Целевая доставка паклитаксела и ингибитора P-gp нанолипосомами через анти-PD-L1 для преодоления мультирезистентного рака желудка

Аннотация

Мультирезистентность (MDR), основанная на ATP-зависимых эффлюксных транспортерах (P-гликопротеин (P-gp)), остается главным препятствием успешной химиотерапии. Здесь мы исследовали потенциал нанолипосом, конъюгированных с моноoclonalным антителом к PD-L1 (mAb), в качестве целевой платформы доставки для ко-доставки паклитаксела (PTX) и специфического ингибитора транспорта P-gp (TQD, тариквидар) в резистентные к лекарствам раки желудка. Два препарата, PTX и TQD, были ко-загружены в единый носитель в точном соотношении для усиления перспектив комбинированного химиотерапевтического эффекта. Исследование клеточного поглощения показало, что PD-PTLP имел более высокую эффективность интернализации в клетках SGC7901/ADR с гиперекспрессией рецептора PD-L1, чем нетаргетированные PTLP. Наивысшая синергия наблюдалась при массовой фракции 1/0,5 (PTX/TQD), и комбинация PTX и TQD привела к очевидному синергетическому эффекту по сравнению с отдельными препаратами. Наши in vitro результаты показали, что TQD эффективен в реверсии мультирезистентности в клетках SGC7901/ADR. Значение IC50 для PD-PTLP составило 0,76 мкг/мл по сравнению с 6,58 мкг/мл и 7,64 мкг/мл для PTX и TQD соответственно. PD-PTLP вызвал значительно более высокие уровни реактивных форм кислорода (РФК) и клеточной апоптоз по сравнению с свободным PTX или TQD. Кроме того, in vivo антитеуморальное исследование показало, что комбинированная химиотерапия PD-PTLP демонстрировала значительное подавление опухолевой нагрузки резистентных к лекарствам ксеногрефф-опухолей с значительно более высоким количеством TUNEL-позитивных клеток. Кроме того, свободный PTX привел к значительному увеличению уровней АСТ и АЛТ, в то время как PD-PTLP был незначительно отличается от контроля, указывая на индекс безопасности. В целом, мы считаем, что комбинация антиопухолевого препарата с ингибитором P-gp может обеспечить потенциальное направление для лечения резистентных к лекарствам опухолей желудка.

Введение

Современные химиотерапевтические лечения на основе однофармaceuticalных схем далеки от идеальных и страдают от серьезных побочных эффектов при более высоких дозах и одновременно ведут к развитию резистентности к лекарствам [1]. Прошедшее десятилетие свидетельствовало о высокой терапевтической эффективности комбинированных лекарственных схем в лечении рака [2]. Комбинация двух или более препаратов демонстрировала синергетическую антиопухолевую эффективность благодаря различным фармакологическим действиям комбинированных препаратов [3, 4]. Однако выбор правильной комбинации препаратов зависит от множества факторов, включая тип раковых клеток, гидрофильные/гидрофобные препараты, биохимическую активность и фармакокинетические паттерны препаратов. Среди всех, комбинация препаратов селективна к конкретным типам рака [5].

Рак желудка — глобальное бремя здоровья и вторая по частоте причина онкологической смертности во всем мире. Распространенность рака желудка высока в Восточной Азии, такой как Япония, Корея и Китай, причем последняя сообщает о самой высокой смертности в мире [6]. В среднем ежегодно в Китае регистрируются 400 000 новых случаев, и большинство случаев диагностируются на поздних стадиях [7, 8]. Огромный прогресс достигнут в стратегиях лечения; однако это не улучшило выживаемость и привело к неудаче терапии. Неудача лечения в основном обусловлена развитием химиорезистентности и тяжелой токсичностью дозы химиотерапии и рецидивами рака желудка [9]. Поэтому существует срочная задача улучшить терапевтическую эффективность и преодолеть метастазирование и рецидивы рака желудка.

Паклитаксель (PTX) — один из важных препаратов, применяемых в лечении рака желудка [10]. PTX ингибирует клеточное реплицирование, мешая деградации микротрубочек, тем самым приводя к задержке клеточного цикла. Однако приобретение мультирезистентности (MDR) — главная проблема успеха химиотерапии [11, 12]. ATP-зависимый эффлюкс, медируемый трансмембранными транспортерами семейства ATP-биндовых кассет (ABC), в котором P-гликопротеин (P-gp) считается основным фактором, гиперекспрессирован в раках желудка [13]. С другой стороны, PTX служит субстратом для рецепторов P-gp, где эффлюкс препарата снижает внутриклеточную концентрацию препарата, ведущую к низкой эффективности и высокой резистентности [14]. В этом отношении тариквидар (TQD) — мощный ингибитор P-gp третьего поколения и сообщался о реверсии гиперекспрессии рецепторов P-gp в нескольких раковых клетках [15, 16]. Однако сообщения предполагали, что введение TQD должно быть прекращено рано, так как оно препятствует функции P-gp нормальной физиологической системы. Экспрессия P-gp требуется для поддержания гематоэнцефалического барьера (БББ) и удаления токсинов из нормальных тканей [17]. Поскольку P-gp присутствует в нормальных тканях и действует как барьер против клеточных токсинов, неспецифическая ингибиция PTX или TQD потенциально может вмешиваться в нормальные физиологические функции и приводить к неблагоприятной токсичности. Кроме того, PTX и TQD — высоколипофильные препараты с ограниченной растворимостью в водных растворах и системной крови, что необходима стабильная система доставки препаратов, нацеленная на рак желудка в организме [18].

