corp., Армонк, США). Качественные данные представлены частотами или процентами, анализ — хи-квадрат или точный тест Фишера. Количественные данные с нормальным распределением — среднее ± стандартное отклонение. Сравнение двух групп — t-тест Стьюдента, множественных групп — односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) с пост-хок тестом Тьюки. Различия считали значимыми при P < 0,05.

Результаты

Общие клинические данные пациентов с ИЧА

Как показано в таблице 2, сравнены общие данные группы ИЧА и контрольной группы. Детальная информация приведена в таблице 2.

Экспрессия miR-133a-3p связана с числом и размером ИЧА

Анализ связи экспрессии miR-133a-3p с клинико-патологическими признаками ИЧА (таблица 3) показал: по средней относительной экспрессии miR-133a-3p в ИЧА 75 случаев разделили на группу высокой экспрессии (n = 47) и низкой экспрессии (n = 28). Статистический анализ хи-квадратом или точным тестом Фишера выявил, что экспрессия miR-133a-3p не связана с возрастом, полом, формой и локализацией аневризмы (все P > 0,05), но ассоциирована с числом и размером аневризм (оба P < 0,05).

В тканях ИЧА экспрессия miR-133a-3p снижена, а PSAT1, GSK3β и β-катенин — повышена

РТ-количественный ПЦР показал, что по сравнению с нормальными тканями внутричерепных артериол (контроль), экспрессия miR-133a-3p в тканях ИЧА (группа ИЧА) понижена (P < 0,05) (рис. 1a). РТ-количественный ПЦР и вестерн-блоттинг продемонстрировали, что экспрессия PSAT1, GSK3β и β-катенина в тканях ИЧА повышена относительно нормы (все P < 0,05) (рис. 1a–c).

Экспрессия miR-133a-3p снижена, а PSAT1, GSK3β и β-катенин — повышены в тканях ИЧА. a Экспрессия miR-133a-3p, PSAT1, GSK3β и β-катенина в группе ИЧА и контрольной группе. b Белковые полосы экспрессии PSAT1, GSK3β и β-катенина. c Белковая экспрессия PSAT1, GSK3β и β-катенина в группе ИЧА и контрольной группе по вестерн-блоттингу. n = 75, *P < 0,05 vs. контрольная группа. Данные представлены как среднее ± СД, сравнение двух групп — независимый t-тест Стьюдента.

Патологические изменения аневризмы и экспрессия MMP-9 и VEGF в тканях ИЧА

При прямом осмотре нормальных тканей внутричерепных артериол и тканей ИЧА установлено: в контрольной группе сосуды в артериальных тканях ярко-красные, в просвете нет явных атеросклеротических бляшек и париетальных тромбов. Ткани аневризмы группы ИЧА в основном буро-красные или темно-красные, форма мешковидная или веретеновидная, консистенция преимущественно плотная. При вскрытии аневризмы на стенке некоторых образцов обнаруживали белые или темно-красные атеросклеротические бляшки (плоские, круглые или овальные). В некоторых образцах в полости аневризмы находился париетальный тромб мягкой консистенции. Толщина стенки аневризмы постепенно уменьшалась от основания к вершине, в некоторых случаях на вершине оставалась только тонкая фиброзная мембрана, иногда даже происходил разрыв. Разрыв локализовывал на вершине или в её непосредственной близости.

ГЭ-окраска показала: под световым микроскопом в контрольной группе толщина стенки нормальных внутричерепных артериол равномерна; анатомическая структура íntима, медии и адвентиции чётка и цела; морфология клеток каждого слоя нормальна; сарколеммы соседних клеток тесно соприкасаются; воспалительные клетки в стенке редки. В группе ИЧА в дистальной боковой полости у вершины бифуркации внутричерепной артерии формировались локальные выпячивания, стенка аневризмы становилась тупой и меньше, локально терялись ЭК. В небольшом числе образцов наблюдалась миграция гладкомышечных клеток из медии в интиму и миогенная интимная гиперплазия. ЭК уменьшались или исчезали. Интимный слой состоял из гиперпластических миоинтимных клеток и линейно расположенных ЭК, или апоптотических ЭК и клеток крови, прикреплённых к просвету. Васкуольная дегенерация и прерывистость. Некоторые отслаивались вместе с базальной мембраной, интимные коллагеновые волокна нарастали. Атеросклеротическая перестройка, артериоловая стенка явственно утолщалась и заполнялась большим количеством соединительно-тканевых структур. Воспалительная инфильтрация и диффузное поражение наблюдались во всех слоях, преимущественно в медии и адвентиции. В некоторых клетках видели липидные и холестериновые кристаллические отложения. Некоторые стенки аневризм полностью или локально были утолщены и наружно выпячены (рис. 2a, b).

