Наносистема GAL-GNR-siBRAF: таргетное подавление гена BRAF и фотоперамальная терапия для 억제 роста гепатомы

Аннотация

Рак печени — одно из самых распространенных злокачественных новообразований во всем мире. Ингибиторы RAF-киназы эффективны при лечении гепатоцеллюлярного карциномы (ГЦК); поэтому подавление пути BRAF/MEK/ERK стало новой терапевтической стратегией. Однако таргетные системы доставки в опухоль остаются серьезным препятствием для клинического применения. Галактоза (GAL) адресует асиалогликопротеиновый рецептор (ASGPR), высокоэкспрессируемый на клетках рака печени. В данном исследовании разработана новая мультифункциональная наноматериал GAL-GNR-siBRAF, состоящий из трех компонентов: GAL — как лиганд для таргетирования клеток гепатомы, золотые наностержни (GNR) — обеспечивающие фотоперамальный эффект под излучением в ближнем инфракрасном диапазоне, и siRNA, специфически подавляющий BRAF (siBRAF). Наноноситель GAL-GNR-siBRAF демонстрирует высокую загрузочную способность по siRNA и защищает его от деградации в сыворотке. По сравнению с необеспеченными золотыми наностержнями, GAL-GNR-siBRAF обладает более низкой биотоксичностью и более высокой эффективностью генного сайленсинга. Лечение GAL-GNR-siBRAF значительно снижает экспрессию BRAF и подавляет пролиферацию, миграцию и инвазию клеток гепатомы. Более того, комбинация фотоперамального эффекта и нокаута BRAF с помощью GAL-GNR-siBRAF эффективно индуцирует гибель опухолевых клеток. Таким образом, разработан новый тип таргетного мультифункционального наноматериала GAL-GNR-siBRAF для лечения рака печени, предлагающий новые подходы для клинических методов терапии.

Введение

Гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) — серьезная глобальная проблема здравоохранения [1]. Это шестое по частоте онкологическое заболевание в мире и третья причина онкологической смертности [2, 3]. Большинство случаев ГЦК регистрируется в Восточной Азии и сахара Африке, однако инцидентность растет в развитых странах: Франция, Великобритания, Япония, США [4]. Стандартное лечение ранней ГЦК — хирургическая ресекция; 5-летняя выживаемость после операции составляет 89–93% [5]. К сожалению, только 20–30% пациентов диагностируются на ранней стадии; большинство (>70%) обнаруживаются на поздних стадиях, когда операция невозможна. Альтернативы: трансплантация печени, транскатетерная артериальная хемоэмболизация (ТАХЭ) и системная химиотерапия [6]. Трансплантация ограничена донорским дефицитом, неполная эмболизация при ТАХЭ ведет к неудаче, системная химиотерапия дает тяжелые побочные эффекты и плохой прогноз. Следовательно, новые методы лечения ГЦК острейше нужны [7].

Сигнальный путь RAS/RAF играет ключевую роль в гепатокарциногенезе, а BRAF — один из главных онкогенов этого пути. Генетические изменения в этих генах вызывают каскадные нарушения. Аномальная активация RAS/RAF ассоциируется с неблагоприятным прогнозом [8]. BRAF — наиболее часто мутируемый ген в семье RAF, и таргетирование RAS/RAF пути — перспективная стратегия для терапии ГЦК [8–10]. Поскольку ингибитор RAF-киназы сорафениб показал эффективность при ГЦК, мутации BRAF стали приоритетной мишенью [8]. Особенно актуально таргетирование BRAF при продвинутой ГЦК, так как клиническое развитие сорафениба подтвердилось в Азии, Европе и США [11]. По сравнению с плацебо, сорафениб продлевает общую выживаемость [12–14]. Однако сорафениб имеет низкую опухоле-таргетную способность, вызывая побочные эффекты: гипертензию, алопецию, тошноту [15]. Необходимы препараты с высокой специфичностью к клеткам печени и блокирующие RAF.

