Магнитный графеновый полевой транзисторный биосенсор для обнаружения одноцепочечной ДНК

Введение

Обнаружение ДНК имеет большое значение для изучения молекулярной биологии и диагностики генетических заболеваний [1,2,3]. На сегодняшний день разработаны различные биосенсоры для обнаружения ДНК, включая флуоресцентные биосенсоры [4, 5], электрохимические биосенсоры [6,7,8,9] и биосенсоры на полевых транзисторах (FET) [10,11,12,13] ], причем последние привлекли к себе широкое внимание благодаря своей высокой чувствительности и специфичности. Kaisti et al. [12] разработали биосенсор FET для обнаружения немеченой одноцепочечной ДНК с использованием зондов пептидных нуклеиновых кислот. Kim et al. [13] изготовили датчик заряда ДНК типа полевого транзистора на основе стандартной технологии комплементарных металлооксидных полупроводников.

Благодаря высокой удельной поверхности, высокой электропроводности и отличной подвижности электронов графен был объявлен идеальным материалом для изготовления биосенсоров на полевых транзисторах [14,15,16]. Cai et al. [15] разработали биосенсор на графеновых полевых транзисторах (GFET) для сверхчувствительного обнаружения ДНК посредством гибридизации ДНК пептидных нуклеиновых кислот. Наша группа также предложила многоканальный биосенсор GFET для определения кинетики связывания и сродства гибридизации ДНК и несоответствия по одному основанию [16].

В обычном GFET электрическое поле внешнего электрода затвора создает двойной проводящий слой на границе раздела между графеновой пленкой и раствором электролита [17,18,19]. Основываясь на скрытой модели GFET [16], электрод затвора заряжает и разряжает двойной проводящий слой через электролит, тем самым модулируя проводимость GFET. Следовательно, проводимость GFET зависит от напряженности внешнего электрического поля и концентрации ионов в электролите.

В ходе исследования было обнаружено, что исследования чувствительности GFET достигли уровня fM. Например, Ping et al. [20] и Zheng et al. [21] сообщили о традиционных биосенсорах GFET с пределом обнаружения на уровне fM. Однако в приведенной выше литературе чрезвычайно высокая чувствительность достигается за счет обнаружения с помощью полупроводникового анализатора, что дорого и неудобно для практических приложений. Кроме того, электроды Ag / AgCl обычно используются в качестве электродов внешнего затвора, которые не подходят для создания интегрированных биосенсоров из-за их размера и возможности повторного использования.

Здесь был разработан биосенсор магнитного полевого транзистора (MGFET), в котором для модуляции проводимости полевого транзистора используется магнитное поле, а не электрическое поле. Проводящий канал был получен с использованием графеновой пленки химического осаждения из паровой фазы (CVD), перенесенной на стеклянную подложку с двумя электродами из оксида индия и олова (ITO). Пленка графена была функционализирована сукцинимидиловым эфиром 1-пиренбутановой кислоты (PBASE), чтобы позволить связыванию аптамера зонда захватывать и гибридизоваться с комплементарной магнитно-меченной одноцепочечной ДНК (кДНК). Применяя периодическое магнитное поле к обратной стороне MGFET, достигалось периодическое электрическое сопротивление MGFET. Кроме того, флуктуация электрического импеданса MGFET в периодическом магнитном поле была связана с концентрацией кДНК. Соответствующее лабораторное устройство обнаружения было сконструировано для определения импеданса MGFET в режиме реального времени. Поскольку магнитное поле не контактирует напрямую с MGFET, подготовленные здесь MGFET легче интегрировать и применять, чем обычные биосенсоры GFET. Подготовка MGFET, создание лабораторной системы обнаружения и принцип обнаружения были подробно описаны в этой статье.