Патологические изменения аневризмы и экспрессия MMP-9 и VEGF при ИЧА. a Срезы нормальных внутричерепных артериол контрольной группы при ГЭ-окраске (×10). b Срезы тканей ИЧА при ГЭ-окраске (×10). c Ультроструктура нормальных внутричерепных артериол контрольной группы под электронным микроскопом (×10 000). d Ультроструктура тканей ИЧА под электронным микроскопом (×10 000). e Экспрессия MMP-9 в контрольной группе и группе ИЧА иммуногистохимической окраской (×200). f Экспрессия VEGF в контрольной группе и группе ИЧА иммуногистохимической окраской (×200)

Срезы нормальных внутричерепных артериол и тканей ИЧА рассматривали электронным микроскопом: в норме чётко визуализировались матриксные волокна сосудистой стенки, без эндотелиального урона, пикноза или дегенерации клеток. В тканях ИЧА наблюдали явный эндотелиальный урон, пикноз и васкуольную дегенерацию клеток, число гладкомышечных клеток медии снижено, большинство ядер пикнотичны, видны хроматиновые агрегаты и апоптотические тела. Некоторые клетки показывали набухание митохондрий и исчезновение нормальной внутренней структуры. Внеклеточный матриц, формирующий цитскелет, был размыт и представлял аморфные хлопья. В местах потери клеток находилось много фрагментов (рис. 2c, d).

Иммуногистохимической окраской определяли экспрессию MMP-9 и VEGF: в 75 случаях контрольной группы экспрессия MMP-9 и VEGF отсутствовала. В 75 случаях группы ИЧА положительная экспрессия MMP-9 выявлена в 60 случаях. MMP-9 позитивно окрашивался во внутрии и внешней мембранах стенки ИЧА, но неравномерно. Позитивная окраска — буро-жёлтое цитоплазма. Позитивная экспрессия VEGF — 66 из 75 случаев. В стенке ИЧА высокая позитивность в медии и адвентиции, низкая в интиме. Окраска также буро-жёлтое цитоплазма (рис. 2e, f). Экспрессия MMP-9 и VEGF в двух группах показана в таблице 4.

Идентификация сосудистых ЭК

Экспрессию фактора VIII и CD31 в ЭК анализировали иммуногистохимической окраской. Результаты: сосудистые ЭК положительно реагировали на антитела к фактору VIII и CD31-связанному антигену, положительный процент — 95%. Кроме того, в цитоплазме наблюдалось множество бурых гранул, и при 5-м пассаже интенсивность бурой окраски была драматически выше, чем при первом пассаже (рис. 3a, b).

Сосудистые ЭК позитивно реагируют на антитела к антигенам, связанным с FVIII и CD31. a Идентификация ЭК по CD31. b Идентификация ЭК по FVII

Гиперекспрессия miR-133a-3p и даунрегуляция PSAT1 подавляют апоптоз и стимулируют пролиферацию и миграцию ЭК при ИЧА

Цитометрию потока, РТ-количественный ПЦР и вестерн-блоттинг использовали для оценки апоптоза и экспрессии Bax и Bcl-2 в ЭК ИЧА после обработки miR-133a-3p mimic или si-PSAT1. Установлено: по сравнению с контролем, в группе ИЧА уровень апоптоза и экспрессия Bax повышены, а экспрессия Bcl-2 снижена (все P < 0,05). Уровень апоптоза и экспрессия Bax/Bcl-2 в группах ИЧА, mimic NC и si-NC не имели значимых различий (все P > 0,05). По сравнению с группами si-NC и mimic NC, в группах si-PSAT1 и miR-133a-3p mimic уровень апоптоза снижен, экспрессия Bax понижена, а Bcl-2 повышена (все P < 0,05). По сравнению с группой miR-133a-3p mimic, в группе miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 уровень апоптоза и экспрессия Bax повышены, а экспрессия Bcl-2 снижена (все P < 0,05) (рис. 4a–e).

