Магнитный графеновый полевой транзистор-биосенсор для ультрачувствительного обнаружения одноклассной ДНК

Аннотация

В этой работе мы представляем магнитный графеновый полевой транзистор (MGFET) биосенсор, изготовленный переносом химофазно-осажденной (CVD) графеновой пленки на стеклянную подложку для формирования проводимого канала и сенсорного слоя. Поверхность графена функционализируют 1-пиренбутановой кислотой сукцинимидным эфиром (PBASE), который выступает молекулярным якорем для иммобилизации зонда-аптамера. Магнитно маркированная комплементарная одноклассная ДНК (cDNA) захватывается гибридизацией с аптамером, и взаимодействие транслируется в измеримое изменение импеданса. Под периодически модулируемым магнитным полем импеданс MGFET демонстрирует осцилляции, амплитуда которых прямо пропорциональна концентрации cDNA. Используя этот принцип, сенсор обнаруживает одноклассную ДНК с пределом обнаружения 1 пМ. Наблюдаемое поведение рационализируется моделью, в которой магнитная сила изгибает ДНК-бисерный комплекс, тем самым модулируя двойной-слойную емкость графенового канала. Применяя периодическое магнитное поле, импеданс можно дискретизировать повторно, позволяя улучшению отношения сигнал/шум (SNR) через интеграцию по множеству периодов. Это исследование демонстрирует высокочувствительный ДНК-биосенсор и предполагает его потенциальную применимость к другим биомолекулам и клеточным анализам.

Введение

Обнаружение ДНК является ключевым для молекулярно-биологических исследований и диагностики генетических расстройств. За последнее десятилетие разрабатывались биосенсоры на основе флуоресценции, электрохимии и полевых транзисторов (FET) для этой цели, причем FET-тип сенсоры получали особое внимание благодаря их инhérентной чувствительности и селективности. Kaisti et al. представили пептид-нуклеин-кислотно-функционализированный FET для безмаркерного обнаружения одноклассной ДНК, в то время как Kim et al. изготовили CMOS-основанный зарядовый ДНК-сенсор. Графен, с его исключительной площадью поверхности, электрической проводимостью и подвижностью носителей, стал идеальной платформой для построения FET-биосенсоров. Cai и коллеги сообщили о графеновом FET (GFET), способном ультрачувствительному обнаружению ДНК через гибридизацию пептид-нуклеин-кислоты, а наша группа ранее продемонстрировала много-канальный GFET для изучения кинетики связывания ДНК и несовпадений оснований пар. В обычных GFET внешний затворный электрод генерирует электрическое поле, устанавливающее двойной слой на границе графен/электролит, тем самым модулируя проводимость устройства. Недавние исследования достигли фемтомолярных пределов обнаружения с GFET; однако эти высокая чувствительность полагаются на дорогие полупроводниковые анализаторы и Ag/AgCl опорные электроды, ограничивая практическое развертывание. Для преодоления этих проблем мы придумали магнитный графеновый FET (MGFET), использующий магнитное поле, а не электрический затвор, для модуляции графенового канала. MGFET включает CVD графеновую пленку, перенесенную на стеклянную подложку, обрамленную индиевым-олово-содержащим оксидом (ITO) электродами. Графен функционализируют PBASE, обеспечивая ковалентное присоединение зонда-аптамера, захватывающего магнитно маркированную cDNA. Под действием периодического магнитного поля импеданс MGFET осциллирует способом, коррелирующим с концентрацией cDNA. Этот магнитный подход устраняет прямой электродный контакт, упрощая интеграцию и расширяя применимость. Следующие разделы детально описывают фабрикацию, детекционную систему и базовый детекционный механизм этого нового MGFET-биосенсора.

