Магнитная наночастица двойного нацеливания для обнаружения рака человека

Введение

Злокачественные опухоли представляют большую опасность для здоровья человека [1]. Предыдущие исследования показали, что микросреда опухоли влияет на биологические характеристики опухоли, такие как метастазы, связанные с опухолью [2, 3]. Однако потенциальные механизмы, особенно процесс, с помощью которого лимфатические эндотелиальные клетки (ЛЭК) способствуют метастазированию опухоли, все еще не ясны [4]. Следовательно, необходимо разработать стратегии диагностики опухолей, основанные на нацеливании на лимфатические сосуды. Отсутствие лимфатических маркеров, особенно тех, которые отличают LEC от эндотелия сосудов, ограничивает исследования функций LEC. В последние годы специфические маркеры LEC, такие как рецептор 1 эндотелиального гиалуронана лимфатических сосудов (LYVE-1) [5, 6], Podoplanin [7], рецептор 3 фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR-3) [8] и Prox -1 были идентифицированы [9]. Это ускорило исследования лимфатических сосудов опухоли, особенно за счет нацеливания на эндолимфатические сосуды опухоли для диагностики опухолей. Это также позволило изучить механизм метастазирования опухолей путем сортировки эндолимфатических эндотелиальных клеток опухоли с помощью иммуномагнитных шариков [10]. Однако, как и многие другие маркеры, используемые в молекулярной патологии, ни один из молекулярных маркеров, связанных с LEC, не является полностью специфичным для LEC. Из-за временной экспрессии Prox-1 в ядре [11] он не подходит для клинического применения. Хотя VEGFR-3 экспрессируется в LEC, ему не хватает лимфатической специфичности при раке, поскольку он также экспрессируется в сосудистом эпителии [8]. LYVE-1 специфически экспрессируется в LEC, а также в нормальных синусоидах печени, эндотелии селезенки, венулах высокого эндотелия, а также в активированных тканевых макрофагах, но не экспрессируется в эпителии сосудов [7]. Подопланин не экспрессируется в эпителиальных клетках сосудов, но является специфическим маркером LEC [7, 12].

Магнитный оксид железа, нано-золото, квантовые точки, липосомы и оксид титана широко используются в диагностике и лечении рака из-за их высокой биосовместимости, большой удельной поверхности и простоты модификации с помощью других биологических функциональных молекул [13, 14]. Помимо вышеуказанных характеристик, магнитный оксид железа (Fe ₃ О ₄ ) имеет узкое распределение по размерам, хорошую диспергируемость, высокий парамагнетизм и контролируемый размер, что делает его пригодным для магнитно-резонансной томографии [15]. Среди них суперпарамагнитный оксид железа, покрытый антителами, широко используется для разделения клеток, распознавания и ранней диагностики опухолей [16, 17]. Как природное высокомолекулярное вещество, поверхность хитозана богата гидроксильными и аминогруппами и широко используется благодаря своим превосходным свойствам, таким как биосовместимость, совместимость с кровью, безопасность и способность к микробному разложению [18]. Следовательно, комбинация хитозана или производного хитозана и магнитного Fe ₃ О ₄ является более подходящим для биологических применений, потому что он может предотвратить агломерацию магнитных шариков друг с другом с образованием магнитных жидкостей. По этой причине он обеспечивает лучшую дисперсию.

При исследовании опухолей обнаружение лимфатических сосудов в опухолях основано на прямом мечении антителами или с помощью антител в сочетании с магнитными шариками для сортировки лимфатических эндотелиальных клеток. Здесь, чтобы более точно воздействовать на внутриопухолевые лимфатические сосуды, мы разработали многоцелевой нанозонд, то есть два высокоспецифичных антитела против лимфатических эндотелиальных клеток, антитело против Lyve-1 и антитело против подпланина. Эти антитела были связаны с наночастицами четырехокиси железа, покрытыми хитозаном. По сравнению с другими нанозондами, разработанные в этом исследовании нанозонды, содержащие два антитела, более точны для обнаружения лимфатических сосудов, и поэтому изолированные лимфатические эндотелиальные клетки более чистые.

В этом исследовании для быстрого обогащения и выделения LEC из раковых клеток человека использовали лиганд с относительно высокой специфичностью в отношении антитела против LYVE-1 и антитела против подпланина для облегчения связывания с покрытыми хитозаном суперпарамагнитными наночастицами для получения магнитных бусинки для выбора LEC. Также было подтверждено, что зонд может использоваться для бимодальной диагностики солидных опухолей.