Высокая экспрессия miR-133a-3p и низкая экспрессия PSAT1 ингибируют апоптоз и стимулируют пролиферацию и миграцию ЭК ИЧА. a Определение апоптоза ЭК цитометрией потока. b Уровень апоптоза ЭК в каждой группе. c Экспрессия Bax и Bcl-2 в ЭК по РТ-количественному ПЦР. d Белковые полосы Bax и Bcl-2. e Белковая экспрессия Bax и Bcl-2 в ЭК по вестерн-блоттингу. f MTT-тест пролиферативной активности ЭК в каждой группе. g РТ-количественный ПЦР экспрессии Ki-67 и CyclinD1 в ЭК каждой группы. h Белковые полосы Ki-67 и CyclinD1. i Белковая экспрессия Ki-67 и CyclinD1 в ЭК по вестерн-блоттингу. j Определение миграции ЭК в каждой группе тестом «почеса». k Статистические результаты миграции ЭК в каждой группе. N = 3, *P < 0,05 vs. контрольная группа. #P < 0,05 vs. mimic NC. &P < 0,05 vs. si-NC. +P < 0,05 vs. miR-133a-3p mimic. Данные — среднее ± СД; оценка — односторонний ANOVA с пост-хок тестом Тьюки.

MTT-тест, РТ-количественный ПЦР и вестерн-блоттинг использовали для оценки пролиферации и экспрессии Ki-67 и CyclinD1 в ЭК ИЧА после обработки miR-133a-3p mimic или si-PSAT1. Показано: в отличие от контрольной группы, в группе ИЧА пролиферативная активность и экспрессия Ki-67 и CyclinD1 снижены (все P < 0,05). В группах ИЧА, mimic NC и si-NC пролиферативная активность и экспрессия Ki-67 и CyclinD1 не отличались значимо (все P > 0,05). Относительно групп si-NC и mimic NC, в группах si-PSAT1 и miR-133a-3p mimic пролиферативная активность и экспрессия Ki-67 и CyclinD1 повышены (все P < 0,05). В сравнении с группой miR-133a-3p mimic, в группе miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 пролиферативная активность и экспрессия Ki-67 и CyclinD1 снижены (все P < 0,05) (рис. 4f, i).

Миграцию ЭК в каждой группе через 24 ч после обработки miR-133a-3p mimic или si-PSAT1 оценивали тестом «почеса». Выявлено: миграция клеток в группе ИЧА ингибирована относительно контроля (P < 0,05). В группах ИЧА, si-NC и mimic NC миграция не менялась значимо (все P > 0,05). По сравнению с группами si-NC и mimic NC, в группах si-PSAT1 и miR-133a-3p mimic миграция клеток повышена (оба P < 0,05). Относительно группы miR-133a-3p mimic, в группе miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 миграция снижена (P < 0,05) (рис. 4j, k).

Восстановление miR-133a-3p и депрессия PSAT1 снижают экспрессию PSAT1, GSK3β и β-катенина в ЭК ИЧА

РТ-количественный ПЦР определил экспрессию miR-133a-3p в ЭК ИЧА: по сравнению с контролем, в группе ИЧА экспрессия miR-133a-3p снижена (P < 0,05). В группах ИЧА, mimic NC и si-NC экспрессия miR-133a-3p не менялась значимо (P > 0,05). В группе miR-133a-3p mimic экспрессия miR-133a-3p повышена относительно mimic NC (P < 0,05). В отличие от si-NC, в группе si-PSAT1 экспрессия miR-133a-3p не менялась значимо (P > 0,05). По сравнению с группой miR-133a-3p mimic, в группе miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 экспрессия miR-133a-3p не имела значимых отличий (P > 0,05) (рис. 5a).

