Микрожидкостное устройство, непосредственно изготовленное на электродах с трафаретной печатью для сверхчувствительного электрохимического определения PSA

Фон

Микрожидкостная система - это процесс манипулирования жидкостями небольшого объема (10 ⁻⁹ до 10 ⁻¹⁸ L) внутри каналов размером от десятков до сотен микрометров [1]. Эта технология показала большой потенциал в биомедицине, мониторинге окружающей среды и анализе безопасности пищевых продуктов. В частности, микрофлюидные устройства (МФУ) обычно демонстрируют следующие преимущества, включая небольшие размеры, сниженный расход реагентов, одновременное обнаружение нескольких образцов, повышенную надежность, чувствительность, а также широкую и крупномасштабную интеграцию [2,3,4].

Электрохимические датчики широко интегрированы и снабжены дефисами для отборов проб, обработки жидкостей, разделения и других инженерных сценариев обнаружения [5]. Применение электрохимических сенсоров для обнаружения биомолекул является многообещающим, поскольку электрохимические сенсоры обладают многочисленными преимуществами, такими как высокая чувствительность и селективность, надежная воспроизводимость, простота использования для непрерывного анализа на месте, минимальная подготовка образца, относительно низкая стоимость и кратковременный отклик. Электрохимическая система может быть легко интегрирована в микрофлюидную систему [6, 7], и это дает преимущества по сравнению с традиционной аналитической платформой [8,9,10], такие как простота подготовки образцов, превосходная чувствительность и универсальность, а также удаление громоздких оптические компоненты [11, 12].

В этом исследовании была использована простая, недорогая и универсальная стратегия изготовления МФД с электрохимическим зондированием с использованием имеющихся в продаже электродов с трафаретной печатью для диагностики в месте оказания медицинской помощи. Разработанное устройство было определено как CASPE-MFD (коммерчески доступные микрофлюидные устройства на основе электродов с трафаретной печатью). Микрофлюидные каналы полидиметилсилоксана (PDMS) сначала были сформированы с использованием стандартной фотолитографии, а CASPE-MFD были изготовлены путем прямого связывания микрофлюидных каналов PDMS на коммерчески доступном электроде с трафаретной печатью (рис. 1). Электрод с трафаретной печатью использовался непосредственно и был покрыт тонким слоем стекла с использованием золь-гель метода [13]. Впоследствии микрожидкостные каналы PDMS были прикреплены к электроду после плазменной обработки их поверхностей. CASPE-MFD способны количественно определять концентрацию различных аналитов в биологических жидкостях, таких как фосфатный буферный раствор (PBS) и образцы сыворотки. CASPE-MFD использовались для демонстрации обнаружения и количественной оценки биомаркера простат-специфического антигена (PSA) в буферных растворах PBS и образцах сыворотки человека с использованием хроноамперометрии (CA) и прямоугольной вольтамперометрии (SWV). Обнаружение PSA в этом устройстве показало высокую чувствительность, а предел обнаружения (LOD) для PSA составляет 0,84 пг / мл (25,8 фМ). LOD более чем в 100 раз более чувствителен, чем клинический предел обнаружения 0,1 нг / мл для коммерческих тестов [14], и лучше, чем у других устройств [3, 15, 16]. CASPE-MFD является портативным, простым в использовании и может интегрировать другие компоненты, такие как системы подготовки и разделения проб.

а Процесс изготовления микрофлюидных каналов PDMS, сформированных с помощью фотолитографии SU-8. б Процесс изготовления коммерчески доступного микрофлюидного устройства на основе электродов с трафаретной печатью. CASPE-MFD включает микрожидкостные каналы PDMS, два печатных золотых электрода в качестве рабочего и противоэлектрода и напечатанный серебряный электрод в качестве электрода псевдо-сравнения. c Коммерчески доступное микрофлюидное устройство на основе электродов с трафаретной печатью

Материалы и методы

Химические реактивы и материалы

Простатоспецифический антиген (PSA) и мультиклональное антитело против PSA пероксидаза (HRP) были приобретены у Petsec Energy Ltd. Биотинилированное антитело против PSA, магнитные шарики стрептавидина, бычий сывороточный альбумин и гидрохинон были от Fisher Scientific. Твин-20, перекись водорода (H ₂ О ₂ ; 30%) и ферроценкарбоновая кислота были от Sigma-Aldrich. SU-8 2075 был от MicroChem Corp. Предварительный полимер полидиметилсилоксана (ПДМС) и отвердитель были приобретены у Dow Corning. Все иммунореагенты растворяли в буферных растворах PBS 1 × pH 7,4 от KD Medical Solutions. Все химические реагенты были приготовлены с использованием сверхчистой воды из системы очистки воды Millipore Milli-Q.