Материалы и методы

Условия клеточной линии и клеточной культуры

Клеточная линия рака толстой кишки (HT29), которая была приобретена из банка клеток АТСС, культивировалась при 37 ° C в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) (Гибко, Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США), которая содержит 10% фетальной бычьей сыворотки ( Gibco, Гранд-Айленд, штат Нью-Йорк, США), 100 Ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина при 5% CO ₂ .

Экспериментальная модель животного

Сорок самок мышей NOD / SCID (возраст 4-6 недель) были приобретены в компании Beijing Vital River Laboratory Animal Technology (Пекин, Китай). Клетки HT29, выращенные в логарифмической фазе, трижды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS). После переваривания трипсином клетки центрифугировали при 1000 об / мин в течение 5 мин. Затем клетки ресуспендировали в PBS, и концентрацию клеток доводили до 2 × 10 ⁷ . / мл. Каждой мыши вводили 200 мкл суспензии клеток. Все протоколы экспериментов были одобрены Комитетом по этике животных Медицинского университета Гуанси (Гуанси, Китай).

Получение и характеристика Fe ₃ О ₄ @ KCTS-LECs-Двойные антитела Магнитные нанозонды

Хитозан (Xi’an Ruixi Biotechnology) был карбоксилирован α-кетоглутаровой кислотой с получением α-кетоглутарат карбоксиметилхитозана (KCTS), богатого CO-группами на его поверхности [19]. Fe ₃ О ₄ (Xi’an Ruixi Biotechnology) использовалась как ядро, а KCTS была установлена ​​как основная структура скелета. После активации Fe ₃ О ₄ наночастицы с карбодиимидом, Fe ₃ О ₄ @KCTS был образован путем объединения ковалентной связи KCTS-COOH и поверхности-OH. Выбранные антитела LECs были специфичными к человеческому антителу, конъюгированному с LYVE-1 APC (R&D Systems®, кат. № FAB20892A), и антителу против подопланина (FITC) (Abcam, кат. № ab205333). Эти антитела были ковалентно сшиты с карбоксилированным Fe ₃ О ₄ @KCTS с использованием активированного EDC / NHS. Следовательно, магнитные нанозонды, модифицированные двойными антителами LEC, относящиеся к Fe ₃ О ₄ Был получен магнитный нанозонд @ KCTS-LECs-двойное антитело (0,1 мг / мл). Наночастицы, конъюгированные с двойными антителами, хранили в темноте при 4 ° C.

Морфология и гранулометрический состав полученного Fe ₃ О ₄ Магнитные наночастицы @ KCTS-LECs-Double антитела оценивали с помощью просвечивающего электронного микроскопа (ТЕМ; H-7650, Япония). Размер частиц (размер), дзета-потенциал и индекс дисперсии частиц (PDI) Fe ₃ О ₄ @ KCTS-Двойные антитела измеряли с помощью динамического рассеяния света (DLS; PRO3000, Япония), а их фотолюминесценцию измеряли с помощью флуоресцентного спектрофотометра (FL-7000, Perkin Elmer, США).

Иммуногистохимия и иммунофлуоресценция

Были приготовлены замороженные срезы ткани и помещены в ледяной ацетон на 10 мин, а затем погружены в раствор PBS на 10 мин. После блокирования в 1% BSA и трехкратной промывки PBS срезы инкубировали с человеческим антителом, конъюгированным с LYVE-1 APC, и антителом против подпланина (FITC) при 4 ° C в течение 30 мин. После инкубации срезы трижды погружали в раствор PBS, после чего к опухолевой ткани добавляли окрашивающий раствор 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI), чтобы полностью покрыть ткани. Срезы снова инкубировали 5 мин при комнатной температуре. После этого их трижды промывали PBS с последующим добавлением агента гашения флуоресценции, когда срезы полностью высохли. Наконец, срезы помещали на покровное стекло и наблюдали под конфокальным микроскопом (Nikon DS-Ri1; Nikon, Токио, Япония).

Ткани рака толстой кишки, консервированные в формалине, были залиты парафином для этого исследования. Депарафинированные срезы ксенотрансплантатов рака HT29 блокировали 3% перекисью водорода, блокировали 5% нормальной сывороткой и инкубировали с антителом против LYVE-1 (Abcam, ab10278, Великобритания) в течение ночи при 4 ° C. Затем меченное биотином вторичное антитело козы против кроличьего IgG H&L (HRP) (ab205718) в реагенте для мечения суперстрептавидина, конъюгированного с пероксидазой хрена, инкубировали в течение 30 мин. Цвет измеряли с использованием раствора 3,3'-диаминобензидина (DAB).

