Золотые наночастицы модулируют метаболизм тестостерона в микросомах человеческой печени: влияние размера, химии поверхности и белковой короны

Аннотация

Комплексы золотых наночастиц (AuNP) с белковой короной могут изменять метаболизм тестостерона (TST), опосредованный цитохромом P450 (CYP), за счет модификации их физико-химических свойств. Мы исследовали влияние размера наночастиц, химии поверхности и белковой короны из человеческой плазмы (PC) на метаболизм тестостерона в пуловой смеси микросом человеческой печени (pHLM). Изучались AuNP размером 40 и 80 нм, функционализированные разветвленным полиэтиленимином (BPEI), липоевой кислотой (LA) или полиэтиленгликолем (PEG) — как «голые», так и с белковой короной. В pHLM «голые» AuNP размером 40 нм ингибилировали образование пяти гидроксилированных метаболитов тестостерона, тогда как частицы 80 нм оказывали более слабый эффект. Белковая корона в значительной степени нивелировала это ингибирование. Неожиданно было обнаружено, что «голые» AuNP увеличивают выработку андростендиона. В микросомах отдельных доноров наблюдалась интериндивидуальная вариабельность: большинство AuNP подавляли метаболизм тестостерона в неингибирующих концентрациях, тогда как PC-PEG-AuNP стимулировали продукцию андростендиона. Эти результаты указывают на потенциал AuNP как эндокринных диструкторов, модулирующих метаболизм тестостерона, и предоставляют основу для скрининга других наноматериалов.

Введение

Золотые наночастицы (AuNP) широко применяются в доставке лекарств, диагностике и потребительских товарах благодаря уникальным оптическим и физическим свойствам. При контакте с биологическими жидкостями AuNP быстро адсорбируют белки, формируя корону, которая изменяет химию поверхности, конформацию белков и последующие биологические ответы, включая цитотоксичность, клеточный захват и активность ферментов CYP. Ин витро исследования показывают, что AuNP могут быть токсичны для человечных гепатоцитов, клетки гепатомы C3A и сперматозоидов, однако наличие белковой короны может ослаблять или усиливать эти эффекты в зависимости от химии поверхности. Формирование короны также препятствует клеточному захвату в различных типах клеток независимо от размера или заряда наночастиц.

Ферменты CYP в печени метаболизуют эндогенные и экзогенные соединения. Различные агенты — лекарственные препараты, пестициды и наночастицы — могут нарушать синтез и метаболизм стероидных гормонов, что ведет к изменению физиологических функций. Тестостерон (TST) является первичным андрогеном и субстратом для CYP3A4, который гидроксилирует его в 6β-OH-TST. Дополнительные гидроксилирования CYP3A4 дают 2β-OH-TST, 15β-OH-TST, 16α-OH-TST и 16β-OH-TST, тогда как CYP2D6 деалкилирует тестостерон до андростендиона (AD). Предыдущие работы показывают, что «голые» и покрытые короной AuNP модулируют широкий спектр ферментов CYP, включая CYP1A2, 2C9, 2C19, 2D6, 2E1 и 3A4. Серебряные наночастицы (AgNP) также подавляют активность CYP3A4 в микросомах человеческой печени. BPEI- и LA-функционализированные AuNP снижают активность CYP3A4 в клетках C3A, но белковая корона ослабляет этот эффект. Ин виво небольшие AuNP накапливаются в печени и селезенке, изменяя экспрессию гепатических Cyp1a1 и Cyp2b. Учитывая эти данные, настоящее исследование изучает, как белковая корона влияет на размер, заряд и химию поверхности AuNP в контексте CYP-опосредованного метаболизма тестостерона в pHLM и микросомах отдельных доноров.

Методы

Реактивы

Тестостерон, его метаболиты и ¹³C₃-маркированный тестостерон получены от MilliporeSigma (Сент-Луис, МО). Дополнительные реактивы приобретены у Steraloids или MilliporeSigma. Растворители LC-MS класса — от Fisher Scientific; ультрачистая вода получена системой Merck Synergy® UV-R.

Микросомы человеческой печени

Пуловые микросомы (pHLM) от 200 доноров (100 мужчин, 100 женщин) и микросомы отдельных доноров получены от Corning Inc. (Шарлотт, NC). Донор-специфическая активность CYP приведена в дополнительной таблице S1.