Методы

Материалы и инструменты

Стеклянная подложка с ITO-электродами была приобретена у Hua Nan Xiang Cheng Ltd. (Китай). Аптамер зонда, кДНК и несовпадающая ДНК были приобретены у Sangon Biotech Inc. (Шанхай, Китай). Последовательность аптамера зонда была (5'-NH ₂ -TGG ACC CCC TCA TAA CGC CTC CTT TTC-FAM-3 '), последовательность комплементарной ДНК была (5'-NH ₂ -GAA AAG GAG GCG TTA TGA GGG GGT CCA-3 '), последовательность полностью несовпадающей ДНК была (5'-NH ₂ -TCC CCT TCT TAT GGC CTG TTT TTC AAC-3 '), а последовательность несоответствующей одноосновной ДНК была (5'-NH ₂ -GAA AAG GAG TCG TTA TGA GGG GGT CCA-3 '). PBASE и диметилсульфоксид (ДМСО) были получены от Sigma-Aldrich (Шанхай, Китай). Магнитные наночастицы (МБ), модифицированные карбоксильными группами (10 мг / мл), были получены от Xianfeng Nano Material Technology Co., Ltd. (Нанкин, Китай). Гидрохлорид 1-этил-3- (3-диметиламинопропил) карбодиимида, N-гидроксисукцинимид, додецилбензолсульфонат натрия (SDS) и фосфатно-солевой буферный раствор додецилсульфата натрия (PBS, P5368-10PAK; pH 7,4) были приобретены у Sigma-Aldrich (Шанхай). , Китай).

Рамановская микроскопическая система (SPEX-1403, SPEX) использовалась для характеристики качества графена, а также для проверки функционализации MGFET. Флуоресцентный фотометр (LS55, PerkinElmer) использовали для характеристики связывания магнитных наночастиц с кДНК. Для регистрации импеданса MGFET в реальном времени использовалась лабораторная система сбора данных.

Связывание кДНК с МБ

После равномерного диспергирования с помощью ультразвука в течение 20 минут 20 мкл суспензии МБ, модифицированных карбоксильными группами, смешивали с 200 мкл 1-этил-3- (3-диметиламинопропил) карбодиимид гидрохлорида (2 мг / мл) и 200 мкл N- гидроксисукцинимид (2 мг / мл) в течение 15 мин для получения активированных МБ [22, 23]. Затем к раствору МБ добавляли 20 мкл раствора кДНК и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре при непрерывном осторожном встряхивании. Затем вводили магнитное поле для обогащения образцов кДНК через МБ. Конъюгаты магнитных наночастиц / ДНК (МБ / кДНК) трижды промывали PBS и диспергировали в PBS для будущего использования.

Изготовление MGFET

Подготовка MGFET подробно описана ниже. Во-первых, пленка графена CVD была перенесена на стеклянную пластину в качестве проводящего канала между двумя электродами ITO (рис. 1а), как описано ранее [18,19]. Во-вторых, PBASE (10 мМ), растворенный в ДМСО, вводили в MGFET на 12 ч при комнатной температуре и позволяли полностью прореагировать с графеном посредством π – π-стэкинга (рис. 1b). Затем MGFET последовательно промывали ДМСО и PBS для удаления непрореагировавшего PBASE. В-третьих, 2 мкМ аптамера зонда вводили в MGFET и инкубировали с PBASE в течение 4 ч при комнатной температуре, позволяя аптамеру зонда в достаточной степени реагировать с PBASE (рис. 1c). Затем MGFET были соответственно промыты 0,2% SDS три раза для удаления любого несвязавшегося аптамера зонда.

Принцип функционирования и обнаружения полевых транзисторов MGFET. а Пленка графена, выращенная методом химического осаждения из газовой фазы. б Функционализация графена с помощью PBASE. c Иммобилизация аптамера зонда через PBASE. г Гибридизация аптамера зонда с кДНК. е Фотография устройства обнаружения

Результаты и обсуждение

Характеристики MGFET

Графеновая пленка, полученная методом CVD, переносилась на стеклянную подложку в качестве проводящего канала между двумя ITO-электродами (рис. 1а). Перенесенная графеновая пленка характеризовалась рамановским спектром (рис. 2). Появление трех характерных пиков графена продемонстрировало успешный перенос графеновой пленки на стеклянную подложку [24, 25]. Соотношение интенсивностей между полосой 2D и полосой G (I _2D / I _G ) указывает на то, что перенесенный графен представляет собой многослойную пленку [26]. Кроме того, соотношение интенсивностей между полосой D и полосой G (I _D / I _G ) был небольшим, что указывало на очень низкую плотность дефектов.