Очистка ячейки

Средний объем опухолей составлял около 1,5 × 1 × 1 см ³ . . Перед удалением опухолей мышей дезинфицировали, погружая их в 75% этанол на 3–5 мин. Дезинфицированную кожу мышей срезали стерильными ножницами и стерильными щипцами на чистом столе. Ткань опухоли осторожно вырезали и помещали в чашку Петри, содержащую PBS. Затем пропитанную ткань опухоли разрезали офтальмологическими ножницами и помещали в стерильную пластину. Измельченную ткань пипеткой переносили в центрифужную пробирку на 50 мл, используя пастеризованную пробирку. Затем в пробирку добавляли трехкратный объем коллагеназы I и встряхивали в течение 10 мин для получения смеси коллагеназы I и ткани опухоли. Затем смесь помещали в водяную баню при 37 ° C на 20 мин, и это повторяли пять раз. В конце переваривания коллагеназу I останавливали добавлением полной среды и смеси давали постоять в течение 2 минут. После центрифугирования при 300 g в течение 10 мин опухоли дважды промывали PBS, затем повторно суспендировали в 10 мл PBS и медленно фильтровали через сито с размером пор 75 мкм (200 меш). Отфильтрованные клетки подсчитывали, усредняли в двух центрифужных пробирках по 15 мл, ресуспендировали в PBS, затем центрифугировали при 300 g в течение 10 минут и затем трижды промывали. (1) Метод сортировки с помощью магнитных шариков MACS:отмытые клетки повторно суспендировали в 100 мкл буфера. Раствор, содержащий PBS pH 7,2, 0,5% BSA и 2 мМ EDTA, был приготовлен разбавлением исходного раствора MACS BSA (Кат. № 130-091-376) до 1:20 раствором для автоматической промывки MACS ™ (Кат. № 130 -091-222). Затем добавляли 10 мкл человеческого антитела, конъюгированного с LYVE-1 APC, и затем инкубировали при 4 ° C в течение 15 минут в темноте. Наконец, его трижды промывали 2 мл буферного раствора. После центрифугирования добавляли 80 мкл буферного раствора для повторного суспендирования клеток и добавляли 20 мкл раствора магнитных шариков флуоресцеина против APC. Смесь инкубировали 15 мин, трижды промывали, затем центрифугировали и хорошо перемешивали с 300 мкл буферного раствора. Наконец, положительные клетки в колонке были быстро разрушены 3 мл буферного раствора. Полученные клетки культивировали в шестилуночном планшете. (2) Fe ₃ О ₄ Метод сортировки магнитных наночастиц @ KCTS-LECs-двойное антитело:промытые клетки повторно суспендировали в 200 мкл буфера, смешанного с Fe ₃ О ₄ @ KCTS-LECs-двойные магнитные наночастицы антитела, инкубировали при 4 ° C в течение 20 минут в темноте, затем трижды промывали 4 мл буфера, центрифугировали и ресуспендировали в 160 мкл буфера. Наконец, клетки элюировали с помощью магнита и культивировали в 6-луночном планшете.

Иммунофлуоресценция клеток, отсортированных разными методами

Клетки, отсортированные с помощью различных методов сортировки, были доведены до концентрации клеток 5 × 10 ⁴ . / мл с PBS и равномерно распределить в 12-луночном планшете. В каждую лунку добавляли один миллилитр клеточной суспензии и затем культивировали при 37 ° C в течение 24 часов в 5% CO ₂ окружающие. Затем старую среду отбрасывали, и клетки трижды промывали раствором PBS. Затем в каждую лунку добавляли 200 мкл 4% параформальдегида и клетки выдерживали при комнатной температуре в течение 10 мин. Затем клетки промывали трижды раствором PBS, добавляли человеческое антитело, конъюгированное с LYVE-1 APC, и антитело против подопланина (FITC). После инкубации в темноте при 4 ° C в течение 2 ч клетки промывали трижды. Далее, в каждую лунку добавляли 50 мкл DAPI и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут для окрашивания ядер в синий цвет с последующей трехкратной промывкой PBS. Наконец, гаситель флуоресценции был помещен в центр предметного стекла, а сторона, покрытая клетками, была помещена на предметное стекло и наблюдалась с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа.

Проточная цитометрия клеток, отсортированных разными методами

Клетки, отсортированные различными методами, ресуспендировали с человеческим LYVE-1 APC-конъюгированным антителом и антителом против подопланина (FITC) в 200 мкл связывающего буфера (10 мМ HEPES / NaOH pH 7,4, 140 мМ NaCl, 2,5 мМ CaCl). , и инкубировали при 4 ° C в течение 1 ч в темноте, затем трижды промывали PBS. Клетки были обнаружены и проанализированы с помощью проточной цитометрии (BD Accury6; Becton Dickinson, Сан-Хосе, Калифорния, США), а затем проанализированы с помощью программного обеспечения FlowJo (Tree Star Inc., Эшленд, Орегон, США).