Система доставки препаратов (DDS) значительно увеличивает концентрацию инкапсулированных препаратов в тканях рака и обеспечивает устойчивое высвобождение препарата в течение длительного периода [19]. В этом отношении липосомы — один из широко используемых переносчиков препаратов для улучшения терапевтической эффективности при раке. Липосомы приобрели возрастающее значение благодаря своей биосовместимости, структурным поверхностным модификациям, загрузке гидрофильных/гидрофобных препаратов и высокой емкости загрузки препаратов [20]. Препараты могут быть стабильно включены в липидный бислой липосомы и легко наделены длительным циркуляционным способностью (PEGylation) за счет эффекта усиленного проникновения и удержания (EPR) [21]. Недавно липосомы сообщали о способности удерживать множественные соотношения препаратов после внутривенного введения [22]. Эта идея была продемонстрирована в 2017 году после одобрения FDA, Vyxeos® (липосомная формуляция), содержащая соотношения цитарабина:даунорубицина в лечении лейкемии [23]. По сравнению с нетаркетированными формуляциями, лиганд-таркетированные формуляции были очень привлекательными и перспективными. В этом отношении PD-1 — клеточный поверхностный рецептор, известный по подавлению иммунной системы и подавлению воспалительной активности Т-клеток. Экспрессия PD-L1 сообщалась у 50% пациентов с раком желудка, делая PD-L1 мишенью для интернализации наночастиц [24, 25]. Моноклональное антитело к PD-L1 (mAb) может специфически связываться с экстрацеллюлярным доменом белка PD-L1 и может быть отличной терапевтической стратегией для улучшения антиопухолевой эффективности [26].

Главная цель настоящего исследования — улучшить доставку комбинированных препаратов PTX и TQD для усиления антиопухолевой эффективности против рака желудка. Для этой цели формулировали PTX и TQD-загруженные PD-L1/нанолипосомы и оценивали антиопухолевую эффективность в in vitro и in vivo условиях. In vivo эффективность оценивалась в ксеногрефф-модели на основе клеток рака желудка и иммуногистохимией (IHC).

Заключение

В заключение, наша работа реализовала комбинированную терапию против MDR опухоли стратегией программированной доставки. Мы продемонстрировали потенциал комбинации PTX и ингибитора P-gp (TQD) в подавлении опухолевой нагрузки мультирезистентных ксеногрефф-опухолей SGC7901/ADR. Ко-доставка PTX и TQD в мультифункциональном нанопереносчике позволила рациометрический контроль ко-загруженных антиопухолевых препаратов, ингибировала P-gp эффлюксный насос и продемонстрировала синергетическую антиопухолевую эффективность. Мы считаем, что комбинация антиопухолевого препарата с ингибитором P-gp может обеспечить потенциальное направление к лечению резистентных к лекарствам опухолей.

Материалы и методы

Формулирование нанолипосом, конъюгированных с mAb PD-L1, загруженных PTX/TQD

Яичный фосфатидилхолин (EPC), 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE), 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси(полиэтиленгликоль)-2000] (DSPE-PEG) и DSPE-PEG2000-малеймид (DSPE-PEG2000-Mal) смешивали в хлороформном растворе в молярном соотношении 3/2/0,5/0,25 вместе с PTX и TQD, а затем органическое растворитель испаряли с помощью ротационного испарителя, за которым следовала лиофилизация в течение 3 ч. Липидную пленку гидратировали 250 мМ раствором сульфата аммония, поддерживаемым при pH 7,0. Крупные мультиламеллярные липосомы ультразвуковыми обрабатывали 30 мин в ванно-типе ультразвуковом (Branson ultrasonicbath, США), поддерживаемом при 65 °C. Липосомы диализировали против большого объема дистиллированной воды строго 1 ч для обмена свободного препарата и исходных компонентов. Липосомы редиспергировали в фосфатно-буферном растворе (PBS, pH 7,4). mAb PD-L1 конъюгировали с липосомой смешением в соотношении 8:1 (липосома:mAb) и инкубацией при 4 °C в течение 4 ч. mAb PD-L1 будет конъюгирован с DSPE-PEG2000-Mal взаимодействием между сульфгидрильными остатками на антителах к C-терминальным малеймидным группам липосом. Конъюгированные с PD-L1 липосомы центрифугировали при 10 000 об/мин в течение 10 мин, supernatент удаляли и редиспергировали в PBS буфере и хранили при 4 °C до дальнейшего анализа. Количество PTX и TQD, инкапсулированных в липосому, оценивали методом HPLC. HPLC система Agilent Technologies модель 1260 Infinity, оснащенная автозагрузчиком Agilent Technologies и диодно-матричным детектором G1315D, использовалась в исследовании. Мобильная фаза состоит из смеси ацетонитрил/вода (70:30 об/об) при скорости потока 1 мл/мин. Колонка C18 (5 мкм, 150 × 60 мм, ODS-3) использовалась для элюции образцов и детектирования при 227 нм. Перед этим PTX/TQD-загруженную липосому растворяли в ацетонитриле и вихревали 15 мин, фильтровали через 0,45 мкм фильтр, и 10 мкл аликвоты вводили в HPLC колонку.