Асиалогликопротеиновый рецептор (ASGPR), или рецептор галактозы печени, — С-тип лектин, экспрессирующийся на синусоидальной поверхности гепатоцитов [16]. ASGPR считается важной мишенью для печено-таргетных наноструктур, так как связывает, интернализирует и элиминирует вещества с терминальными остатками галактозы [17]. Несколько моносахаридов (галактоза, манноза, лактоза, N-ацетилгалактозамин, сиалиновая кислота) взаимодействуют с ASGPR с разной аффинностью; галактоза показывает наивысшую аффинность [18]. Благодаря сильной экспрессии на печеночных паренхиматозных клетках [19], рецептор имеет высокую аффинность к галактозе и галактозилированным пролекарствам/системам доставки. Наночастицы [20], мицеллы [21] и липосомы [22] с галактозой идентифицированы как гепатотаргетные доставки для гепатоцеллюлярных карциноидных клеток.

Золотые наностержни (GNR) — стержневидные золотые наночастицы с преимуществами как наноносов [23]. GNR обладают отличной биосовместимостью и используются для стабильной доставки siRNA [24]; имеют большую удельную площадь, позволяя гибкую модификацию таргетных адаптеров [25]; локализованный поверхностный плазмонный резонанс (LSPR) дает высокую фотоперамальную конверсию под NIR-облучением, делая GNR отличными фотоперамальными антиопухолевыми агентами [26]. Максимальная фотоперамальная эффективность достигается настройкой соотношения сторон GNR. Ин vitro и ин виво токсичность золотых наночастиц зависит от размера, заряда и покрытия поверхности [27]. Однако цетилтриметиламмоний бромид (CTAB), необходимый для синтеза GNR, обладает выраженной цитотоксичностью, ограничивая биологические приложения [28].

РНК-интерференция (RNAi) — перспективный подход к лечению рака, эффективно нокаутирующий или сайленсящий целевые гены с помощью малых интерференционных РНК (siRNA) [29]. Недавно siRNA вошли в фазу клинических испытаний и считаются перспективными для лечения раков с множественными мутациями [30]. Однако применение siRNA сталкивается с вызовами: неустойчивостью в сыворотке (деградация нуклеазами внеклеточной среды) и офф-таргет эффектами [31]. Кроме того, siRNA несут отрицательный заряд, препятствующий связыванию с отрицательно заряженными клеточными мембранами [32]. Из-за этих свойств siRNA вряд ли может доставляться в клетки напрямую. Стабильность siRNA можно повысить химической модификацией или инкапсуляцией в защитные наноносы [33].

В данном исследовании вновь построена мультифункциональная нанонос GAL-GNR-siBRAF. Система использует золотые наностержни с фотоперамальной способностью как ядро, внешне модифицированное GAL (d-галактозой) для специфического таргетирования печеночных опухолей. Система снижает биотоксичность CTAB на поверхности GNR, показывает высокую загрузочную способность по siRNA и эффективно сайленсит ген BRAF в клетках рака печени. Применение GAL-GNR-siBRAF значительно атtenuирует пролиферацию, инвазию и миграцию клеток гепатомы. Кроме того, GAL-GNR-siBRAF одновременно индуцирует генный сайленсинг BRAF и фотоперамальный эффект, достигая синергетического эффекта в убийстве опухолевых клеток, что открывает новый путь для клинического лечения рака печени.

Материалы и методы

Клеточная линия

Клеточная линия муриного гепатоцеллюлярного карциномы Hepa1-6 получена из Банка стволовых клеток Китайской академии наук. Клетки культивировали в среде DMEM (Life Technologies, Карлсбад, CA) с 10% ФБС при 37 °C и 5% CO₂.

Синтез siRNA к BRAF

Последовательность siRNA к гену BRAF: 5′-GCUUACUGGAGAGGAGUUACA-3′, синтезирован Dharmacon, Inc. (Лафайет, CO, USA). Коммерчески доступный siRNA к люциферазе (siGL2) использован как негативный контроль.

Синтез CTAB-GNR

Водорастворимые золотые наностержни синтезировали методом засевного роста [34]. Засевочный раствор: 1 мл CTAB (0,2 М) смешали с 1 мл HAuCl₄ (0,5 мМ). Перемешивали при 28 °C, добавили 0,12 мл холодного NaBH₄ (0,01 М) до коричневого окраса. Раствор роста: 50 мл CTAB (0,2 М), 50 мл HAuCl₄ (1 мМ), 2,5 мл AgNO₃ (4 мМ) смешали при 28 °C. После тщательного перемешивания добавили 670 мкл аскорбиновой кислоты (0,079 М) до обесцвечивания. Добавили 120 мкл засевочного раствора при мягком перемешивании при 28 °C; окрас менялся от пурпурного к пурпурно-черному. После 24 ч перемешивания при постоянной температуре центрифугировали 12 000 об/мин 10 мин для удаления лишнего CTAB и сушили вакуумной сублимацией в порошок GNR.