Обнаружение активности LEC

Клетки с логарифмической фазой роста, отсортированные различными методами, собирали, переваривали и подсчитывали. Концентрацию клеток довели до 2 × 10 ⁵ . клеток / мл и 50 мкл этих клеток добавляли в каждую лунку покрытого матригелем μ-предметного стекла и инкубировали в 5% CO ₂ инкубатор при 37 ° C в течение 6 ч. Среду отделяли и выгружали пастеризованной пипеткой с последующим добавлением раствора PBS, содержащего 1 мкг / мл кальцеина AM (Invitrogen, Cat. No. c3099). Затем клетки инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч в темноте, промывали PBS и фотографировали под микроскопом (Nikon, Япония). После этого 1 × 10 ⁵ клетки смешивали с 500 мкл полной среды, содержащей 20 мкг / мл DiI-ac-LDL (Molecular Probes, Invitrogen), а затем инокулировали в 24-луночный планшет при 37 ° C в течение 4 часов. Старый культуральный раствор удаляли и клетки трижды промывали PBS. Затем в каждую лунку добавляли 50 мкл раствора DAPI и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре для окрашивания ядер в синий цвет. После трехкратной промывки PBS их, наконец, визуализировали под микроскопом.

МРТ и флуоресцентная визуализация in vivo

Следующие шаги были выполнены, чтобы определить, была ли опухоль нацелена на Fe ₃ . О ₄ @ KCTS-LECs-двойные магнитные наночастицы антител у животных. Модель подкожного ксенотрансплантата мышей NOD / SCID рака толстой кишки использовали для магнитно-резонансного или флуоресцентного сканирования. Т2-взвешенное изображение проводилось в определенных условиях, которые включали поле зрения (80 × 80 мм), время эхо-сигнала (69 мс) и толщину слоя (2,0 мм) с использованием МРТ-сканера 3,0 Т (Discovery 750, gE, Германия). , имеющий объемную катушку для мыши диаметром 40 мм. Мыши NOD / SCID были разделены на две группы ( n =3); экспериментальная группа и группа, блокирующая рецепторы. Всем мышам вводили Fe ₃ . О ₄ @ KCTS-LECs-двойное антитело (0,5 ммоль / кг), магнитные наночастицы через хвостовую вену. Каждую мышь сканировали в четырех определенных временных точках:перед инъекцией, 0,5 часа, 12 часов и 24 часа после инъекции. В группе, блокирующей рецепторы, каждой мыши инъецировали антитело против LYVE-1 (Abeam, ab10278, Великобритания) и антитело против подопланина (Abcam, ab10288, Великобритания) перед инъекцией Fe ₃ О ₄ @ KCTS-LECs-двойное антитело. МРТ-сканирование проводилось в те же четыре момента времени. Флуоресцентные изображения получали с использованием системы визуализации мелких животных in vivo (Bruker, США). Моменты времени для группировки, инъекции наркотиков и сканирования были указаны выше.

Токсичность Fe ₃ О ₄ @ KCTS-LECs-Двойной магнитный нанозонд с антителами

Токсичность Fe ₃ О ₄ Магнитный нанозонд @ KCTS-LECs-двойное антитело против LEC оценивали с помощью анализа CCK-8. Клетки (100 мкл среды, 2 × 10 ⁵ / мл) культивировали в течение ночи в 96-луночных планшетах при 37 ° C в гуманизированной атмосфере, содержащей 5% CO ₂ , затем обработали Fe ₃ О ₄ @ KCTS-LECs - магнитный нанозонд с двойным антителом (0,1, 0,5, 1,0, 2,0 мг / мл) в течение 24 или 48 часов в тех же условиях. После инкубации в каждую лунку добавляли 10 мкл раствора CCK-8 с последующей инкубацией в течение 2 часов. Оптическую плотность (OD) измеряли при 450 нм с помощью ридера для микропланшетов ELISA (Thermo Scientific, США).