Анализ распределения размера и морфологии частиц

Распределение размера и дзета-потенциал препаратов, загруженных в формуляции, определяли с помощью Malvern zetasizer (Великобритания) при 25 °C. Перед экспериментом наночастицы разбавляли 10× дистиллированной водой, и эксперимент проводили при угле обнаружения 90° в трипликате. Морфологию наночастиц оценивали передаточным электронным микроскопом (TEM). Дисперсии наночастиц разбавляли 10× дистиллированной водой и помещали на углерод-покрытую медную сетку и сушили ИК-лампой, затем образец оценивали TEM (CM 30, Philips (Эйндховен, Нидерланды)) после окраски уранилацетатом (1% в/в).

Анализ профиля высвобождения

Профиль высвобождения PTX и TQD из нанолипосом оценивали диализным методом. Для этого 15 мг лиофилизированного порошка PD-L1 mAb-конъюгированных PTX и TQD-загруженных нанолипосом (PD-PTLP) растворяли в 1 мл дистиллированной воды и запечатывали в диализной мембране (MWCO 3,5 кДа) и погружали в 30 мл соответствующего буфера высвобождения, поддерживаемого при 37 °C. В предопределенные моменты времени аликвоты образцов изымали и заменяли равным количеством буфера высвобождения. Исследование продолжали 72 ч. Образцы фильтровали через 0,22 мкм шприцевой фильтр и вводили в HPLC колонку и оценивали вышеупомянутым методом.

Исследования клеточного поглощения

Клетки SGC7901/ADR культивировали в модифицированном среде Дюльбекко (DMEM), дополненной 10% ФКС и 100 МЕ/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина при условиях 5% CO₂ атмосферы при 37 °C. Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп (BX61WI; Olympus, Токио, Япония) использовали для оценки клеточного распределения и клеточного поглощения PTLP и PD-PTLP в клетках SGC7901/ADR. Для достижения этой цели 1 × 10⁵ клеток посевали в каждую ячейку 12-ячейчатой пластины и инкубировали 18 ч. Клетки затем воздействовали PTLP и PD-PTLP и инкубировали 3 ч. Клетки промывали три раза холодным PBS и фиксировали 4% параформальдегидом (PFA) в течение 10 мин. Клетки снова промывали PBS и окрашивали 4,6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) в течение 10 мин. Наконец, клетки тщательно промывали и наблюдали под CLSM. Конкурентный эксперимент на поглощении PD-PTLP проводили предобработкой клеток свободным mAb PD-L1 в течение 30 мин и промыванием. Клетки делили на две группы, одну обрабатывали свободным mAb PD-L1, а другую — без свободного mAb PD-L1. Клетки инкубировали с PD-PTLP и инкубировали 3 ч и следовали тому же методу для оценки анализа клеточного поглощения.

Экспрессия белка методом вестерн-блот

Клетки SGC7901/ADR посевали в 6-ячейчатой пластине при плотности посева 3 × 10⁵ клеток/ячейка и инкубировали 18 ч. Клетки обрабатывали разными формуляциями (PTX, TQD, PTLP, PD-PTLP) и инкубировали 24 ч. Клетки промывали и экстрагировали буфером стриппинга и лизировали стандартным лизис-буфером (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, США). Клетки центрифугировали со скоростью 12 000 об/мин в течение 15 мин, и supernatент собирал и kvantификацию белка проводили с помощью BCA белкового анализа (Beyotime). Равные количества белка загружали в 8% SDS-PAGE гель и затем переносили на нитроцеллюлозную мембрану (EMD Millipore, Billerica, MA, США). Мембрану блокировали 5% обезжиренным молоком в течение 1 ч для ингибирования неспецифических центров связывания. Мембрану инкубировали с первичными антителами (P-gp и GAPDH, 1:1000, Abcam, MA, США) при 4 °C на ночь. Мембрану промывали TBST и снова инкубировали со вторичными антителами, маркированными перекисью коневой радишального перекиси, анти-кроличьи или анти-мышиные антитела (кролик или мышь, 1:10 000, Abcam, MA, США) при комнатной температуре. Мембраны снова промывали TBST. Блоты визуализировали усиленным хэмилюминесцентным методом (EMD Millipore).

In vitro цитотоксический анализ

Цитотоксический эффект отдельных препаратов и формуляций оценивали MTT-тестом. Кратко, раковые клетки размещали при плотности 1 × 10⁴ клеток/ячейка в 96-ячейчатой пластине и инкубировали 18 ч. Клетки затем обрабатывали свободным PTX, TQD, PTLP и PD-PTLP соответственно в течение 24 ч. Далее, клетки тщательно промывали и добавляли 15 мкл 5 мг/мл раствора MTT и подвергали 3 ч дополнительной инкубации, затем добавляли 100 мкл DMSO для экстракции кристаллов формазана. Полученная абсорбция измерялась при 570 нм с помощью автоматического микропластинчатого ридера. Выживаемость клеток рассчитывалась по OD тестовой группы/OD контроля × 100%. Комбинационный индекс оценивали программным обеспечением Calcusyn^TM. Все эксперименты проводили в трипликате.

