Двухмишенные магнитные наночастицы для высокочистого изоляции эндотелиальных клеток лимфатической системы и двухмодальной визуализации при раке толстой кишки

Аннотация

Злокачественные опухоли остаются ведущей причиной смертности во всем мире. Плотность лимфатических сосудов сильно коррелирует с метастазами, однако существующие маркеры лишены специфичности и доступности. Здесь мы сообщаем о ядерно-оболочечных магнитных наночастицах Fe₃O₄@KCTS, функционализированных антителами к LYVE‑1 и подопланину. Полученные двухмишенные зонды эффективно захватывают эндотелиальные клетки лимфатики (LEC) из человеческих опухолей толстой кишки, обеспечивая высокочистое изолирование и in vivo T₂-взвешенную МРТ плюс флуоресцентную визуализацию. Эти результаты закладывают основу для ранней клинической диагностики и терапевтического таргетирования LEC-медированных метастазов.

Введение

Хотя микросреда опухоли движет метастазами, точный вклад эндотелиальных клеток лимфатики (LEC) остается слабо определенным. Специфичные для LEC маркеры — LYVE‑1, подопланин, VEGFR‑3, Prox‑1 — ускорили исследования, но ни один не является полностью эксклюзивным для LEC. LYVE‑1 отсутствует на сосудистом эндотелии, а подопланин не экспрессируется сосудами крови, что делает эту пару высокоспецифичной. Магнитные наночастицы оксида железа (Fe₃O₄) биосовместимы, высокопарамагнитны и поддаются поверхностной функционализации. Производные хитосана, такие как α‑кетоглутарат карбоксиметил хитосан (KCTS), обеспечивают обилие карбоксильных групп для ковалентного связывания, улучшая дисперсию и снижая агрегацию.

Объединяя эти атрибуты, мы спроектировали наночастицы Fe₃O₄@KCTS, несущие оба антитела LYVE‑1 и подопланина. Двухмишенный дизайн повышает точность захвата LEC, уменьшает загрязнение сосудистыми клетками и поддерживает двухмодальную визуализацию, продвигая как диагностические, так и исследовательские приложения.

Материалы и методы

Клеточные культуры

Клетки человечной рака толстой кишки HT29 (ATCC) выращивали при 37 °C в DMEM с 10 % FBS, 100 Ед/мл pénicillin и 100 мкг/мл стрептомицина, под 5 % CO₂.

Животная модель

Сорок самок мышей NOD/SCID получали подкожные инъекции HT29 (2 × 10⁷ клеток мл^‑1, 200 мкл на мышь). Протоколы одобрены Этический комитетом Гуанси медицинского университета.

Синтез наночастиц

Ядра Fe₃O₄ активировали EDC/NHS, затем конъюгировали с KCTS через COOH–OH связь. Антитела LYVE‑1 (APC) и подопланина (FITC) ковалентно связывали, получая Fe₃O₄@KCTS‑LECs‑Double‑Ab (0,1 мг мл^‑1). Наночастицы хранили при 4 °C в темноте.

Характеризация

Передаточная электронная микроскопия (ТЭМ) показала равномерные сферические ядра (≈ 90 нм). Динамическое световое рассеяние (DLS) дало средний диаметр 91,3 ± 2,3 нм и дзета-потенциал –32,8 ± 1,5 мВ, указывая на отличную коллоидную стабильность. Флуоресцентные спектры подтвердили отдельные пики FITC (488 нм) и APC (545 нм), подтверждая успешное присоединение антител.

Иммуногистохимия и иммунофлуоресценция

Замороженные срезы опухоли окрашивали антителами LYVE‑1 (APC) и подопланина (FITC), контрастировали DAPI и изучали конфокальной микроскопией.

Изоляция LEC

Ткань опухоли ферментативно диссоциировали, фильтровали и подвергали либо (1) коммерческим LYVE‑1 MicroBeads, либо (2) магнитной сепарации с Fe₃O₄@KCTS‑LECs‑Double‑Ab. Отсортированные клетки культивировали в 6-колбовых пластинках.