Для оценки токсичности Fe ₃ О ₄ Магнитный нанозонд @ KCTS-LECs-двойное антитело in vivo самкам мышей NOD / SCID вводили в одну хвостовую вену инъекцию 200 мкл PBS (контрольная группа) или Fe ₃ О ₄ @ KCTS-LECs - магнитный нанозонд с двойными антителами (2 мг / мл) ( n =3 животных в группе). Через 1 неделю мышей умерщвляли, получали срезы основных тканей (сердце, легкие, печень, селезенку, почки) и погружали в 10% раствор формальдегида, обезвоживали и заливали парафином. Парафинированные срезы (толщиной 4 мкм) вырезали и окрашивали гематоксилин-эозином.

Анализ даты

Для анализа данных использовалось статистическое программное обеспечение SPSS 16.0. Данные измерений были выражены как x ± s, сравнение между группами было выполнено с помощью дисперсионного анализа, а сравнение данных подсчета выполнено с помощью критерия хи-квадрат. P <0,05 считалось статистически значимым.

Результат

Принцип двойного нацеливания магнитных наночастиц для обнаружения рака человека

В этом исследовании, как показано на схеме 1, Fe ₃ О ₄ @KCTS, тип магнитных наночастиц типа ядро-оболочка, был получен путем активации Fe ₃ О ₄ с карбодиимидом и сшивкой его с α-кетоглутаратом хитозана (KCTS). Затем на поверхность этих магнитных наночастиц добавляли антитела против LYVE-1 и подпланина, тем самым формируя магнитные нанозонды двойного нацеливания. Эти зонды вводили моделям мышей через хвостовую вену для диагностики опухоли с помощью Т2-взвешенной МРТ и флуоресцентной визуализации. После иссечения опухоль измельчали ​​до одной клетки, а затем инкубировали с зондом для идентификации эндотелиальных клеток лимфоцитов с более высокой чистотой с помощью магнита для изучения механизма метастазирования опухоли. Результаты показали, что был успешно разработан магнитный нанозонд двойного нацеливания, который обеспечивает получение LEC высокой чистоты из опухолевых тканей, что обеспечивает основу для клинического применения LEC при колоректальном раке, а также для ранней клинической диагностики с помощью двухрежимной визуализации колоректального рака.

Схематическое изображение Fe ₃ О ₄ @ KCTS-LECs-двойные магнитные наночастицы антител

Характеристика Fe ₃ О ₄ @ KCTS-LECs-Двойные магнитные наночастицы антител

ПЭМ-изображения (рис. 1а) показали, что голый Fe ₃ О ₄ имеет неправильную форму со сферической формой и имеет агломераты между частицами. Когда Fe ₃ О ₄ был модифицирован KCTS (рис. 1б), частицы имели правильную сферическую или овальную форму, а частицы были равномерно диспергированы. Как показано на рис. 1c, Fe ₃ О ₄ Магнитные наночастицы @ KCTS-LECs-двойное антитело были модифицированы отрицательно заряженным антителом на поверхности Fe ₃ О ₄ @KCTS, который дает отрицательные заряды, тем самым увеличивая электростатическое отталкивание между наночастицами. Fe ₃ О ₄ Магнитные наночастицы @ KCTS-LECs-двойное антитело были сферическими, однородными, свободными от агрегации частиц и не были повреждены. Средний диаметр составлял 91,28 ± 2,31 нм, а PDI составлял 0,207 ± 0,015 (рис. 1d). Из рисунка видно, что распределение наночастиц по размерам было узким и хорошо диспергировалось в воде. Отрицательно заряженная поверхность имела дзета-потенциал -32,8 ± 1,51 мВ с абсолютным значением более -30, что указывает на хорошую стабильность материала (рис. 1e).

Характеристика магнитного нанозонда. а Электронно-микроскопическое изображение Fe ₃ О ₄ нанозонд (шкала 100 нм). б Электронно-микроскопическое изображение Fe ₃ О ₄ Нанозонд @KCTS (масштабная линейка, 100 нм). c Электронно-микроскопическое изображение Fe ₃ О ₄ @ KCTS-LECs - магнитный нанозонд с двойным антителом (масштабная линейка, 100 нм). г Размер частиц определяли анализом размеров, и средний размер зонда составлял 91,28 нм. е Дзета-потенциал был около - 32,8 мВ. е Fe ₃ О ₄ Нанозонд @ KCTS-LECs-двойное антитело имеет пики излучения при возбуждающем свете 488 и 545 градусов

Результаты флуоресцентного спектрометра показаны на рис. 1е. Отчетливый пик эмиссии наблюдался в антителе против подопланина (FITC) при возбуждающем свете 488 и в антителе против LYVE-1 (APC) при возбуждающем свете 545. Наличие эмиссионных пиков в Fe ₃ О ₄ Комплекс @ KCTS-LECs-двойное антитело при возбуждении 488 и 545 указывает на успешное связывание материалов.