Урегуляция miR-133a-3p и даунрегуляция PSAT1 снижают экспрессию PSAT1, GSK3β и β-катенина в ЭК ИЧА. a Экспрессия miR-133a-3p, PSAT1, GSK3β и β-катенина в ЭК по РТ-количественному ПЦР. b Белковые полосы PSAT1, GSK3β и β-катенина. c Белковая экспрессия PSAT1, GSK3β и β-катенина в ЭК каждой группы по вестерн-блоттингу. N = 3, *P < 0,05 vs. контрольная группа. #P < 0,05 vs. mimic NC. &P < 0,05 vs. si-NC. +P < 0,05 vs. miR-133a-3p mimic. Данные — среднее ± СД; оценка — односторонний ANOVA с пост-хок тестом Тьюки.

Экспрессию PSAT1, GSK3β и β-катенина в ЭК ИЧА проверяли вестерн-блоттингом и РТ-количественным ПЦР. Установлено: относительно контроля, в группе ИЧА экспрессия PSAT1, GSK3β и β-катенина повышена (все P < 0,05). В группах ИЧА, mimic NC и si-NC экспрессия PSAT1, GSK3β и β-катенина не менялась драматически (все P > 0,05). В группах miR-133a-3p mimic и si-PSAT1 экспрессия PSAT1, GSK3β и β-катенина снижена относительно mimic NC и si-NC (все P < 0,05). Относительно группы miR-133a-3p mimic, в группе miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 экспрессия PSAT1, GSK3β и β-катенина повышена (все P < 0,05) (рис. 5a–c).

Гиперекспрессия miR-133a-3p и даунрегуляция PSAT1 смягчают патологические изменения тканей ИЧА

Гемодинамические изменения крыс после моделирования отслеживали скоростью кровотока в каждой группе за 3 дня до операции и через 12 недель после интервенции. Установлено: за 3 дня до операции скорость кровотока в группах не отличалась значимо (P > 0,05). Через 12 недель интервенции скорость кровотока в группе ИЧА снизилась относительно нормальной группы (P < 0,05). Степень снижения скорости кровотока в группах ИЧА, mimic NC, si-NC и miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 не имела значимых различий (все P > 0,05). По сравнению с группами si-NC и mimic NC, в группах miR-133a-3p mimic и si-PSAT1 скорость кровотока повысилась (оба P < 0,05). В противовес группе miR-133a-3p mimic, в группе miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 скорость кровотока снизилась (P < 0,05) (рис. 6a).

Гиперекспрессия miR-133a-3p и даунрегуляция PSAT1 смягчают патологические изменения тканей ИЧА. a Гемодинамические изменения в каждой временной точке после успешного моделирования у крыс. b Изменения тканей ИЧА после трансфекции. n = 12, *P < 0,05 vs. нормальная группа. #P < 0,05 vs. mimic NC. &P < 0,05 vs. si-NC. +P < 0,05 vs. miR-133a-3p mimic. Данные — среднее ± СД; оценка — односторонний ANOVA с пост-хок тестом Тьюки.

Изменения тканей ИЧА верифицировали ГЭ-окраской. Результаты: в нормальной группе эластические волокна медии внутричерепных сосудов упорядочены, нормальная волнистая структура эластина присутствует, разрывов и деградации нет. Относительно нормы, в группе ИЧА просвет внутричерепных сосудов расширен, волнистая структура эластина исчезла, эластические волокна медии локально разорваны, некоторые эластические волокна полностью деградировали. В группах si-NC, mimic NC, ИЧА и miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 морфология тканей ИЧА не имела явных отличий. В противовес группам si-NC и mimic NC, в группах miR-133a-3p mimic и si-PSAT1 волнистая структура эластина внутричерепных сосудов крыс сохранялась, локальная структура эластических волокн была незначительно нарушена, но без разрыв и растворения (рис. 6b).

Высокая экспрессия miR-133a-3p и низкая экспрессия PSAT1 снижают экспрессию PSAT1, GSK3β, β-катенина, VEGF и MMP-9 в тканях ИЧА in vivo

Экспрессию miR-133a-3p в тканях ИЧА in vivo определяли РТ-количественным ПЦР: относительно нормальной группы, в группе ИЧА экспрессия miR-133a-3p снижена (P < 0,05). В группах ИЧА, mimic NC и si-NC экспрессия miR-133a-3p не менялась очевидно (все P > 0,05). В группе miR-133a-3p mimic экспрессия miR-133a-3p повышена относительно mimic NC (P < 0,05). По сравнению с si-NC, в группе si-PSAT1 экспрессия miR-133a-3p не имела выраженных изменений (P > 0,05). Относительно группы miR-133a-3p mimic, в группе miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 экспрессия miR-133a-3p не показывала значимых отличий (P > 0,05) (рис. 7a).