Рамановский спектр

Из-за отсутствия функциональных групп цепи аптамеров на графеновой пленке CVD было трудно модифицировать. Таким образом, PBASE на основе своей ароматической пиренильной группы был модифицирован на графеновых пленках посредством π – π-стэкинга в качестве линкера. На другом конце PBASE сукцинимидная часть PBASE может быть связана с 5'-NH ₂ -меченый зонд-аптамер на основе реакции сшивания N-гидроксисукцинимидом (NHS) (рис. 1c). Чтобы оценить связывание аптамера зонда с графеновой пленкой, 3'-конец аптамера зонда метили с помощью флуорофора FAM (последовательность:5'-NH ₂ -TGG ACC CCC TCA TAA CGC CTC CTT TTC-FAM-3 '). Сразу после введения аптамера интенсивность флуоресценции явно усилилась, что свидетельствует об успешной его модификации на поверхности графена (рис. 3). Увеличение концентрации аптамера зонда приводило к увеличению интенсивности флуоресценции, достигая постоянного значения и, следовательно, указывая на насыщение аптамера зонда на MGFET примерно на 2 мкМ. Поэтому последующие эксперименты проводились при концентрации аптамера зонда 2 мкМ.

Характеристика модификации MGFET с помощью аптамера зонда. Полоса ошибок представляет собой стандартное отклонение 5 независимых анализов

Характеристика МБ / кДНК

Морфологию МБ и конъюгатов МБ / кДНК охарактеризовали с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) (рис. 4а, б). Гранулометрический состав МБ показал средний размер частиц приблизительно 7 нм (фиг. 4c). Для обеспечения чувствительности и точности биочувствительности кДНК, МБ должно быть избыточным для кДНК, чтобы полностью захватить кДНК. МБ в концентрации 4 мг / мл были активированы для обеспечения связывания с образцами кДНК, используемыми здесь. Посредством мечения кДНК с помощью FAM интенсивность флуоресценции использовалась для характеристики эффективности связывания и оптимизации концентрации кДНК (фиг. 4d). Действительно, интенсивность флуоресценции супернатанта, очевидно, снизилась после введения МБ в растворы кДНК, указывая на то, что кДНК была захвачена и обогащена МБ. Успешный захват кДНК МБ был подтвержден наблюдением, что при концентрации кДНК 10 нМ интенсивность флуоресценции супернатанта была эквивалентна интенсивности флуоресценции PBS, что указывает на то, что вся кДНК была захвачена и обогащена МБ (рис. 4d). ).

Характеристика связывания МБ / кДНК. а ТЭМ МБ. б ПЭМ конъюгатов МБ / кДНК. c Гранулометрический состав МБ. г Характеристика связывания MB / кДНК (FAM). Полоса ошибок представляет собой стандартное отклонение 5 независимых анализов

Анализ интенсивности магнитного поля

Конъюгаты MB / кДНК добавляли в MGFET на 10 мин, чтобы обеспечить полную гибридизацию кДНК с аптамером зонда. Поскольку аптамер зонда не мог соединиться с МБ без модифицированных аминогрупп, избыток МБ можно было удалить путем трехкратной промывки MGFET с помощью PBS. Следовательно, только конъюгаты MB / кДНК остались на MGFET (рис. 1d). Постоянный магнит был установлен на вращающийся двигатель для приложения периодического магнитного поля к MGFET (рис. 1e). Для регистрации колебаний импеданса полевых транзисторов MGFET использовалось созданное в лаборатории устройство обнаружения.