Синтез золотых наночастиц

Биочистые AuNP 40 и 80 нм, функционализированные BPEI, LA или PEG, приобретены у nanoComposix. Ядро синтезировалось восстановлением HAuCl₄·3H₂O в K₂CO₃ с последующим выдерживанием и тангенциальной потоковой фильтрацией (TFF). Поверхностная функционализация: LA (0.2:1 масс. соотношение) или PEG (0.5:1) добавлялись с последующей TFF и стерильной фильтрацией. Поверхности BPEI получали химией EDC/NHS, связывая карбоксил LA с аминами BPEI; несвязанный BPEI удаляли TFF и центрифугацией.

Подготовка белковой короны

Пуловая человеческая плазма (n=5) инкубировали с 40- или 80-нм AuNP при 55% объема плазмы в шейкере (37 °C, 250 об/мин, 1 ч). PC-AuNP осаждали центрифугированием (20 000×g, 20 °C, 20 мин), трижды вымывали ФСБ и ресуспендировали в ФСБ для характеристики.

Физико-химическая характеристика

Динамическое световое рассеяние (DLS) и передаточная электронная микроскопия (TEM) измеряли размер частиц, полидисперсность и дзета-потенциал. Измерения проводили в деионизированной воде, ФСБ и буфере инкубации микросом (pH 7.4) в 0 мин и 45 мин (37 °C). TEM-сетки изучали на Tecnai G2 Spirit BioTWIN (120 кВ). UV-Vis спектры регистрировали на Spectra Max i3.

Ин витро метаболизм тестостерона

Линейность метаболизма тестостерона (10 мкМ) подтверждена в диапазоне 1.3–9.3 мг/мл белка микросом до 60 мин. pHLM инкубировали с тестостероном и различными концентрациями «голых» или PC-AuNP (0–571 мкг/мл). Реакции инициировали с NADPH (0.25 мМ NADP, 2.5 мМ глюкозо-6-фосфат, 2 ЕД/мл дегидрогеназы) или без него и останавливали через 45 мин при 37 °C 4% фосфорной кислотой. Свертки центрифугировали, хранили при –20 °C и обрабатывали для LC-MS/MS. Микросомы отдельных доноров обрабатывали аналогично при 10 мкг/мл AuNP.

Стандарты и подготовка проб

Первичные стандарты (1 мМ) и ВС (¹³C₃-TST) готовили в метаноле. Рабочие стандарты: 0.01–200 мкМ. КА: 0.01, 0.05 и 0.1 мкМ. Пробы допикивали ВС, экстрагировали на пластинах Oasis PRIME HLB, вымывали, элюировали, разбавляли и анализировали LC-MS/MS.

Жидкостная хроматография-масс-спектрометрия

Сепарация на колонке Waters UPLC HSS T3 (2.1 × 50 мм, 1.8 мкм) при расходе 600 мкл/мин. Градиент: 30% B до 98% B за 8.4 мин. ESI+ источник: 4000 В, 150 °C; десольвация при 450 °C. MRM-переходы в доп. таблице S2. Калибровочные кривые: 0.001–20 мкМ. LOD и LOQ: 0.001 и 0.005 мкМ соответственно.

Статистический анализ

t-критерий Стьюдента оценивал различия в D_H и PDI. IC₅₀ и EC₅₀ рассчитывали по уравнению Хилла в GraphPad Prism®. Однофакторный дисперсионный анализ с пост-хок тестом Тьюки (p < 0.05) оценивал эффекты AuNP. Корреляция Пирсона связывала активность CYP с выработкой метаболитов.

Результаты и обсуждение

Физико-химические свойства AuNP

TEM подтвердила монодисперсность всех «голых» и PC-AuNP, за исключением 40- и 80-нм PC-BPEI-AuNP, демонстрировавших агрегацию в ФСБ. Гидродинамические диаметры (D_H) увеличивались для 40-нм «голых» BPEI- и LA-AuNP и PC-PEG-AuNP за 45 мин, в то время как для 80-нм PC-LA-AuNP — уменьшались. PDI рос для 40-нм «голых» и PC-PEG-AuNP, дзета-потенциал падал для «голых» BPEI-AuNP. Эти изменения соответствуют предыдущим данным о влиянии короны на размер, абсорбцию и морфологию наночастиц.