Гиперекспрессия miR-133a-3p и низкая экспрессия PSAT1 снижают экспрессию PSAT1, GSK3β, β-катенина, VEGF и MMP-9 в тканях ИЧА in vivo и PSAT1 является мишеневым геном miR-133a-3p. a Определение экспрессии miR-133a-3p, PSAT1, GSK3β и β-катенина в тканях ИЧА крыс каждой группы РТ-количественным ПЦР. b Белковые полосы PSAT1, GSK3β и β-катенина. c Белковая экспрессия PSAT1, GSK3β и β-катенина в тканях ИЧА крыс каждой группы вестерн-блоттингом. d Белковые полосы VEGF и MMP-9. e Белковая экспрессия VEGF и MMP-9 в тканях ИЧА крыс каждой группы вестерн-блоттингом. f Предсказание сайта связывания PSAT1 с соответствующим miR-133a-3p Target Scan. g Результат двойного люциферазного репортерного теста. a–e, n = 12; f–g, N = 3, *P < 0,05 vs. нормальная группа/группа Wt + NC. #P < 0,05 vs. mimic NC. &P < 0,05 vs. si-NC. +P < 0,05 vs. miR-133a-3p mimic. Данные — среднее ± СД; оценка — односторонний ANOVA с пост-хок тестом Тьюки.

Экспрессию PSAT1, GSK3β и β-катенина в тканях ИЧА in vivo проверяли вестерн-блоттингом и РТ-количественным ПЦР. Установлено: в отличие от нормальной группы, в группе ИЧА экспрессия PSAT1, GSK3β и β-катенина повышена (все P < 0,05). В группах ИЧА, mimic NC и si-NC экспрессия PSAT1, GSK3β и β-катенина не менялась заметно (все P > 0,05). В группах miR-133a-3p mimic и si-PSAT1 экспрессия PSAT1, GSK3β и β-катенина снижена по сравнению с mimic NC и si-NC (все P < 0,05). Относительно группы miR-133a-3p mimic, в группе miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 экспрессия PSAT1, GSK3β и β-катенина повышена (все P < 0,05) (рис. 7a–c).

Вестерн-блоттингом верифицировали экспрессию VEGF и MMP-9 в тканях ИЧА in vivo: по сравнению с нормальной группой, в группе ИЧА экспрессия VEGF и MMP-9 повышена (оба P < 0,05). В группах ИЧА, mimic NC и si-NC экспрессия VEGF и MMP-9 не менялась очевидно (все P > 0,05). Относительно групп mimic NC и si-NC, в группах miR-133a-3p mimic и si-PSAT1 экспрессия VEGF и MMP-9 снижена (все P < 0,05). По сравнению с группой miR-133a-3p mimic, в группе miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 экспрессия VEGF и MMP-9 повышена (все P < 0,05) (рис. 7d, e).

PSAT1 является мишеневым геном miR-133a-3p

Онлайн-сервис (https://cm.jefferson.edu/rna22/Precomputed/) использовали для предсказания и анализа сайта связывания PSAT1 с miR-133a-3p и последовательности 3'UTR, связываемой PSAT1 и miR-133a-3p. Для доказательства того, что предсказанный сайт связывания miR-133a-3p вызывает изменение люциферазной активности, спроектировали мутантную и дикую последовательности 3'UTR PSAT1 с делецией сайта связывания miR-133a-3p. Люциферазную активность определяли ко-трансфекцией miR-133a-3p mimic и WT (Wt-miR-133a-3p/PSAT1) или MUT (Mut-miR-133a-3p/PSAT1) рекомбинантных плазмид в васкулярных ЭК. Результаты: miR-133a-3p mimic не оказывал явного влияния на люциферазную активность в группе Mut-miR-133a-3p/PSAT1 (P > 0,05), тогда как в группе Wt-miR-133a-3p/PSAT1 люциферазная активность была значимо снижена (P < 0,05) (рис. 7f, g).