In vitro анализ апоптоза и реактивных форм кислорода

Для анализа апоптоза раковые клетки размещали при плотности 2 × 10⁵ клеток/ячейка в 12-ячейчатой пластине и инкубировали 18 ч. Клетки затем обрабатывали свободным PTX, TQD, PTLP и PD-PTLP соответственно в течение 24 ч. Клетки экстрагировали стриппингом и центрифугировали, а осадки редиспергировали в 100 мкл буфера связывания. Клетки ко-окрашивали комбо 5 мкл Annexin-V/FITC и 2,5 мкл PI рабочего раствора и инкубировали 15 мин. Окрашенные клетки анализировали потоковым цитометром с помощью BD FACS Calibur (BD Biosciences, CA, США). Annexin-V и PI представляют индикаторы ранней и поздней апоптоза соответственно, основанные на структурных компонентах живых и мертвых клеток.

2,7-дихлорофлуоресцин диацетат (DCFH-DA) использовали в качестве зонда для анализа реактивных форм кислорода (РФК). Для количественного анализа 1 × 10⁴ клеток/ячейка посевали в 96-ячейчатой пластине с черным дном и инкубировали 18 ч. Клетки затем обрабатывали свободным PTX, TQD, PTLP и PD-PTLP соответственно в течение 24 ч. Клетки промывали PBS буфером и затем инкубировали с 1 мл раствора DCFH-DA согласно рекомендациям производителя в течение 30 мин. Затем клетки лизировали и центрифугировали при 10 000 об/мин в течение 15 мин. Полученный supernatент переносили в новую 96-ячейчатую пластину и флуоресценцию измеряли при 485 нм с помощью автоматического микропластинчатого ридера. Одновременно отдельный набор клеток обрабатывали аналогичным образом и изображения наблюдали с помощью флуоресцентного микроскопа (Nikon A1, Япония).

Антитеуморальная эффективность PD-PTLP в ксеногрефф-модели

Исследование антитеуморальной эффективности проводили на голых мышах BALB/c, полученных из Центра лабораторных животных, Четвертой аффилированной больницы Харбинского медицинского университета, Харбин. Все эксперименты на животных проводили в соответствии с национальными стандартами качества лабораторных животных. Эксперименты строго проводили в соответствии с руководством Комитета по экспериментальным животным Четвертой аффилированной больницы Харбинского медицинского университета, Харбин. Животных субкутанно инъецировали 1 × 10⁶ клеток SGC7901/ADR в 150 мкл культурной среды в правый бок мыши. Опухоли позволяли расти до 100 мм³ перед экспериментом. Мышей равномерно делили на пять групп по восемь мышей в каждой. Индивидуальная доза PTX и TQD фиксировали на 5 мг/кг, тогда как комбинация использовала общую дозу 5 мг/кг. Внутривенное введение в хвостовую вену проводили каждый третий день, всего выполняли три инъекции. В предопределенные дни измеряли объем опухоли и массу тела. Объем опухоли рассчитывали измерением наибольшего и наименьшего диаметров опухоли цифровым штангенциркулем. Объем опухоли (V) = ½ × длина × ширина (мм)². Мышей жертвовали в конце исследования и опухоль извлекали и взвешивали. Опухоль подвергали иммуногистохимическому (IHC) анализу. Опухоли извлекали, нарезали на тонкие кусочки и фиксировали в 10% формалиновом растворе. Опухоли встраивали в парафиновый воск и затем проводили TUNEL-ассэй согласно рекомендациям производителя.

Сывороточный биохимический анализ

Мышей вводили соответствующими формуляциями; через 24 ч мышей жертвовали и образцы крови собирали из контрольных и тестовых групп животных. Сыворотка отделяли от всей крови и хранили при −80 °C до дальнейшего анализа. Сывороточный биохимический анализ проводили для оценки функции печени. Аспартат-трансаминаза (АСТ) и аланин-трансаминаза (АЛТ) измеряли для оценки функции печени. Все измерения выполняли согласно процедурам биохимического набора.

Результаты и обсуждение

Подготовка и характеристика PTX/TQD-загруженных PD-L1-конъюгированных нанолипосом