Метаболизм тестостерона в пуловых микросомах

В pHLM детектировали шесть метаболитов тестостерона (пять гидроксилированных и AD). «Голые» 40- и 80-нм AuNP доза-зависимо ингибилировали выработку 2β-OH-TST, 6β-OH-TST и 15β-OH-TST (IC₅₀: 416–1113 мкг/мл). Ингибирование 16α- или 16β-OH-TST не наблюдалось, за исключением легкого подавления 16β-OH-TST 40-нм BPEI-AuNP при максимальной дозе. Парадоксально, «голые» AuNP повышали продукцию AD при высоких концентрациях (4.3 pmol мг⁻¹ мин⁻¹ для 40-нм BPEI-AuNP). PC-покрытые AuNP практически устранили ингибирование гидроксилирования; корона также сгладила стимуляцию AD для 80-нм LA-AuNP. В целом, «голые» AuNP снижали гидроксилирование, иногда усиливая деалкилирование, эффект, атениуируемый белковой короной.

Вариабельность в микросомах отдельных доноров

Донор-специфическая активность CYP сильно коррелировала с формированием метаболитов: 6β-OH-TST коррелировала с CYP2C19 (r = 0.99, p = 0.01) и CYP3A4 (r = 0.99, p = 0.03); AD — обратно с CYP4A11 (r = –0.98, p = 0.04). AuNP в неингибирующих концентрациях по-разному модулировали выработку метаболитов у разных доноров, отражая CYP-полиморфизмы и фенотипы. Размер, покрытие поверхности и формирование короны значимо влияли на уровни метаболитов (p < 0.0001). Например, PC-PEG-AuNP активировали продукцию AD у донора HDC3 независимо от размера частиц.

Заключение

AuNP, особенно «голые» частицы 40 и 80 нм, ингибируют гидроксилирование тестостерона и могут стимулировать деалкилирование в пуловых микросомах. Наличие биологически релевантной белковой короны смягчает эти эффекты, особенно для катионных BPEI-AuNP. В микросомах отдельных доноров эффекты AuNP зависят от химии поверхности и варьируют с индивидуальной активностью CYP, что подчеркивает их потенциал как эндокринных диструкторов. Полученные результаты создают каркас для оценки влияния других наноматериалов на стероидный метаболизм и выявления уязвимых субпопуляций.

Доступность данных и материалов

Все данные, полученные или проанализированные в ходе исследования, включены в статью и дополнительный файл.

Аббревиатуры

11β-OH TST

11β-гидрокситестостерон

15β-OH TST

15β-гидрокситестостерон

16α-OH TST

16α-гидрокситестостерон

16β-OH TST

16β-гидрокситестостерон

2α-OH TST

2α-гидрокситестостерон

2β-OH TST

2β-гидрокситестостерон

6α-OH TST

6α-гидрокситестостерон

6β-OH TST

6β-гидрокситестостерон

AD

Андростендион

AgNP

Серебряные наночастицы

ANOVA

Однофакторный дисперсионный анализ

AuNP

Золотые наночастицы

BPEI

Разветвленный полиэтиленимин

CFS

Хлорпирифос

CYP

Цитохром P450

DEET

Диэтилтолуамид

D_H

Гидродинамический диаметр

DI

Деионизированная вода

DLS

Динамическое световое рассеяние

EC₅₀

Полумаксимальная активирующая концентрация

EDC/NHS

1-Этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид/N-гидроксисукцинимид

ESI⁺

Положительная электроспрей-ионизация

HLM

Микросомы человеческой печени

HSD

Критерий честной значимой разницы Тьюки

IC₅₀

Полумаксимальная ингибирующая концентрация

ISTD

Внутренний стандарт

LA

Липоевая кислота

LC-MS/MS

Жидкостная хроматография-тандемная масс-спектрометрия

LOD

Предел обнаружения

LOQ

Предел квантификации

MRM

Множественный реакционный мониторинг

NADP

Никотинамидадениндинуклеотидфосфат

NADPH

Восстановленный NADP

naked

Без короны

NP

Наночастица

PBS

Фосфатно-буферный раствор

PC

Белковая корона человеческой плазмы

PDI

Индекс полидисперсности

PEG

Полиэтиленгликоль

pHLM

Пуловые микросомы человеческой печени

QC

Контроль качества

SWCNT

Однослойные углеродные нанотрубки

TEM

Проходная электронная микроскопия

TFF

Тангенциальная потоковая фильтрация

TiO₂

Диоксид титана

TST

Тестостерон

UPLC TQD

Ультрабыстродействующая жидкостная хроматография с трипльным квадрупольным детектором