Синтез MUA-PEI и GAL-PEI-MUA

Меркаптoundecановая кислота (MUA; 654 мг) растворили в 30 мл хлороформа (CHCl₃) и инкубировали с 100 ммоль EDC и 100 ммоль NHS 15 мин при комнатной температуре. Добавили 100 ммоль полиэтиленimine (PEI). После 24-ч реакции экстрагировали водорастворимый PEI-MUA равным объемом деионизированной воды. Аналогичным образом активировали d-галактозу в водном растворе. Затем добавили избыток активированной d-галактозы (500 ммоль) к водорастворимому PEI-MUA и реагировали 24 ч при комнатной температуре, получая водорастворимый комплекс GAL-PEI-MUA.

Синтез GAL-PEI-MUA-GNR (GAL-GNR) и PEI-MUA-GNR (PEI-GNR)

Сублимированный порошок CTAB-GNR (10 мг) взвесили в 10 мл водорастворимого PEI-MUA или GAL-PEI-MUA. CTAB замещался Au–S связью при перемешивании 24 ч при комнатной температуре. Центрифугировали 12 000 об/мин 15 мин, удалили supernatнант, осадок промыли трижды дистиллированной водой. Порошки PEI-GNR или GAL-GNR получили вакуумной сублимацией, взвесили и растворили в воде без рибонуклеаз, плазмонный резонанс измерили на мультифункциональном анализаторе (Spectra Max M5e, MD, USA).

Трансмиссионная электронная микроскопия

GNR или GAL-GNR взвесили в дистиллированной воде, резиденсат нанесли на медную сетку. После высыхания 30 мин образовали на ТЭМ (LIBRA 120, Carl Zeiss, Германия).

Ультрафиолетово-видимый анализ

GNR, PEI-GNR или GAL-GNR взвесили в дистиллированной воде. Поверхностный плазмонный резонанс в диапазоне 600–900 нм измерили на микроплитном считывателе (SpectraMax M5e, MD, USA).

Зета-потенциал и гидродинамический диаметр

GNR, PEI-GNR или GAL-GNR взвесили в дистиллированной воде, зета-потенциал и гидродинамический диаметр измерили на Zetasizer Nano ZS.

Ядерно-магнитный резонанс

Сублимированный порошок GAL-GNR растворили в тяжелой воде (99%, Sigma) до однородной суспензии, перенесли в НМР-кювету. Состав GAL-GNR определили по НМР (Bruker, 600 МГц, Германия).

Гелелектрофоретный анализ связывания (Gel Shift Assay)

GAL-GNR и siBRAF смешивали в массовых соотношениях (0:1, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1). После 30-мин инкубации при комнатной температуре добавляли загрузочный буфер ДНК. Образцы загружали в 2% агарозный гель с 0,01% Goldview (Bioshop, USA) и электрофорезировали 90 В 30 мин. Степень упаковки siBRAF визуализировали на гель-документирующей системе.

Стабильность siRNA в сыворотке

Смесь GAL-GNR-siBRAF (6:1) инкубировали в свежей мышиной сыворотке при 37 °C в течение 0, 3, 6, 12, 24 и 48 ч. Наголое siBRAF в сыворотке использовали как контроль. Добавляли равный объем 2% SDS к GAL-GNR-siBRAF, инкубировали 30 мин при комнатной температуре, добавляли загрузочный буфер, электрофорезировали в 2% агарозном геле (0,02% Goldview) 90 В 30 мин. Яркость полос siBRAF визуализировали на гель-документирующей системе.

Конкурентный ингибиционный анализ GAL-GNR-siBRAF

2×10⁵ клеток Hepa1-6 посеяли в 12-колбовые пластинки на ночь. Клетки прединкубировали с лактобионовой кислотой 12 ч, затем транслифицировали GAL-GNR-siBRAF (Cy3-маркированный) 30 мин. Внутриклеточную флуоресценцию измерили на флуоресцентном микроскопе (шкала = 200 мкм).