PTX широко использовался в клинике и в основном применялся в лечении рака желудка. Однако большинство пациентов, видимо, страдают от плохой терапевтической реакции из-за мультирезистентности (MDR) рака желудка. Увеличение дозы PTX приводило к увеличению системной токсичности, тем самым MDR стало главным препятствием успешного лечения рака. Среди множества механизмов MDR, P-gp-медированный эффлюкс препарата считается в первую очередь ответственным за резистентность к препаратам в раковых клетках [27]. Поэтому в этом исследовании мы использовали второй препарат (TQD) как ингибитор P-gp для преодоления феномена MDR в раковых клетках и улучшения антиопухолевой эффективности PTX. Мы тщательно изучали массовую фракцию двух препаратов, при которой они демонстрируют синергетический эффект. Для максимизации антиопухолевого эффекта важно ко-доставлять множественные препараты в единой наночастичной системе. Доставка двух препаратов (PTX и ингибитора P-gp) одновременно позволит эффективное подавление механизма эффлюкса препарата и увеличит перспективы повышенных внутриклеточных концентраций в раковых клетках [28]. Для этой цели в этом исследовании мы загрузили два препарата в липидный бислой нанолипосом, которые считаются крайне стабильными в системном кровообращении (рис. 1). Для достижения усиленной опухоль-специфической таркетировки нанолипосомы поверхностно конъюгировали с mAb PD-L1. Малеймидная группа, присутствующая в нанолипосоме, будет связываться с тиольной группой mAb PD-L1 и формировать стабильную ковалентную связь. Но возможное ограничение малеймидной конъюгации заключается в том, что реакция обратима: продукт может подвергаться ретро-Михаэлевским реакциям с биологическими тиолами в плазме, что может привести к высвобождению малеймида. Однако мы преодолели такую реакцию максимальной поверхностной конъюгацией антитела на малеймид-липосоме. Сообщалось, что опухоль-таркетирующий лиганд специфически доставит терапевтическую нагрузку в ткани опухоли и избежит ненужных побочных эффектов в нормальных тканях. Ранее Патель и соавт. сообщили, что включение ингибитора P-gp с PTX могло преодолеть MDR в клетках яичника in vitro [11]. Аналогично, Цзоу и соавт. и Чжан и соавт. сообщили, что цитоксичность PTX против SKOV-3TR и A2780-Adr мультирезистентных клеток значительно увеличилась в присутствии тариквидара. Однако в этих исследованиях использовали либо физическую комбинацию PTX + TQD, либо разработали нетаркетированный переносчик [29, 30]. Важно, все эти исследования проводились только in vitro. Настоящее исследование фокусировалось на проектировании таркетированного нанопереносчика с использованием относительно нового класса таркетирующего агента, анти-PD-L1 антитела. Кроме того, настоящее исследование продемонстрировало эффективность PTX + TQD в ксеногрефф-модели опухоли и также оценило параметры крови для связи с системной токсичностью.

Схематические иллюстрации загрузки паклитаксела и тариквидара в нанолипосомы, поверхностно конъюгированные с моноклональным антителом PD-L1 (mAb). Липосома была подготовлена гидратацией тонкой липидной пленки и ультразвуковой обработкой для формирования препаратозагруженных нанолипосом

Средний размер частиц PTLP составлял 135,6 ± 1,26 нм, в то время как он увеличился до 168,59 ± 1,34 нм после конъюгации с mAb PD-L1 (PD-PTLP). Размер частиц увеличился из-за большой молекулярной массы mAb PD-L1; тем не менее, общий размер менее 200 нм и сферическая форма были замечательны (рис. 2a). Наночастицы размером менее 200 нм позволят более высокое накопление в тканях опухоли благодаря эффекту усиленного проникновения и удержания (EPR). Кроме того, наличие PEG позволит длительное время циркуляции крови в системном кровообращении. Дзета-потенциал PD-PTLP составлял 22,1 ± 1,21 мВ, что не позволит никакому неспецифическому связыванию с компонентами крови. PD-PTLP демонстрировал высокую эффективность инкапсуляции ~95% для обоих препаратов (PTX и TQD). PD-PTLP также демонстрировал высокую загрузку препаратов 12–14% в/в для PTX и TQD соответственно (рис. 2b).

Физико-химическая характеристика PTX/TQD-загруженных PD-L1-конъюгированных нанолипосом. a Морфологический анализ PD-PTLP с использованием передаточного электронного микроскопа (TEM). b Емкость загрузки препаратов PD-PTLP. c In vitro высвобождение PTX и TQD из PD-PTLP в буферных условиях pH 7,4 и pH 5,0 при 37 °C. **p < 0,01 — статистическая разница в высвобождении препарата между буферами pH 7,4 и pH 5,0

In vitro высвобождение препаратов

Поведение высвобождения PTX и TQD из PD-PTLP изучали в условиях pH 7,4 и pH 5,0 при 37 °C. Как показано на рис. 2c, контролируемое высвобождение препаратов (PTX и TQD) наблюдалось из PD-PTLP на протяжении всего периода исследования (72 ч). Высвобождение препарата из толстого бислоя нанолипосомы может отвечать за медленное и устойчивое высвобождение двух препаратов из PD-PTLP. Следует отметить, что никакая значительная разница не наблюдалась в паттерне высвобождения PTX и TQD в pH 7,4 и pH 5,0. В более длительные временные точки значимая разница в высвобождении наблюдалась в разных pH условиях. Стоит отметить, что в нанолипосоме не добавляли pH-реагирующих элементов, и более высокое высвобождение препарата в кислых условиях может быть атрибутировано более высокой диффузии при более низком pH. Например, ~85% PTX высвободилось в условиях pH 5,0 по сравнению с ~55% высвобождения препарата при физиологическом pH. Аналогичный паттерн быстрого высвобождения малых молекул в кислых условиях и более медленного высвобождения в основных pH условиях демонстрировали другие исследователи. Тем не менее, относительно низкое высвобождение препарата в условиях pH 7,4 может снизить ненужные системные побочные эффекты и продлить системную циркуляцию, в то время как более высокое высвобождение препарата в pH 5,0 может способствовать более высокой терапевтической эффективности в тканях опухоли.