Методы

Материалы и приборы

Стеклянная подложка с ITO электродами получена от Hua Nan Xiang Cheng Ltd. (Китай). Зонд-аптамер, cDNA и несовпадающая ДНК приобретены у Sangon Biotech Inc. (Шанхай, Китай). Последовательность аптамера: (5′‑NH₂‑TGG ACC CCC TCA TAA CGC CTC CTT TTC‑FAM‑3′); комплементарная ДНК (cDNA): (5′‑NH₂‑GAA AAG GAG GCG TTA TGA GGG GGT CCA‑3′); полностью несовпадающая ДНК: (5′‑NH₂‑TCC CCT TCT TAT GGC CTG TTT TTC AAC‑3′); и одноосновательное несовпадение ДНК: (5′‑NH₂‑GAA AAG GAG TCG TTA TGA GGG GGT CCA‑3′). PBASE и диметилсульфоксид (DMSO) получены от Sigma-Aldrich (Шанхай, Китай). Магнитные нанобисеры (MB) с карбоксильной функционализацией (10 мг/мл) приобретены у Xianfeng Nano Material Technology Co., Ltd. (Нанкин, Китай). 1-Этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид гидрохлорид, N-гидроксисукцинимид, натрия додецилбензенсульфонат (SDS) и фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS, pH 7.4) приобретены у Sigma-Aldrich (Шанхай, Китай).

Рамановский спектрометр (SPEX-1403, SPEX) характеризовал качество графена и подтвердил функционализацию PBASE. Флуоресцентный фотометр (LS55, PerkinElmer) квантовал сопряжение магнитных наночастиц с cDNA. Специальная система сбора данных регистрировала импеданс MGFET в реальном времени.

Сопряжение cDNA с MB

После ультразвуковой обработки 20 мин, 20 мкл 4 мг/мл MB суспензии смешивали с 200 мкл 2 мг/мл EDC и 200 мкл 2 мг/мл NHS на 15 мин для активации MB. Затем 20 мкл cDNA добавляли и инкубировали 2 ч при комнатной температуре с легкой агитацией. Магнитное поле затем обогащало MB/cDNA конъюгаты, которые промывали три раза PBS и ресуспендировали для дальнейшего использования.

Фабрикация MGFET

MGFET изготавливались трехступенчатым процессом: (1) CVD графеновая пленка переносилась на стеклянную пластину, служащую проводимым каналом между двумя ITO электродами (рис. 1a). (2) 10 мМ раствор PBASE в DMSO инкубировали на графене 12 ч при комнатной температуре, позволяя π-π стакирование с графеновой решеткой (рис. 1b). Избыток PBASE удаляли промывкой DMSO и PBS. (3) 2 мкМ раствор зонда-аптамера вводили и инкубировали 4 ч при комнатной температуре, обеспечивая ковалентное сопряжение через NHS-эфир PBASE (рис. 1c). Наконец, несвязанный аптамер удаляли промывкой 0.2 % SDS три раза.

Результаты и обсуждение

Характеристика MGFET

CVD графеновая пленка успешно перенесена на стеклянную подложку, как подтверждает Рамановский спектр (рис. 2). Наличие G, D и 2D пиков указывает на высокое качество графена; отношение I_2D/I_G подтверждает многослойную пленку, в то время как низкое отношение I_D/I_G свидетельствует о минимальных дефектах.

Прямое присоединение аптамеров к чистому графену затруднено из-за отсутствия функциональных групп; поэтому PBASE служит π-π закрепленным линкером. Сукцинимидная группа PBASE реагирует с 5′-NH₂ аптамера через NHS-химию (рис. 1c). Успешная иммобилизация аптамера подтверждалась интенсивностью флуоресценции 3′-концевой FAM-метки (рис. 3). Флуоресценция увеличивалась с концентрацией аптамера до насыщения при ~2 мкМ, указывая на насыщение поверхности. Следовательно, последующие эксперименты использовали 2 мкМ концентрацию аптамера.

Характеристика MB/cDNA

Трансмиссионная электронная микроскопия раскрыла, что MB имеют ~7 нм диаметр (рис. 4a,b). Для максимизации эффективности захвата, 4 мг/мл концентрация MB использовалась для активации. Эффективность сопряжения отслеживали измерением снижения флуоресценции FAM в супернатанте (рис. 4d). Полное обогащение 10 нМ cDNA достигнуто, как свидетельствует уровень флуоресценции супернатанта, вернувшийся к уровню PBS.

Анализ интенсивности магнитного поля

После 10-минутной инкубации MB/cDNA с MGFET, несвязанные MB удаляли промывкой PBS, оставляя только MB/cDNA на сенсоре (рис. 1d). Постоянный магнит на вращающемся моторе подавал периодическое магнитное поле (рис. 1e). Импеданс MGFET регистрировали с помощью специального детекционного устройства.