Способность GAL-GNR-siBRAF к таргетной доставке в клетки рака печени

1 мкг Cy3-маркированного siBRAF инкубировали с PEI-GNR (30 мкг/мл) или GAL-GNR (30 мкг/мл) 20 мин при комнатной температуре, добавили в среду клеток Hepa1-6. После 30-мин инкубации клетки промыли 50% ФБС трижды, флуоресценцию в клетках измерили под флуоресцентным микроскопом.

Фотоперамальный эффект

20, 40, 60, 80, 100 мкг GAL-GNR и 100 мкг GNR растворили в 1 мл дистиллированной воды. Растворы поместили в 24-колбовую пластинку и облучали 803-нм NIR-лазером (2 Вт/см²) 15 мин. Температуру фиксировали ИК-термометром каждые 0,5 мин первые 5 мин, затем каждую минуту.

MTT-тест

200 мкл клеток (3,5×10⁴/мл) посеяли в 96-колбовые пластинки на 24 ч, затем инкубировали с различными концентрациями GNR или GAL-GNR (0, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120 мкг/мл). После 24 или 48 ч добавляли 20 мкл MTT, инкубировали 4 ч. Кристаллы формазана растворяли в 150 мкл DMSO, измеряли абсорбцию при 490 нм (референс 650 нм) на микроплитном считывателе (SpectraMax M5e, MD, USA).

Тест кальцеин-AM / PI

Клетки Hepa1-6 (1,5×10⁵) держали в 12-колбовой пластинке на ночь, обрабатывали: PBS, лазер, GAL-GNR-siBRAF (30 мкг/мл: 1 мкг), GAL-GNR-siGL2 (30 мкг/мл: 1 мкг) + лазер, GAL-GNR-siBRAF (30 мкг/мл: 1 мкг) + лазер 4 ч, затем облучали NIR (808 нм, 2 Вт/см²) 15 мин. Цитотоксичность оценивали окрашиванием кальцеин-AM (живые клетки) и PI (мертвые клетки). Зеленая флуоресценция кальцеин-AM и красная PI фотографировали под флуоресцентной микроскопией.

Real-Time количественный PCR

Общая клеточная РНК извлекали Trizol (Invitrogen) и использовали как матрицу для обратной транскрипции. qPCR проводили с ген-специфическими праймерами (0,5 мкл × 10 мкМ каждый) на системе Stratagene Mx3000P (Agilent Technologies). Использовали SYBR Green PCR MasterMix (Life Technologies). Домашний ген β-актин — внутренний референс. Праймеры: β-актин: 5′AGGGAAATCGTGCGTGACATCAAA-3′ (прямой) и 5′ACTCATCGTACTCCTGCTTGCTGA-3′ (обратный); BRAF: 5′-CAATTGGCTGGGACACGGACAT-3′ (прямой) и 5′-TTGACAACGGAAACCCTGGAAAAG-3′ (обратный). Разницу экспрессии считали методом 2^−ΔΔCt.

Вестерн-блот

Общий белок клеток Hepa1-6 извлекали RIPA-буфером (Cell Signaling, Пикеринг, Онтарио, Канада), квантовали методом BCA. Белки разделяли в 12% SDS-PAGE, переносили на PVDF. β-актин — внутренний референс для BRAF. Белковые полосы детектировали ЭХЛ-химилюминесценцией.

Scratch-тест (ранка)

Транслифицированные клетки Hepa1-6 (1,7×10⁵/мл) посеяли в 12-колбовые пластинки на ночь. Прилегшие клетки царапали 10-мкл пипетным наконечником. Промыли дважды PBS, заменили среду на 2% ФБС. Среднюю ширину раны наблюдали под микроскопом через 0, 24 и 48 ч. Каждый тест в трипликате.

Transwell-тест миграции и инвазии

Камеры Transwell с порой 8 мкм (Corning Life Science) для оценки миграции и инвазии. 200 мкл клеток Hepa1-6 в безсывороточной среде (1,7×10⁵ клеток/мл) добавили в верхние камеры, 500 мкл среды с 12% ФБС — в нижние. После 24–48 ч инкубации клетки фиксировали 4% параформальдегидом 30 мин, окрашивали 1% кристаллическим фиолетовым 30 мин. Фотографировали и считали под инвертированным микроскопом. Для инвазии верхние камеры покрывали ЭКМ-гелем, остальные шаги аналогичны.