In vitro анализ клеточного поглощения

Эффективность доставки таркетированных (PD-PTLP) и нетаркетированных (PTLP) нанолипосом тестировали в SGC7901/ADR. Клеточное поглощение оценивали с использованиемродамина-B в качестве флуоресцентного трекера. Родамин-B — обычно используемый флуорофор без клеточных биологических взаимодействий. Ядро окрашивали синим DAPI, а красный цвет исходил от наночастиц. Данные CLSM четко показывают, что PD-PTLP демонстрировал сильную красную флуоресценцию в раковых клетках по сравнению с нетаркетированными PTLP. Более высокая красная флуоресценция в клетках рака, обработанных PD-PTLP, атрибутировалась более высокой интернализации наночастиц (рис. 3a). Результат данных CLSM указывает, что рецептор PD-L1, экспрессируемый на клеточной мембране, был распознан mAb PD-L1, конъюгированным на поверхности нанолипосомы. Неспецифический или пассивный механизм поглощения был очевиден в клетках рака, обработанных PTLP. Специфичность таркетирования PD-L1 была дополнительно подтверждена экспериментом с предобработкой mAb PD-L1. Клетки SGC7901/ADR предобрабатывали mAb PD-L1 и инкубировали 30 мин. Клетки затем воздействовали PD-PTLP и PTLP и инкубировали 3 ч. Как показано (рис. 3b), клетки, предобработанные mAb PD-L1, показывали значительно меньше красной флуоресценции по сравнению с необработанными клетками, указывая на то, что mAb PD-L1 был потреблен поверхностно-экспрессированными рецепторами и никакие дополнительные рецепторы не были доступны для связывания и интернализации, приводя к меньшему поглощению наночастиц и меньшей интернализации. Эти CLSM четко раскрыли таркетирующую специфичность PD-PTLP в клетках рака SGC7901/ADR.

a Изображения конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM) клеток SGC7901/ADR после инкубации с PTLP и PD-PTLP в течение 3 ч; CLSM изображения клеток SGC7901/ADR, предобработанных с/без mAb PD-L1 после инкубации с PD-PTLP в течение 3 ч. Родамин B использовали в качестве флуоресцентного трекера, а DAPI — для окраски ядра раковых клеток

Два препарата, загруженные в нанолипосомы, усиливают антипролиферативный эффект

Для комбинированной терапии использовали разные соотношения двух препаратов (PTX и TQD) для установления степени синергетического или аддитивного эффекта на резистентных клетках рака желудка. Для расчета изобологрограммы и комбинационного индекса (CI) использовали программу CalcuSyn (Biosoft, версия 2.1). Изобологрограмма может быть объяснена на основе уравнения Чоу-Талалая. Значения CI характеризуются синергетическим (CI < 0,9), аддитивным (CI = 1) и антагонистическим (CI > 1). Как показано, все соотношения комбинации PTX и TQD выявили значение CI < 1, означающее синергетический механизм действия (рис. 4a). Конкретно, наивысшая синергия наблюдалась при массовой фракции 1/0,5 (P/T), в то время как уровень синергии снижался с увеличением массовой фракции TQD, указывая на важность наличия двух препаратов в специфической массовой фракции. Слишком низкая и слишком высокая концентрация TQD в комбинированной схеме не давала лучшего синергетического эффекта. Для всех in vitro экспериментов мы использовали соотношение P/T = 1/0,5.

a Комбинационный индекс (CI) разных массовых фракций PTX и TQD в клетках SGC7901/ADR. Комбинационный индекс оценивали программным обеспечением Calcusyn^TM. b In vitro выживаемость клеток SGC7901/ADR после лечения различными концентрациями свободного PTX, TQD, PTLP и PD-PTLP в течение 24-часового периода инкубации. c Вестерн-блот анализ экспрессии P-gp в клетках SGC7901/ADR после лечения соответствующими формуляциями. **p < 0,01 и ***p < 0,001 — статистическая разница между свободным PTX и группой, обработанной PD-PTLP

In vitro цитотоксический эффект отдельных и комбинированных препаратов определяли протоколом MTT после 24-часовой инкубации. Как показано на рис. 4b, пустые наночастицы не имели никакого эффекта на выживаемость клеток, исключая возможность любого вмешательства в конечные результаты. Монотерапия с PTX и TQD, хотя и показывала концентрационно-зависимый цитотоксический эффект в резистентных клетках рака желудка, она не достигла заметной эффективности в лечении. Антипролиферативный эффект единственного агента был замечательно улучшен при комбинации со вторым препаратом, инкапсулированным в нанолипосому. Комбинация PTX и TQD привела к очевидному синергетическому эффекту по сравнению с отдельными препаратами. Кроме того, PD-L1 mAb-конъюгированная нанолипосома (PD-PTLP) продемонстрировала самый сильный антипролиферативный эффект, указывая на влияние таркетирующего лиганда на поверхности наночастицы. Это усиленное убийство клеток в группе PD-L1-таркетированного лечения может быть атрибутировано высокой клеточной интернализации PD-L1-таркетированных нанолипосом клетками SGC7901/ADR, согласованной с анализом клеточного поглощения. Значение IC50 для PD-PTLP составило 0,76 мкг/мл по сравнению с 6,58 мкг/мл и 7,64 мкг/мл для PTX и TQD соответственно. Десятикратное снижение значения IC50 PD-PTLP четко указывает на то, что резистентность к PTX в P-gp гиперекспрессирующих SGC7901/ADR была реверсирована TQD. Наши in vitro результаты показали, что TQD эффективен в реверсии мультирезистентности в клетках SGC7901/ADR. Результаты также показали, что нанолипосомы сохраняли фармакологическое действие инкапсулированных препаратов и высвобождали препарат контролируемым образом в раковых клетках. Комбинированная терапия с PTX и TQD усилила антиопухолевую эффективность с увеличенной синергетической активностью, превосходя минимальные преимущества монотерапии и возможные связанные побочные эффекты. В целом, комбинированное лечение PTX с эффективным ингибитором P-gp в нанолипосоме может быть перспективной стратегией для преодоления MDR и лечения рака желудка.