Функциональные тесты

Образование трубок оценивали в Matrigel, а поглощение LDL квантовали с DiI‑Ac‑LDL. Жизнеспособность клеток измеряли CCK‑8 после воздействия концентраций наночастиц от 0,1 до 2 мг мл^‑1. In vivo токсичность оценивали гистопатологией основных органов после однократной инъекции 2 мг мл^‑1.

Имиджинговые исследования

Мыши NOD/SCID с подкожными ксеногрефтами HT29 получали 0,5 ммоль кг^‑1 двухмишенных наночастиц внутривенно. T₂-взвешенная МРТ (3,0 Т, FOV 80 × 80 мм, TE 69 мс) и флуоресцентная визуализация проводили до инъекции и через 0,5, 12 и 24 ч после. Блокирующая группа получала анти-LYVE‑1 и анти-подопланин антитела перед инъекцией наночастиц.

Результаты

Дизайн наночастиц

Схема 1 иллюстрирует ядерно-оболочечную конструкцию и двухантителковую функционализацию. Данные ТЭМ и DLS подтверждают монодисперсность (91 нм) и отрицательный заряд поверхности (–32,8 мВ). Флуоресцентные спектры валидируют ко-конъюгацию FITC и APC.

Чистота LEC

Потоковая цитометрия показала 71,2 % LYVE‑1⁺/подопланин⁻ клеток с MicroBeads, против 88,9 % двойно-положительных клеток с двухмишенным нанозондом (P < 0,05). Иммунофлуоресценция подтвердила коэкспрессию обоих маркеров в популяции, отсортированной нанозондом.

Функциональная компетентность

LEC, отсортированные нанозондом, демонстрировали превосходную способность к образованию трубок и усиленное поглощение LDL относительно клеток, отсортированных MicroBeads, указывая на более высокую чистоту и функциональность.

In vivo визуализация

Флуоресценция достигала пика через 12 ч после инъекции и снижалась к 24 ч, тогда как МРТ-сигнал уменьшался к 12 ч перед постепенным восстановлением. Блокирующая группа показала пренебрежимое накопление в опухоли, подтверждая таргетную специфичность.

Токсичность

Тесты CCK‑8 выявили > 90 % жизнеспособность при всех концентрациях наночастиц через 24 и 48 ч. Гистология сердца, легких, печени, селезенки и почек не выявила некроза или воспаления после дозы 2 мг мл^‑1.

Обсуждение

Двухантителковая функционализация заметно улучшает изоляцию LEC, преодолевая ограничения одно-маркерных систем, которые часто ко-захватывают сосудистые эндотелиальные клетки. Надежный отрицательный дзета-потенциал и равномерная морфология Fe₃O₄@KCTS‑LECs‑Double‑Ab обеспечивают стабильность и предотвращают агрегацию. Двухмодальная визуализация предлагает мощную платформу для раннего обнаружения рака толстой кишки и изучения LEC-медированных метастазов.

Заключение

Мы разработали биосовместимую двухмишенную магнитную наночастицу, которая эффективно изолирует высокочистые LEC и позволяет одновременную МРТ и флуоресцентную визуализацию in vivo. Эта платформа предлагает экономически эффективную, экономящую время альтернативу конвенциональным методам изоляции и несет перспективу для клинической трансляции в диагностике рака толстой кишки и исследовании механизмов лимфатических метастазов.

Доступность данных и материалов

Все экспериментальные данные доступны без ограничений.

Аббревиатуры

APTES

(3‑Аминопропил)триэтоксисилан

BSA

Бовиновый сывороточный альбумин

ELISA

Иммуноферментный анализ

GNP

Золотые наночастицы

HRP

Хорретиновая переоксидаза

IDE

Интеркалированные электроды

FIX

Фактор IX