Обсуждение

ИЧА — патологическое расширение внутричерепной артерии, которое ослабляет сосудистую стенку, постоянно давя на неё наружу, что повышает риск разрыва аневризмы. В исследовании Лю и соавт. показано, что некоторые miRNA участвуют в модуляции пролиферации васкулярных гладкомышечных клеток, что тесно связано с ИЧА. Также недавнее исследование доказало, что циркулирующие miRNA могут служить новыми биомаркерами для оценки вероятности ИЧА у лиц высокого риска. Обычно считают, что PSAT1 может участвовать в состояниях шизофренического спектра и изменять сериновый обмен. Текущее исследование предназначено для изучения регуляторной роли miR-133a-3p, модулирующего эндотелиальный урон и запускающего ИЧА через сигнальный путь PSAT1/GSK3β/β-катенин.

В настоящем исследовании анализировали связь между экспрессией miR-133a-3p и клинико-патологическими признаками ИЧА. Результаты показали, что экспрессия miR-133a-3p не связана с возрастом, полом, формой и локализацией аневризмы, но ассоциирована с числом и размером аневризм. Некоторые ученые считают, что сдвиговая нагрузка регионального кровотока в сосудистой стенке индуцирует экспрессию моноцитарного хемоаттрактантного белка-1 (MCP-1) и макрофагного воспалительного белка 1α (MIP-1α) фибробластами и васкулярными ЭК внутри сосудистой стенки. Высокореактивные хемоаттрактанты MCP-1 и MIP-1α вызывают агрегацию макрофагов в сосудистой стенке и медиатируют воспалительный ответ, затем индуцируют возбуждение ядерного транскрипционного фактора c-Jun и регулируют активацию активированного белка-1 (AP-1), затем активируют промотор MMP-9 в его структурном домене, повышают экспрессию мРНК MMP-9 и, наконец, индуцируют диссоциацию внеклеточного матрикса сосудистой стенки, вызывая формирование внутричерепной аневризмы. Сайто и соавт. обнаружили, что MMP-9-позитивные клетки преимущественно происходят из макрофагов медии и адвентиции артерии, что подтвердило, что MMP-9, экспрессируемый макрофагами, медиатирует дегенерацию артериальной стенки, ведущую к формированию аневризмы артерии. Указанные исследования указывают на связь MMP-9 с формированием ИЧА. Результаты нашего исследования показали, что MMP-9 урегулирован при ИЧА; следовательно, мы предполагали, что miR-133a-3p может участвовать в возникновении и развитии ИЧА за счет регуляции пути PSAT1/GSK3β/β-катенин и дальнейшей регуляции MMP-9. В нашем исследовании мы обнаружили, что восстановление miR-133a-3p снижает экспрессию PSAT1, GSK3β, β-катенина и MMP-9 в тканях внутричерепной аневризмы. Мы планируем провести соответствующие исследования в будущем для верификации наших выводов.

Наше исследование дало весомые доказательства того, что экспрессия miR-133a-3p снижена, а PSAT1, GSK3β и β-катенин повышены при ИЧА. Накапливающиеся данные свидетельствуют о супрессивной роли miR-133a-3p в различных опухолях. Недавнее исследование показало, что экспрессия miR-133a-3p драматически снижена в тканях рака молочной железы по сравнению с нераковыми тканями. Другое исследование утверждает, что экспрессия miR-133a-3p понижена в тканях прогрессировавшего рака простаты (РП) относительно смежных нормальных тканей или доброкачественных поражений простаты, особенно при костных метастазах РП. Продвигающее действие PSAT1 в других заболеваниях описано в литературе. Сообщается, что экспрессия PSAT1 заметно повышена при раке легких немалоклеточного типа (РЛНК) и прогнозирует неблагоприятный исход у пациентов с РЛНК. Кроме того, PSAT1 считается самым сильно урегулированным геном в опухолях КРК и высокоэкспрессирующимся у пациентов с химиорезистентным течением. Показано, что активность GSK3β повышена в раковых тканях. Более того, уровень фосфорилирования GSK3β и экспрессия ядерного β-катенина также повышены, что указывает на участие пути GSK3β/β-катенин в регуляции остеопонтина.