Статистика

Все эксперименты в трипликате. Данные — mean ± SD. Различия двух групп — парный t-тест (двусторонний), множественных групп — one-way ANOVA. Статистическая значимость при p < 0,05 (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001).

Результаты

Синтез и характеристика наноносов GAL-GNR-siBRAF

Разработан новый нанонос GAL-GNR, способный доставлять siRNA в печеночные клетки и сохранять фотоперамальный эффект GNR. Схема синтеза GAL-GNR на Схеме 1. Система содержит три функциональных компонента. Во-первых, основа GAL-GNR — скелет GNR длиной ~30 нм и диаметром ~10 нм (ТЭМ, рис. 1a); химически конъюгированный GAL-GNR не меняет размеров и сохраняет хорошую дисперсность (рис. 1b). Размер частиц: средний размер GNR 30,23 нм (согласуется с ТЭМ), GAL-GNR — 50 нм, PEI-GNR — 42,35 нм; увеличение из-за гидратации при конъюгации GAL и PEI (рис. 1c). Во-вторых, биотоксичный CTAB на поверхности GNR замещен положительно заряженным MUA-PEI, способным загружать отрицательно заряженное siRNA. Зета-потенциал GNR увеличился с 35,6 до 42,7 мВ (PEI) или 41,8 мВ (GAL-PEI), указывая на сильную способность связывать siRNA (рис. 1d). В-третьих, GAL использован как навигационная молекула для конъюгации GNR-носов, обеспечивающая специфический гоминг к ГЦК. UV-Vis спектроскопия предварительно характеризовала модифицированные GNR. Исходный пик поглощения необеспеченных GNR — 763 нм; смещение на 7 нм после модификации MUA-PEI, еще 8 нм после успешной конъюгации GAL (рис. 1e). Для подтверждения GAL в наносистеме использовали НМР. На водородном спектре НМР сигналы протонов галактозы (δ: 3,60, 3,65, 3,70, 3,78, 3,90, 4,53) наблюдались только в спектре GAL-GNR, подтверждая успешную конъюгацию GAL на поверхности GNR (рис. 1f).

Способность к инкапсуляции siRNA и стабильность GAL-GNR

Наноскелет GAL-GNR модифицирован положительно заряженным PEI, который электростатически связывает отрицательно заряженное siRNA. Гелелектрофоретный анализ (gel shift assay) оценил способность связывания siRNA. Свободное siRNA мигрирует в геле, связанное — замедляется или останавливается; связанное siRNA хуже связывает бромид этидия, флуоресценция снижается. Оптимальное массовое соотношение для насыщения GAL-GNR siBRAF — 6:1 (w/w) (рис. 2a).

Наголое siRNA быстро деградирует, особенно in vivo. Важная функция доставки — защита siRNA от деградации. Проверили защитный эффект GAL-GNR на siRNA в свежей сыворотке. По сравнению с наголым siRNA, связанное siRNA сохранялось дольше. Как показано на рис. 2b, нагое siRNA обнаруживалось до 12 ч, тогда как связанное siRNA все еще изобильно присутствовало после 48 ч. Результат демонстрирует, что GAL-GNR эффективно предотвращает деградацию siRNA в сыворотке, обеспечивая таргетную доставку in vivo.

Цитотоксичность наноматериалов

Низкая биотоксичность — важное свойство наноматериалов для раковой терапии. Оценили биосовместимость нового наноструктуры GAL-GNR. Как показано на рис. 3, мертвые клетки Hepa1-6 в группе необеспеченных GNR появлялись уже при низкой концентрации 30 мкг/мл. После 24-ч инкубации с 75 мкг/мл GNR смертность достигала 56,09%, через 48 ч — 75,5%. Напротив, GAL-модификация значительно снизила цитотоксичность. После 48-ч инкубации с GAL-GNR более 80% клеток оставались живыми даже при высокой концентрации (105 мкг/мл). Данные свидетельствуют о высокой биосовместимости нанокоса GAL-GNR по сравнению с GNR, гарантируя безопасность применения.