Поскольку импеданс MGFET модулировался магнитным полем в качестве заднего затвора, была исследована корреляция между напряженностью магнитного поля и импедансом MGFET для оптимизации параметров напряженности магнитного поля (рис. 5). Обычно считается, что двойной проводящий слой, образованный между графеном и электролитом, модулируется внешним электрическим полем, тем самым модулируя проводимость полевых транзисторов [19, 27, 28]. В MGFET с помощью магнитной силы между MB и магнитным полем расстояние между конъюгатами MB / кДНК и графеновой пленкой регулируется механически, тем самым модулируя двойной проводящий слой MGFET [29, 30]. Импеданс биосенсоров MGFET изменялся с увеличением напряженности магнитного поля в три этапа, что можно объяснить, если принять цепь MB / кДНК в качестве эластичного тонкого стержня [31]. В данной работе первый этап происходил при напряженности магнитного поля менее 100 мТл. На основе модели эластичного тонкого стержня цепочек ДНК, поскольку сила магнитного поля меньше, чем радиальная опорная сила нити ДНК, сила магнитного поля трудно заставить нить ДНК изгибаться; поэтому полевые транзисторы MGFET не чувствительны к магнитному полю. На втором этапе с напряженностью магнитного поля от 100 до 200 мТл напряженность магнитного поля достаточна для преодоления радиальной опорной силы эластичного тонкого стержня ДНК, что приводит к быстрому изгибу МБ / кДНК, а затем к чувствительной реакции MGFETs к магнитному полю. Наконец, на третьем этапе с напряженностью магнитного поля выше 220 мТл изгиб эластичного стержня ДНК достигает своего предела; следовательно, MGFET не будет реагировать на изменение магнитного поля, что приведет к стабильному импедансу MGFET, как показано на рис. 5b.

Влияние напряженности магнитного поля на импеданс MGFET. а Импеданс MGFET при изменяющейся напряженности магнитного поля во временной области. б Связь между импедансом MGFET и напряженностью магнитного поля. Полоса ошибок представляет собой стандартное отклонение 5 независимых анализов

Обнаружение кДНК

Изменения импеданса MGFET при различных концентрациях конъюгата МБ / кДНК были измерены при фиксированной напряженности магнитного поля 240 мТл, чтобы определить возможность и чувствительность обнаружения кДНК.

Импеданс MGFET при каждой концентрации кДНК регистрировали в режиме реального времени (рис. 6а). Когда постоянный магнит был загружен на заднюю часть MGFET, импеданс быстро увеличивался. И наоборот, при приложении периодического магнитного поля наблюдалось периодическое изменение импеданса. На основе этой периодичности импеданса был использован алгоритм интегрирования выборки (SIA) для увеличения отношения сигнал / шум MGFET. Учитывая период без приложения магнитного поля T ₀ а период с приложением магнитного поля был T _M (Рис. 6a), SIA можно описать следующими шагами:(1) во время T ₀ , все точки данных, созданные шумом, были нормализованы к нулю, (2) точки данных, полученные в течение каждого T _M Период был выбран и усреднен по порядку. После обработки SIA в течение четырех циклов было получено периодическое изменение импеданса MGFET, как показано на рис. 6b. Теоретически отношение сигнал / шум MGFET можно эффективно улучшить, используя достаточно длительное время выборки.

а Временной диапазон колебаний импеданса при различных концентрациях кДНК. б Изменения импеданса MGFET в зависимости от концентрации кДНК

Изменения импеданса в MGFET положительно коррелировали с концентрацией кДНК (рис. 6b). Была оценена корреляция между изменением импеданса MGFET и концентрацией кДНК (рис. 7). Высокая чувствительность биосенсоров MGFET в данной работе в основном основана на следующих двух аспектах:во-первых, механическое движение конъюгатов МБ / кДНК может усилить эффект модуляции на двойном проводящем слое по сравнению со случаем одной только ДНК, а во-вторых, Так как периодическое магнитное поле могло быть применено для создания периодических изменений импеданса MGFET, на основе принципа интегрирования выборки, только импеданс MGFET с магнитным полем был измерен и интегрирован для уменьшения шума. Следовательно, отношение сигнал / шум системы можно значительно оптимизировать, увеличив количество периодов внешнего магнитного поля.