Связь между силой магнитного поля и импедансом MGFET исследовали для выявления оптимальных параметров поля (рис. 5). В MGFET магнитная сила изгибает MB/cDNA комплекс, изменяя расстояние между комплексом и графеновой поверхностью, что в свою очередь модулирует двойной-слойную емкость. Наблюдали три режима: (1) <100 мТл, где магнитная сила недостаточна для изгиба ДНК, давая пренебрежимое изменение импеданса; (2) 100–200 мТл, где изгиб происходит быстро, производя выраженный импедансный отклик; и (3) >220 мТл, где ДНК-стержень достигает предела изгиба, и импеданс стабилизируется (рис. 5b). Эта эластично-стержневая модель согласуется с предыдущими отчетами о механике ДНК.

Обнаружение cDNA

При фиксированном магнитном поле 240 мТл, изменения импеданса записывали по диапазону концентраций MB/cDNA (рис. 6a). Приложение периодического магнитного поля индуцировало четкие импедансные осцилляции. Для подавления шума применяли алгоритм интеграции выборок (SIA): (1) точки данных, собранные в немагнитный период (T₀), нормализовывали к нулю; (2) точки в каждый магнитный период (T_M) дискретизировали и усредняли; после четырех циклов периодическое изменение импеданса извлекали (рис. 6b). Этот подход эффективно улучшает SNR за счет повторной дискретизации.

Изменение импеданса демонстрировало линейную зависимость от концентрации cDNA (рис. 7). Высокая чувствительность обусловлена (1) механическим изгибом MB/cDNA комплекса, усиливающим модуляцию графенового двойного слоя, и (2) периодическим магнитным полем, позволяющим SIA-подавление шума. Увеличение числа магнитных периодов может еще больше улучшить SNR системы.

Селективность MGFET

Селективность оценивали с использованием полностью несовпадающей ДНК и одноосновательной несовпадающей ДНК, каждой сопряженной с MB. После 10-минутной инкубации с MGFET и промывки PBS, полностью несовпадающий MB/ДНК комплекс в значительной степени удалялся, давая пренебрежимое изменение импеданса (рис. 8a), подтверждая высокую селективность. Одноосновательная несовпадающая ДНК производила изменение импеданса слегка ниже полностью комплементарной цепи, но выше некомплементарного контроля, демонстрируя, что сенсор может дискриминировать одноосновательные несовпадения (рис. 8b). В то время как внутренняя специфичность аптамера управляет селективностью, архитектура MGFET способствует общей чувствительности.

Заключение

Мы разработали магнитный графеновый FET-биосенсор, использующий магнитно маркированную ДНК и периодическое магнитное поле для трансляции событий связывания в импедансные осцилляции. Магнитная сила механически изгибает MB/cDNA комплекс, модулируя графеновый двойной слой и давая предел обнаружения 1 пМ для одноклассной ДНК. Периодическое магнитное поле позволяет интеграционное подавление шума на основе выборки, еще больше повышая чувствительность. Помимо обнаружения ДНК, эта платформа предлагает универсальную структуру для измерения механических свойств нуклеиновых кислот и обнаружения других биомолекул или клеток.

Доступность данных и материалов

Все данные, сгенерированные или проанализированные в ходе этого исследования, включены в статью.

Аббревиатуры

cDNA:

Комплементарная магнитно маркированная одноклассная ДНК

CVD:

Химическое фазное осаждение

DMSO:

Диметилсульфоксид

FET:

Полевой транзистор

GFET:

Графеновый полевой транзистор

MBs:

Магнитные нанобисеры

MGFET:

Магнитный графеновый полевой транзистор

NHS:

N-Гидроксисукцинимид

PBASE:

1-Пиренбутановая кислота сукцинимидный эфир

PBS:

Натрий додецил сульфат фосфатно-буферный раствор

SDS:

Натрий додецилбензенсульфонат

SIA:

Алгоритм интеграции выборок

TEM:

Трансмиссионная электронная микроскопия

ITO:

Индиевый оловянный оксид