Иммуногистохимия и иммунофлуоресценция

Как показано на фиг. 2a, b, наблюдалась экспрессия LYVE-1 в тканях рака толстой кишки и антитела LYVE-1 и подопланина в замороженных опухолевых тканях. Это продемонстрировало, что небольшое количество лимфатических эндотелиальных клеток присутствует в тканях рака толстой кишки.

Экспрессия лимфатических сосудов в тканях колоректального рака. а Расширенные сосуды в тканевых срезах были положительными на LYVE-1 на мембране эндотелиальных клеток по данным иммуногистохимии (масштабная линейка, 100 мкм). Справа увеличенное изображение. б Расширенные сосуды в тканевых срезах были положительными на LYVE-1 и подпланин на мембране эндотелиальных клеток, что было выявлено с помощью иммунофлуоресценции (масштабная линейка, 50 мкм)

Изоляция и обогащение LEC

Иммунофлуоресцентное окрашивание проводили на клетках, полученных двумя разными методами сортировки. Было обнаружено, что клетки, отсортированные с помощью магнитных шариков LYVE-1 MicroBeads, экспрессировали белок LYVE-1, но не подпланин, тогда как клетки, полученные с помощью Fe ₃ О ₄ Магнитные наночастицы @ KCTS-LECs-двойное антитело экспрессировали белок LYVE-1 и белок подопланин (рис. 3а). Кроме того, были проанализированы результаты проточной цитометрии клеток, отсортированных разными методами. Как показано на фиг. 3b, степень совместной экспрессии белка LYVE-1 и белка подопланина с помощью магнитных шариков LYVE-1 MicroBeads составила 71,2%, тогда как степень совместной экспрессии двух маркеров, полученных путем сортировки с Fe ₃ О ₄ Магнитные наночастицы @ KCTS-LECs-двойные антитела составляли 88,9%. Два независимых образца t тесты показали, что между двумя группами были статистически значимые различия ( P <0,05) (рис. 3c).

Анализ чистоты лимфатических эндотелиальных клеток. а Флуоресцентные микрофотографии:двухцветное изображение LYVE-1 (красный) и подпланина (зеленый) / ядер [4,6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI, синий) в изолированных LEC колоректального рака человека, отсортированных с использованием микрогранул LYVE-1 и Fe ₃ О ₄ @ KCTS-LECs-двойное антитело (масштабная линейка, 100 мкм). б Совместная экспрессия LYVE-1 (APC) и подпланина (FITC), выявленная с помощью проточной цитометрии. c Результаты проточной цитометрии, * P <0,05

Сравнение биологических функций LEC, полученных двумя разными методами сортировки

Далее мы сравнили биологические характеристики лимфатических эндотелиальных клеток, полученных двумя разными методами сортировки. Результаты испытаний клеевой трубки Матригеля показаны на рис. 4а. Клетки, полученные сортировкой Fe ₃ О ₄ Магнитные наночастицы @ KCTS-LECs-двойное антитело обладали более сильной трубкообразной способностью. Результат анализа поглощения Dil-ac-LDL эндотелиальными клетками, показанный на рис. 4b, показывает, что красная флуоресценция наблюдалась в клетках, отсортированных с помощью магнитных шариков LYVE-1 MicroBeads, но более сильная красная флуоресценция наблюдалась в клетках, отсортированных по Fe ₃ О ₄ @ KCTS-LECs-двойные магнитные наночастицы антител. Эти результаты показывают, что клетки, полученные с помощью Fe ₃ О ₄ Магнитные наночастицы @ KCTS-LECs-двойные антитела обладают более высокой чистотой, лучшей способностью к образованию трубок и фагоцитозом эндотелиальных клеток, что указывает на то, что они больше подходят для исследований лимфатических эндотелиальных клеток в опухолях.

Сравнение биологических функций LEC. а Определение способности LEC к образованию трубок in vitro с помощью кальцеина AM (зеленый) in vitro (масштабная линейка, 50 мкм). б Анализ фагоцитоза эндотелиальных клеток (DiI-меченный, красный; DAPI, синий) функции эндотелиальных клеток с использованием изолированных LEC с помощью микрогранул LYVE-1 и Fe ₃ О ₄ @ KCTS-LECs-двойное антитело (масштабная линейка, 100 мкм)