Связь между импедансом MGFET и концентрацией целевой ДНК. Полоса ошибок представляет собой стандартное отклонение 5 независимых анализов

Избирательность MGFET

Специфичность MGFET оценивалась путем обнаружения двух различных последовательностей ДНК-мишени, включая полностью несовпадающие цепи ДНК и несогласованные одноосновные цепи ДНК. Подобно процедуре, описанной выше, полностью несовпадающая ДНК (последовательность:5'-NH ₂ -TCC CCT TCT TAT GGC CTG TTT TTC AAC-3 ') и несогласованная по одному основанию ДНК (последовательность:5'-NH ₂ -GAA AAG GAG TCG TTA TGA GGG GGT CCA-3 ') были связаны с MB соответственно. Несоответствующий MB / ДНК, растворенный в растворе PBS, добавляли в биосенсоры MGFET на 10 мин для достаточной реакции с аптамером. MGFET трижды промывали PBS для удаления несовпадающей ДНК. Для полностью несовпадающих цепей ДНК из-за того, что конъюгат MB / ДНК не мог гибридизоваться с аптамером, почти все конъюгаты MB / ДНК были удалены. Следовательно, добавление полностью несовпадающих МБ / ДНК почти не влияет на проводимость графена, как показано на рис. 8, что указывает на высокую селективность биосенсора. Кроме того, мы также исследовали селективность биосенсоров через одноосновные несогласованные цепи ДНК, как показано на рис. 7. Можно обнаружить, что изменение импеданса MGFET с одноосновными несогласованными цепями было немного ниже, чем у комплементарных цепей, и выше, чем некомплементарная целевая цепь при каждой определенной концентрации. Следовательно, несогласованная нить с одним основанием может быть обнаружена в этой работе. Хотя аптамер и комплементарные цепи ДНК являются коммерческими продуктами, которые в основном определяют селективность биосенсоров, MGFET и его система обнаружения также внесли свой вклад в высокую чувствительность обнаружения ДНК.

Связь между импедансом MGFET и концентрацией полностью несовпадающей ДНК. Полоса ошибок представляет собой стандартное отклонение 5 независимых анализов

Выводы

Здесь был представлен биосенсор MGFET на основе графена и магнитных наночастиц для обнаружения кДНК. В MGFET магнитные наночастицы были модифицированы на конце последовательности кДНК. За счет магнитной силы между МБ и магнитного поля расстояние между конъюгатами МБ / кДНК и графеновой пленкой механически контролировалось, тем самым модулируя двойной проводящий слой MGFET. Кроме того, мы также можем сделать вывод, что для конкретной цепи ДНК импеданс MGFET будет отражать напряжение цепи ДНК, которое, в свою очередь, отражает изгиб цепи ДНК (вставка, рис. 5b). Таким образом, настоящие MGFET могут быть использованы для изучения механических параметров цепей ДНК. Следовательно, MGFET могут не только функционировать как биосенсор для обнаружения кДНК, но также потенциально могут обнаруживать механические параметры цепей ДНК.

Доступность данных и материалов

Все данные, полученные или проанализированные в ходе этого исследования, включены в статью.

Сокращения

кДНК:

Комплементарная одноцепочечная ДНК с магнитной меткой

CVD:

Химическое осаждение из паровой фазы

DMSO:

Диметилсульфоксид

FET:

Полевой транзистор

GFET:

Графеновый полевой транзистор

МБ:

Магнитные наночастицы

MGFET:

Магнитный графеновый полевой транзистор

NHS:

N-гидроксисукцинимид

PBASE:

Сукцинимидиловый эфир 1-пиренбутановой кислоты

PBS:

Натрийдодецилсульфат-фосфатный буферный раствор

SDS:

Додецилбензолсульфонат натрия

SIA:

Пример алгоритма интеграции

ТЕМ:

Просвечивающая электронная микроскопия

ITO:

Оксид индия и олова