Таргетная доставка siRNA и генный сайленсинг BRAF в клетках гепатомы in vitro

Способность доставлять siRNA в раковые клетки — ключевая функция наноматериалов. Исследовали потенциал GAL-GNR в доставке siRNA, оценивая эффективность генного сайленсинга siBRAF, загруженного в GAL-GNR, в клетках Hepa1-6. По сравнению с контрольной группой, экспрессия BRAF в клетках, транслифицированных GAL-GNR-siGL2 (негативный контроль), не менялась, тогда как в клетках с GAL-GNR-siBRAF наблюдалось значительное снижение (рис. 4a). Эффект сайленсинга был дозозависимым, коррелируя с увеличением концентрации GAL-GNR. Результаты qPCR показали, что идеальная транслифицирующая концентрация GAL-GNR-siBRAF — 30 мкг/мл, эффективность сайленсинга достигала 90,29%, что сопоставимо с липофектамином 2000 (позитивный контроль). Результаты вестерн-блота согласовали с qPCR: белковая экспрессия BRAF снизилась через 48 ч после транслифекции (рис. 4b).

Лактобионовая кислота структурно похожа на GAL и конкурентивно связывается с ASGPR на мембране клеток ГЦК [35]. Для подтверждения специфической таргетирующей эффективности GAL-GNR клетки Hepa1-6 прединкубировали с лактобионовой кислотой, затем транслифицировали GAL-GNR-siBRAF. Необработанные клетки — пустой контроль, липофектамин 2000 — позитивный контроль. Как показано на рис. 4c, красная флуоресценция в клетках, транслифицированных GAL-GNR, была схожа с позитивным контролем, в то время как флуоресценция PEI-GNR-транслифицированных клеток была значительно ниже. С другой стороны, клетки, транслифицированные GAL-GNR-siBRAF без прединкубации, показывали более сильную красную флуоресценцию Cy3, чем клетки, прединкубированные с лактобионовой кислотой (рис. 4c), и результаты qPCR согласовывались с флуоресценцией (рис. 4d). Эти результаты дополнительно подтверждают, что GAL эффективно стимулирует эндоцитоз siRNA клетками Hepa1-6 и может использоваться как таргетирующий моети для ГЦК.

Влияние GAL-GNR-siBRAF на пролиферацию, миграцию и инвазию клеток Hepa1-6

BRAF играет важную роль в MAPK-пути, регулирующем пролиферацию, миграцию и инвазию клеток [36]. Оценили влияние GAL-GNR-siBRAF на клетки ГЦК. Сначала анализ пролиферации MTT-тестом. Как показано на рис. 5a, пролиферация клеток Hepa1-6, транслифицированных GAL-GNR-siBRAF, значительно снизилась по сравнению с GAL-GNR-siGL2 (негативный контроль) или PBS. Далее изучили эффект на миграцию scratch- и transwell-тестами. По сравнению с негативным контролем, миграционная способность клеток Hepa1-6, транслифицированных GAL-GNR-siBRAF, была явственно снижена (рис. 5b–d).

Для дальнейшего исследования инвазии провели transwell-тесты. Результаты показали, что клетки Hepa1-6, транслифицированные GAL-GNR-siBRAF, значительно снизили инвазию по сравнению с GAL-GNR-siGL2 или PBS (рис. 5e, f). Вышеизложенное свидетельствует, что нокаут гена BRAF с помощью комплексов GAL-GNR-siBRAF эффективно подавляет миграцию и инвазию клеток гепатоцеллюлярного карциномы.

Комбинированное лечение: фотоперамальный эффект и генный сайленсинг GAL-GNR-siBRAF

Наши ранние работы показывали, что золотые наноматериалы генерируют тепловую энергию под NIR-облучением [37]; этот феномен называется фотоперамальным эффектом благодаря LSPR свойствам GNR. Результаты показали, что с увеличением концентрации GAL-GNR тепловыделение усиливается. При концентрации 100 мкг/мл температура быстро поднимается с 24 до >60 °C. Значимой разницы в тепловыделении между GNR и GAL-GNR не наблюдалось (рис. 6a).