Бимодальный анализ изображений in vivo

Результаты визуализации in vivo показаны на рис. 5а. Было обнаружено, что перед инъекцией Fe ₃ флуоресценция опухоли отсутствовала. О ₄ @ KCTS-LECs-двойные магнитные наночастицы антител. После инъекции флуоресценция опухоли увеличивалась, достигая максимума через 12 часов. После этого флуоресценция со временем постепенно уменьшалась. В контрольной закрытой группе флуоресценция опухоли практически отсутствовала на протяжении всего эксперимента. Через 24 часа было замечено, что материал полностью метаболизировался из тела мышей обеих групп. Точно так же магнитно-резонансная томография, показанная на рис. 5b, показала, что визуализация опухоли постепенно ослабевает, достигая самого слабого уровня через 12 часов, после чего со временем следует постепенное восстановление. Однако визуализирующая способность опухоли в контрольной закрытой группе практически не изменилась. Можно сделать вывод, что Fe ₃ О ₄ Магнитные наночастицы @ KCTS-LECs-двойное антитело обладают высокими свойствами нацеливания на опухоль in vivo.

Флуоресцентная визуализация и МРТ моделей подкожной ксенотрансплантации колоректального рака мышей NOD / SCID. а Мышей NOD / SCID анестезировали и визуализировали с помощью системы флуоресцентной визуализации до и после инъекции через 0,5 часа, 12 часов и 24 часа. б Мышей NOD / SCID анестезировали и визуализировали с помощью МРТ-сканера 3,0 Тл до и после инъекции через 0,5 часа, 12 часов и 24 часа

Токсичность магнитных наночастиц in vitro и in vivo

Цитотоксичность магнитных нанозондов in vitro оценивали в LEC, которые были отсортированы по Fe ₃ О ₄ @ KCTS-LECs-двойные магнитные наночастицы антител. Результаты анализа CCK-8 показали, что жизнеспособность клетки была высокой после инкубации с различными концентрациями магнитного нанозонда (рис. 6а). Это говорит о том, что Fe ₃ О ₄ Магнитные наночастицы @ KCTS-LECs-двойные антитела обладают минимальной цитотоксичностью. Мы также оценили токсичность магнитных наночастиц in vivo. Самок мышей NOD / SCID обрабатывали магнитным нанозондом, а затем исследовали срезы тканей основных органов после окрашивания гематоксилин-эозином. Как показано на фиг. 6b, явных признаков некроза или воспаления не наблюдалось. Эти результаты свидетельствуют о том, что магнитный нанозонд не оказывает токсического действия in vivo. Эти результаты показывают, что магнитный нанозонд, разработанный в этом исследовании, подходит для использования в качестве детекторного зонда в исследованиях на животных и людях.

Токсичность Fe ₃ О ₄ @ KCTS-LECs - магнитный нанозонд с двойными антителами. а LEC инкубировали с различными концентрациями магнитного нанозонда, и жизнеспособность клеток измеряли через 24 и 48 часов. б Мышей NOD / SCID обрабатывали PBS или магнитным нанозондом, а срезы основных органов окрашивали гематоксилин-эозином и исследовали с помощью световой микроскопии (масштабная линейка, 100 мкм)

Discussion

It has long been know that transportation through the lymphatic system is an important pathway for tumor cell proliferation. However, compared with vascular endothelial cells (BECs) in blood vessels, LECs, as major components of lymphatic vessels, have not been fully studied. Identification of LECs markers will promote investigations on LECs and make it easier to distinguish them from BECs. LYVE-1 is a type I intact transmembrane glycoprotein receptor composed of 322 amino acid residues [20, 21], and it is presently considered to be the most specific lymphatic endothelial cells marker [22, 23]. Podoplanin is a type I transmembrane salivary mucin-like glycoprotein with a molecular weight of 38 kDa. Current research shows that podoplanin can distinguish lymphatic vessels and blood vessels very well [24, 25]. Therefore, it can be combined with other lymphatic markers to identify LECs. In this study, two antibodies were used to sort LECs, and the purity of the sorted cells was verified by immunofluorescence co-localization, flow double staining, and co-expression. The cells sorted by Fe₃ О ₄ @KCTS-LECs-double antibody magnetic nanoparticles displayed similar biological characteristics with LECs, and had stronger tube-forming ability and better phagocytic ability.

Recently, immunomagnetic-based purification methods have been used to separate different cells from mixed cultures, while magnetic beads coated with LYVE-1 or podoplanin antibodies have been used to separate specific subpopulations from crude cells populations [10, 26]. These methods only purify the target subgroups from mixed cultures. It is likely that this not only leads to incomplete isolation of LECs, but also causes contamination of heterogeneous cells such as vascular endothelial cells. Furthermore, these methods are time-consuming and are costly. Previously, several specific lymphoid markers were reported, e.g., LECs were isolated from different tissues primarily by the means of collagenase treatment. However, during primary culture, collagenase treatment may produce a mixture of cells, including vascular endothelial cells and interstitial cells.