Для оценки молекулярного механизма проводили вестерн-блот анализ на SGC7901/ADR. Как показано (рис. 4c), PTX не имел никакого эффекта на экспрессию белка P-gp, в то время как, напротив, TQD значительно регuléeрировал экспрессию P-gp вниз, подтверждая его фармакологическую роль как ингибитора P-gp. Интересно, комбинированные препараты на основе PTLP и PD-PTLP показали незначительную разницу в экспрессии белка по сравнению с клетками рака, обработанными TQD. Результат продемонстрировал преимущество загрузки PTX и TQD (ингибитора P-gp) вместе в единой нанопереносной системе. Результат вестерн-блота может быть подтвержден результатами выживаемости клеток, где комбинация PTX + TQD реверсировала MDR и продемонстрировала более высокую антиопухолевую эффективность в клетках рака желудка.

Анализ апоптоза потоковым цитометром

Анализ апоптоза отдельных формуляций оценивали методом окраски Annexin V-FITC/PI с использованием потокового цитометра. Результаты апоптоза представлены на рис. 5a. Как показано, контрольные клетки не показывали никаких признаков апоптоза, тогда как свободный PTX и TQD продемонстрировали очевидное увеличение апоптических клеток. Комбинированные препараты на основе PTLP показали двухкратный более высокий апоптоз по сравнению с отдельными препаратами, указывая на синергетический антиопухолевой эффект формуляций. Что более важно, PD-PTLP показал наивысший апоптоз раковых клеток около 60% в области апоптоза. Усиленный эффект апоптоза PD-PTLP атрибутировался более высокой интернализации двойных препаратов, загруженных в нанопереносчики, и синергетическому потенциалу PTX и TQD в рациометрическом отношении. Эффект подавления P-gp TQD в комбинированной схеме усилил антиопухолевой эффект PTX в раковых клетках. Скорость апоптоза отдельного препарата была в диапазоне 20–25%, в то время как около 60% апоптических клеток наблюдалось для клеток, обработанных PD-PTLP. PD-PTLP индуцировал больше апоптоза, чем свободные препараты и нетаркетированные липосомы, что указывает на то, что PD-L1 может доставить PTX/TQD более эффективно для индукции апоптоза клеток SGC7901/ADR.

a Анализ апоптоза клеток SGC7901/ADR после окраски комбо Annexin V/PI с использованием потокового цитометра. Клетки обрабатывали фиксированной концентрацией 2 мкг/мл. b Анализ реактивных форм кислорода (РФК) клеток SGC7901/ADR с использованием 2,7-дихлорофлуоресцин диацетата (DCFH-DA) в качестве зонда. ***p < 0,001 — статистическая разница между свободным PTX и группой, обработанной PD-PTLP

Определение внутриклеточного уровня РФК

Мы исследовали способность отдельных препаратов и двойных препаратов влиять на редокс-состояние раковых клеток, оценивая уровень реактивных форм кислорода (РФК) в клетках рака желудка. Уровни РФК в раковых клетках оценивали DCFH-DA (зеленая флуоресценция). Количественные данные РФК представлены на рис. 5b. Как показано, необработанные клетки не имели признаков РФК; однако PTX или TQD индуцировали заметные уровни генерации РФК. Важно, PTLP и PD-PTLP вызвали значительно более высокие уровни РФК по сравнению с свободным PTX или TQD или необработанными контрольными клетками. Заметно более высокий РФК указывает на потенциал PD-PTLP для продвижения более высокого апоптоза. Микроскопические изображения подтверждают количественные результаты с наиболее яркой и интенсивной зеленой флуоресценцией по сравнению с необработанными или свободными PTX или TQD обработанными клетками рака. Более высокая интенсивность зеленой флуоресценции указывает на более высокую генерацию РФК. Окислительный стресс, такой как РФК, считается важным индикатором клеточной цитотоксичности. Исследования показали, что индукция РФК вызывает множество физиологических событий, включая повреждение ДНК, воспаление и клеточный апоптоз.