Новая наносистема GAL-GNR-siBRAF обладает тремя индивидуальными характеристиками: специфическое таргетирование рака печени, siRNA-основанный генный сайленсинг BRAF и GNR-предоставляемый фотоперамальный эффект. Изучили синергетический терапевтический эффект GAL-GNR-siBRAF в антиопухолевой терапии. Клетки Hepa1-6 без GAL-GNR сохраняли высокую жизнеспособность даже под NIR-облучением, что указывает на отсутствие значимого эффекта самого лазера на опухолевые клетки. При облучении лазером на фоне обработки GAL-GNR-siGL2 фотоперамальный эффект проявил мощную киллерскую способность по отношению к Hepa1-6. Хотя сайленсинг BRAF в одиночку индуцировал гибель клеток, эффект был неконкурентным. Лечение наноматериалом GAL-GNR-siGL2 плюс лазерное облучение дало значительно более сильную киллерскую способность, чем отдельный сайленсинг BRAF (рис. 6b). Эти данные указывают на то, что сайленсинг BRAF и фотоперамальный эффект могут синергетически усиливать потенциал убийства опухолевых клеток.

Обсуждение

Сложности таргетной доставки в опухоль — главные препятствия в клиническом лечении опухолей. В данном исследовании впервые разработан новый мультифункциональный нанонос GAL-GNR-siBRAF, обладающий множеством преимуществ. Модифицированный GAL-GNR не только обладает хорошей биосовместимостью, но и сохраняет LSPR-феномен скелета GNR и отличную фотоперамальную конверсию. GNR, модифицированные GAL, адресуют клетки ГЦК через ASGPR, что имеет большой потенциал в таргетной молекулярной терапии ГЦК. Дальнейшие исследования показали, что сайленсинг BRAF ингибирует пролиферацию, миграцию и инвазию гепатомных клеток. Стоит отметить, что GAL-GNR-siBRAF проявляет более сильную киллерскую способность в комбинации фотоперамального эффекта и сайленсинга BRAF.

РНК-интерференция (RNAi) привлекла внимание благодаря ключевой роли в экспрессии и регуляции генов. Использование siRNA для нокаута последовательно-специфических генов в раковых клетках для генной терапии — эффективный и специфический подход, ставший новым терапевтическим инструментом для многих заболеваний, включая рак [29, 31]. Однако низкая стабильность в сыворотке и плохое клеточное поглощение ограничивают клиническое применение siRNA [38]. С другой стороны, siRNA несут отрицательный заряд, препятствующий связыванию с отрицательно заряженными клеточными мембранами, и сами по себе вряд ли доставляются в клетки напрямую [32, 39]. Кроме того, существуют проблемы низкой транслифекционной эффективности и плохого клеточного внутренения в siRNA-терапии [40]. Эти барьеры препятствуют доставке siRNA в целевые клетки. Для повышения стабильности siRNA и усиления эффективности генного сайленсинга мы синтезировали новый нанонос GAL-GNR-siBRAF, включающий три компонента (Схема 1). Нанонос имеет малый молекулярный размер (~30 нм длиной, 10 нм диаметром) и хорошую дисперсность (рис. 1). Кроме того, GAL-GNR-siBRAF эффективно загружает большое количество siRNA при низкой концентрации (рис. 2a) и защищает siRNA от деградации РН-азами в сыворотке; siRNA оставался стабильным минимум два дня при 37 °C в присутствии свежей мышьей сыворотки (рис. 2b).

Хорошая биосовместимость необходима для наноматериалов в биотерапии. CTAB — необходимый реактив в синтезе золотых наностержней, но обладает выраженной цитотоксичностью, ограничивающей биологическое применение [41]. Для снижения цитотоксичности мы модифицировали GNR внешне положительно заряженным PEI и таргетным адаптером GAL (d-галактозой). Результаты показали, что по сравнению с необфункционализированными GNR, GAL-модифицированные GNR обладают лучшей биосовместимостью. Жизнеспособность клеток сохранялась выше 80% даже при очень высоких концентрациях (105 мкг/мл) GAL-GNR в течение 48 ч (рис. 3). Кроме того, малый размер и цилиндрическая форма наностержней облегчают их проникновение через клеточную мембрану [37, 38, 42]. Это особенно заметно при таргетной терапии раковых клеток. Наноконструкты, модифицированные галактозо-содержащими моети, обеспечивают высокое накопление GAL-GNR-siBRAF в опухолевых клетках, индуцируя эффективную регуляцию вниз экспрессии гена BRAF (рис. 4). Кроме того, по данным конкурентных ингибиционных экспериментов, GAL-GNR входит в клетки преимущественно через поверхностные рецепторы ASGPR клеток Hepa1-6 (рис. 4c).