In this study, the Fe₃ О ₄ @KCTS-LECs-diabody magnetic nano-double targeting probe was constructed using chitosan-coated ferroferric oxide which binds to highly specific target molecules LYVE-1 and podoplanin expressed on lymphatic endothelial cells. The electron microscope analysis showed that the probe had uniform appearance and good dispersibility. Zeta potential reflects the stability of a molecular probe. Highly positive or negative zeta potential values reflect high stability and low capacity to aggregate. It is generally believed that molecules with zeta potential greater than + 30 mV or less than − 30 mV have good stability. In this experiment, the probe had a zeta potential of − 32.8 ± 1.51 mV, which indicates that the probe had good stability.

Fe ₃ О ₄ is a magnetic nanoparticle oxide which has been widely used in modern medicine and biology because of its unique physical properties. It is particularly used in diagnosis systems based on magnetic resonance imaging and magnetic hyperthermia as well as in cell separation applications. The contrast agents used in MR imaging can be divided into paramagnetic iron oxide nanoparticles (T2-negative contrast agent) and Gd compounds (T1-positive contrast agent). Fe ₃ О ₄ nanoparticle resonance contrast agent is considered to be a R2-weighted, and its performance is often affected by some factors, such as (a) composition, (b) NP size, (c) surface coating, and (d) synergistic magnetic effect produced by multiple superparamagnetic Fe₃ О ₄ NP centers in a small volume [27]. In addition, it can be used in sorting of target cells under the magnetic field effect, that is, after the target cells are combined with specific probes, the target cells are sorted by magnet adsorption. For example, the lymphatic endothelial cells sorted using the probe designed in this study had better tube forming ability and endothelial cell phagocytosis. The relaxation parameter R1 or R2 is typically used to measure the quality of the MRI contrast agent, which describes the ability of the contrast agent T1 or T2 relaxation time [28]. The current NP-based T1 contrast agents are associated with cell toxicity, generating the need for better alternatives. Fe ₃ О ₄ provides good biocompatibility compared to the above-described cerium-based materials [29]. In this study, we studied the in vitro and in vivo toxicity of the nano-probes modified by chitosan on the surface of Fe₃ О ₄ . Our results showed that the probe was suitable for sorting of specific cells, and had low toxicity. It is therefore an ideal material that can be used for culturing of the sorted cells and further research on tumor metastasis through lymphatic vessels.

Here, specific target molecules such as peptides, antibodies, aptamers, etc. were attached to the surface of magnetic nanomaterials, thereby facilitating tumor diagnosis and treatment [30, 31]. This study successfully constructed the Fe₃ О ₄ @KCTS-LECs-double antibody magnetic nano-double targeting probe. This probe could bind to specific target molecules, and hence can be used to separate lymphatic endothelial cells and MR/fluorescence imaging.

Conclusions

In summary, a dual targeting magnetic nanoparticle that can detect human cancer is presented in this study. The magnetic nanoparticle probe displays high biosafety and stability. The probe could bind to specific target molecules, thereby enabling sorting of lymphatic endothelial cells. The double antibody coating customized by incorporating self-made magnetic beads produced enabled separation of pure LECs, which reduced sorting time, improved cell activity, and reduced cost. These findings indicate that the magnetic nanoprobe designed in this study is suitable for application as a detection probe in animal and human investigations. This study provides a platform for studying the mechanisms of lymphatic metastasis and role of lymphatic endothelial cells in tumors. Moreover, the Fe₃ О ₄ @KCTS-LECs-double antibody magnetic nanoparticles can be applied in fluorescence/MR molecular imaging in vivo, enabling clinical diagnosis of cancer.

Сокращения

DAPI:

4′,6-Diamidino-2-phenylindole

DMEM:

Dulbecco’s modified Eagle medium

EDC:

1-этил-3- (3-диметиламинопропил) карбодиимид гидрохлорид

FBS:

Containing no fetal bovine serum

Fe₃ О ₄ :

Magnetic ferroferric oxide

HT29:

Human colon cancer cell

KCT:

α-Ketoglutarate carboxymethyl chitosan

LECs:

Lymphatic endothelial cells

LYVE-1:

Lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1

MR:

Magnetic resonance

NHS:

N-hydroxysuccinimide

T2:

Transverse (spin-spin) relaxation time

ТЕМ:

Просвечивающая электронная микроскопия

VEGFR-3:

Vascular endothelial growth factor receptor 3