Комбинация PTX и TQD ингибировала рост резистентных к препаратам опухолей

Наконец, терапевтическая эффективность и параметры токсичности формуляций исследовали на ксеногрефф-модели резистентных к препаратам опухолей SGC7901/ADR (рис. 6a). Препараты вводили внутривенно при фиксированной дозе 5 мг/кг каждые 3 дня с общим количеством трех инъекций. PTX/TQD вводили при фиксированной массовой фракции 1/0,5. Как ожидалось, свободный PTX и свободный TQD не показали никакого ингибирующего эффекта на рост MDR опухолей, что свидетельствует о том, что клетки SGC7901/ADR проявляют лекарственную толерантность на пролиферации MDR опухолей. Ингибитор P-gp (TQD), хотя и эффективен в ингибировании эффлюксных насосов препаратов, однако не конвертируется в улучшенный терапевтический исход. В сравнении, комбинация PTX + TQD (PTLP) продемонстрировала значительное ингибирование роста резистентных к препаратам опухолей. Лучшая антитеуморальная эффективность наблюдалась с PD-PTLP, которая была в три раза эффективнее по сравнению с контролем, в 2,5 раза по сравнению с свободными препаратами и примерно в два раза эффективнее в снижении опухолевой нагрузки по сравнению с нетаркетированными формуляциями (p < 0,05; p < 0,001). Конечный объем опухоли контроль, свободный PTX, TQD, PTLP и PD-PTLP составлял ~2000 мм³, ~1650 мм³, 1625 мм³, ~1000 мм³ и ~650 мм³ соответственно. Свободные препараты были слегка эффективны в начальной временной точке; однако они росли так же, как необработанная контрольная группа. Результаты четко раскрывают потенциал комбинации PTX + ингибитора P-gp как уникальной стратегии для эффективного контроля опухолевой нагрузки. Обширное подавление опухоли в PD-PTLP четко указывает на большую антитеуморальную эффективность группы таркетированных формуляций. Опухоли извлекали и взвешивали; массы опухолей были согласованы с данными объема опухоли (рис. 6b). Группа мышей, обработанных PD-PTLP, показала наименьшую опухоль по сравнению с любой другой группой, обработанной формуляциями (p < 0,001). Для дальнейшей проверки ингибиторного эффекта отдельных опухолей, опухоли подвергали TUNEL-ассэю (рис. 6c). Как показано, PD-PTLP показал обширные участки апоптического окрашивания по сравнению с необработанным контролем или свободными препаратами. PD-PTLP продемонстрировал явные признаки апоптоза с дезорганизованными клеточными расположениями. Выдающийся эффект убийства опухоли PD-PTLP показывает большее ингибирование раковых клеток в резистентных к препаратам опухолевых клетках. Отличная эффективность PD-PTLP в основном атрибутировалась наличию таркетирующего лиганда (mAb PD-L1), который связывается с соответствующими рецепторами и увеличивает внутриклеточные концентрации. Наличие комбинированной схемы и высвобождение контролируемым образом в течение длительного времени также способствовало ее усиленной эффективности. Кроме того, плотная гидрофильная PEG-корона на поверхности может предложить отличную физическую стабильность частицам и потенциально избежать ненужного белкового адсорбция и избежать быстрого клиренса. Длинная циркуляция и наноразмер в свою очередь способствуют более высокому накоплению частиц в тканях опухоли [31-33].

In vivo антитеуморальная эффективность различных формуляций против мультирезистентных (MDR) опухолей SGC7901/ADR; a объем опухоли, b анализ массы опухоли, и c TUNEL-ассэй тканей опухоли. Мышей вводили фиксированной дозой 5 мг/кг с длительностью три раза для трех администраций. Апоптические клетки оценивали TUNEL-ассэем. *p < 0,05 и **p < 0,05 (PTLP против PD-PTLP), ***p < 0,001 (PTX против PD-PTLP) — обработанная группа.

Анализ системной токсичности

Изменение массы тела является хорошим индикатором системной токсичности. Как показано (рис. 7a), мыши, обработанные свободным PTX, потеряли ~20% массы тела на 10-й день, что постепенно уменьшалось для восстановления исходной массы тела к концу исследования. Потеря более 5% массы тела считается причиной серьезной внутренней токсичности, а 20% потери массы тела считается значительным неблагоприятным эффектом свободных препаратов [31]. Напротив, PTLP или PD-PTLP не вызывали такой потери массы тела, и мыши оставались здоровыми на протяжении всего периода исследования, указывая на индекс безопасности нанолипосом. Система доставки без системной токсичности и с усиленной антитеуморальной эффективностью считается высокоэффективной в лечении опухолей. Безопасность наночастиц дополнительно изучали измерением плазменных уровней ферментов. Плазменные уровни аминотрансфераз (АСТ и АЛТ) измеряли после 24-часового введения соответствующих формуляций (рис. 7b, c). Как показано, свободный PTX привел к значительному увеличению (p < 0,01) уровней АСТ и АЛТ, в то время как PD-PTLP и PTLP были незначительно отличаются от необработанного контроля. АСТ высвобождается в сыворотку при повреждении органов, таких как сердце, почки или печень, в то время как АЛТ специфически высвобождается при повреждении печени [34]. Уровни АСТ и АЛТ служат специфическими индикаторами повреждения органов, и в этом отношении PD-PTLP показал себя безопасным переносчиком.

Анализ системной токсичности отдельных формуляций в опухолях SGC7901/ADR; a анализ массы тела мышей; b, c биохимическая оценка сывороточных уровней АСТ и АЛТ как параметров системной токсичности. *p < 0,05 и **p < 0,01 — статистическая разница между свободным PTX и группой, обработанной PD-PTLP

Доступность данных и материалов

Все данные, сгенерированные или проанализированные в ходе этого исследования, включены в эту опубликованную статью и ее дополнительные информационные файлы.

Аббревиатуры

EPR:

Эффект усиленного проникновения и удержания

PD-PTLP:

PD-L1 mAb-конъюгированные PTX и TQD-загруженные нанолипосомы

P-gp:

P-гликопротеин

PTLP:

PTX и TQD-загруженные нанолипосомы

PTX:

Паклитаксель

TQD:

Тариквидар