Сообщалось, что ГЦК с высокой экспрессией BRAF и RAF1 склонны к быстрой пролиферации и росту [41, 43, 44]. B-Raf и Raf1 действуют преимущественно в нисходящей части ERK/MAPK-пути, регулируя ядерные факторы через каскадное усиление. Активация этого пути аномально ускоряет пролиферацию и дифференциацию клеток ГЦК [41, 44, 45]. Ген RAF также способствует экспрессии матриксных металлопротеиназ (MMP), изменяющих адгезию опухолевых клеток, деградирующих внеклеточную матрицу (ЭКМ) и базальную мембрану, и продвигающих инвазию и метастазирование опухолей [44, 45]. BRAF-киназа регулирует RAS-RAF-MEK-ERK путь, продвигающий пролиферацию, инвазию и метастаз раковых клеток, и позволяющий клеточной гибели через апоптоз [5, 46, 47]. В предыдущих работах мы обнаружили высокую экспрессию гена BRAF в клетках Hepa1-6 (данные не показаны). Спекулировали, что нокаут BRAF в Hepa1-6 заблокирует RAS-RAF-MEK-ERK путь и вызовет биологические изменения. Для проверки гипотезы транслифицировали клетки ГЦК GAL-GNR-siBRAF и обнаружили, что он значительно сдерживает пролиферацию, миграцию и инвазию (рис. 5), предлагая новую стратегию для клинического лечения ГЦК.

Другое важное преимущество GNR — локализованный поверхностный плазмонный резонанс (LSPR), конвертирующий поглощенную световую энергию в тепловую под NIR-облучением, тем самым убивая и разрушая клетки [42]. Исследовали светово-тепловую конверсию GAL-GNR: модифицированные GAL-GNR эффективно индуцируют тепловую энергию под NIR-облучением (рис. 6a). Далее изучили синергетические эффекты GAL-GNR-siBRAF. В то время как сайленсинг BRAF показывал ограниченную цитотоксичность, лечение GAL-GNR-siGL2 + лазер имело гораздо более сильную киллерскую способность. Одновременно комбинация фотоперамальной гипертермии и сайленсинга BRAF вызывала более 85% гибели клеток (рис. 6b), что указывает на то, что синергия GAL-GNR-siBRAF и фотоперамального эффекта может быть идеальной стратегией для подавления рака печени.

Заключение

В данном исследовании показано, что GAL-GNR-siBRAF преодолевает препятствие деградации siRNA, эффективно повышая стабильность siRNA в сыворотке in vitro. Кроме того, GAL-GNR-siBRAF таргетно доставляет siRNA в клетки гепатоцеллюлярного карциномы, нокаутирует экспрессию BRAF и значительно ингибирует пролиферацию, инвазию и миграцию клеток. Что еще важнее, GAL-GNR-siBRAF как новый мультифункциональный нанонос может значительно усилить способность к убийству опухолевых клеток при комбинации с NIR-облучением. В заключение, GAL-GNR-siBRAF имеет большой потенциал в лечении гепатоцеллюлярного карциномы и предлагает новые идеи для клинического применения при раке печени.

Доступность данных и материалов

Все данные, полученные и материалы, использованные в этом исследовании, включены в рукопись и соответствующие дополнительные файлы.

Аббревиатуры

GAL:

d-галактоза

GNR:

Золотые наностержни

siBRAF:

Малые интерференционные РНК, специфичные для BRAF

HCC:

Гепатоцеллюлярная карцинома

ASGPR:

Асиалогликопротеиновый рецептор

TACE:

Транскатетерная артериальная хемоэмболизация

LSPR:

Локализованный поверхностный плазмонный резонанс

CTAB:

Цетилтриметиламмоний бромид

MUA:

Меркаптoundecановая кислота

EDC:

1-этил-3-[3-диметиламино-пропил]карбодиимид гидрохлорид

NHS:

N-гидроксисукцинимид

PEI:

Полиэтиленимин

TEM:

Трансмиссионная электронная микроскопия

NMR:

Ядерно-магнитный резонанс

FBS:

Фетальная бычья сыворотка

DMSO:

Диметилсульфоксид

BCA:

Бицинохлориновая кислота

PVDF:

Поливинилиденфторид