Другие результаты наших данных показывают, что урегуляция miR-133a-3p и даунрегуляция PSAT1 подавляют апоптоз и стимулируют пролиферацию и миграцию ЭК ИЧА, снижают экспрессию VEGF и MMP-9 в тканях ИЧА. Ранее предполагалось, что гиперекспрессия miR-133a-3p сдерживает инвазию, рост и митоз клеток плоскоклеточного рака полости рта через таргетирование коллагена типа I альфа 1 (COL1A1). Сообщается, что высокая экспрессия miR-133a-3p может подавлять пролиферацию клеток ПКП, способствовать апоптозу и снижать миграцию и инвазию клеток ПКП через таргетирование COL1A1. Другое исследование верифицировало, что транзиентная урегуляция miR-133a-3p подавляет миграцию, инвазию и рост клеток рака желчного пузыря через прямое таргетирование рекомбинационного сигнального белка Jκ. Подобным образом, наше исследование предполагает, что miR-133a-3p реализует свою роль при ИЧА через таргетирование PSAT1. Показано, что гиперекспрессия PSAT1 усиливает рост клеток ПКП и инвазию в матригеле in vitro, а инъекция мышам клеток ПКП с высокой экспрессией PSAT1 индуцирует опухолевание in vivo. Другое исследование также сообщает, что PSAT1 высокоэкспрессируется и прогнозирует неблагоприятный исход у пациентов, а также усиливает туморогенез и пролиферацию in vivo и in vitro. Предыдущие исследования в целом подтверждают, что PSAT1 способствует прогрессии клеточного цикла, пролиферации и туморогенезу в экспериментах с потерей и приобретением функции. Указано, что ММП составляют серию ферментов, расщепляющих белковые субстраты на основе консервативного механизма, связанного с активацией водородной молекулы, связанной с активным центром, через Zn²⁺ ион. MMP-9 — отдельный протеаза, оказывающий огромное влияние на многие биологические процессы. Исследование утверждает, что MMP-9 повышен в группах аневризм по сравнению с контролем. Васкулярный эндотелиальный фактор роста-A (VEGF-A) признан ключевым модулятором эндаскулярного дифференцирования трофобласта. Исследование выявило, что подавление экспрессии PSAT1 ингибирует экспрессию VEGF, β-катенина и фосфорилирования GSK3β.

Заключение

Кратко подводя итог, наше исследование подтвердило гипотезу: гиперекспрессия miR-133a-3p или даунрегуляция PSAT1 сдерживают эндотелиальный урон и способствуют пролиферации эндотелиальных клеток через ингибирование пути GSK3β/β-катенин при ИЧА. Эти результаты дают новое понимание новой мишенной терапии для ИЧА. Эти выводы подчёркивают роль miR-133a-3p при ИЧА в контексте пути PSAT1/GSK3β/β-катенин. Однако однозначный вывод об эффектах miR-133a-3p и PSAT1 сделать нельзя из-за ограниченного числа исследований в этой области. Необходимо строгий мониторинг и адекватное отражение в будущих клинических испытаниях.

Доступность данных и материалов

Не применимо

Аббревиатуры

miR-133a-3p:

МикроРНК-133a-3p

IA:

Внутричерепная аневризма

PSAT1:

Фосфосерин-аминотрансфераза 1

GSK3:

β-гликоген-синтазе-киназа 3β

SAH:

Субарахноидальное кровоизлияние

MiRNAs:

МикроРНК

CRC:

Колиоректальный рак

ESCC:

Плоскоклеточный рак пищевода

HE:

Гемоксилин-эозин

PBS:

Фосфатно-буферный раствор

MMP:

Матриксный металлопротеаза

VEGF:

Васкулярный эндотелиальный фактор роста

NC:

Негативный контроль

DAB:

Диаминобензидин

FBS:

Фетовая бычья сыворотка

UEAI:

Ulex europaeus agglutinins I

PI:

Пропидиевый йодид

FITC:

Флуоресцеинизотиоцианат

DMSO:

Диметилсульфоксид

OD:

Оптическая плотность

SD:

Sprague-Dawley

SPF:

Специфический патоген-фри (беспатогенный)

GAPDH:

Глицеральдегид-фосфат-дегидрогеназа

BCA:

Бицинохиновая кислота

3′UTR:

3' некодирующая область

WT:

Дикий тип

MUT:

Мутант

ANOVA:

Дисперсионный анализ

NSCLC:

Рак легких немалоклеточный

VEGF-A:

Васкулярный эндотелиальный фактор роста-A