Инструменты

Флуоресцентный микроскоп выполняли на Olympus U-CMAD3 (Olympus, Япония). Устройства μCSPE были изготовлены на плазменном очистителе PDC-32G (Harrick Plasma, США). Все электрохимические измерения были выполнены на приборе CHI 760B (CHI, Китай) с традиционной трехэлектродной системой, которая состоит из двух печатных золотых электродов в качестве рабочего и противоэлектрода, соответственно, и напечатанного серебряного электрода в качестве псевдоэлектрода сравнения (рис. ).

Производство микрожидкостных микросхем

Микрофлюидные каналы PDMS были сформированы с использованием стандартной фотолитографии. Вкратце, силиконовая пластина, промытая смешанным раствором (H ₂ SO ₄ / H ₂ О ₂ =7/3) с последующей очисткой ультрачистой водой, покрыли фоторезистом СУ-8 2075. Затем пластину запекали при 65 ° C в течение 7 минут, затем при 95 ° C в течение 40 минут для удаления растворителей и подвергали фотоэкспозиции УФ-светом в течение 15 секунд через фотошаблон. Вся система была запечена при 65 ° C в течение 5 минут, а затем при 95 ° C в течение 15 минут для стабилизации полимеризации. Неполимеризованный фоторезист удаляли, пропитывая кремниевую пластину проявителем SU-8 и промывая изопропанолом и деионизированной водой. Смеси раствора преполимера ПДМС и отвердителя (10,1) были нанесены на предварительно описанную силиконовую пластину, отверждены при 65 ° C в течение 2 часов и отслоены [17].

Имеющийся в продаже печатный электрод был покрыт слоем стекла с использованием золь-гель метода. Вкратце, тетраэтоксисилан (TEOS), MTES, этанол и вода полностью перемешивали в пропорции 1:1:1:1 и обрабатывали ультразвуком в течение 5 минут. Смеси помещали в печь при 65 ° C на ночь. Электрод помещали на горячую пластину на 5 мин при 80 ° C перед нанесением покрытия на стекло, а затем смазывали смесями прекурсоров с помощью кисти, чтобы смеси не попадали на поверхность электрода. После размазывания электрод сушили при комнатной температуре. Затем микросхему PDMS и покрытый стеклом электрод обрабатывали O ₂ . плазму в течение 30 с и прилипли друг к другу.

Хроноамперозметрические эксперименты

Хроноамперометрические эксперименты проводили в 1 × pH 7,4 PBS, содержащем 4,5 мМ гидрохинона и 0,1 мМ растворов перекиси водорода при ступенчатом потенциале - 2,0 мВ (по сравнению с серебряным псевдоэлектродом сравнения), и построили калибровочную кривую для концентрации PSA от 0 до 10 нг мл ^-1 . Вкратце, мы ввели 50 мкл 0,2 мг / мл ^-1 . конъюгированные с магнитными шариками антитела против PSA к устройствам μCSPE из расчета 50 мкл мин ^-1 , и тщательно промыли, используя 100 мкл pH 7,4 PBS из расчета 50 мкл мин ^-1 . . Кроме того, 50 мкл блокирующего буфера (0,05% ( v / v ) Твин-20 и 2% ( w / v ) бычий сывороточный альбумин (BSA) в PBS) вводили со скоростью 10 мкл мин ^-1 и инкубировали в течение 30 минут при температуре 37 ° C, тщательно промывали 100 мкл pH 7,4 PBS из расчета 50 мкл мин ^-1 . Затем вводили 50 мкл различных концентраций ПСА со скоростью 10 мкл мин ^-1 . с инкубацией в течение 30 мин при 37 ° C и тщательно промыть, используя 100 мкл pH 7,4 PBS, из расчета 50 мкл мин ^-1 . Кроме того, вводили 50 мкл конъюгированного с HRP антитела против PSA (разведение 1:1000) со скоростью 10 мкл мин ^-1 . , инкубировали 30 мин при 37 ° C и тщательно промывали 100 мкл pH 7,4 PBS из расчета 50 мкл мин ^-1 . Наконец, мы вводили 50 мкл 1 × pH 7,4 PBS, содержащего 4,5 мМ гидрохинона и 0,1 мМ растворов перекиси водорода, со скоростью 50 мкл мин ^-1 . . После того, как пиковый ток стабилизируется, мы усреднили три измерения тока и вычислили соответствующее стандартное отклонение. Наконец, была реализована хроноамперометрия при постоянном потенциале 4 мВ, по восемь повторов для каждой группы. Для обеспечения наилучшего состояния CASPE-MFD всегда во время электрохимического эксперимента, электрод CASPE-MFD был активирован первым путем сканирования в диапазоне потенциалов от 0,5 до 1,5 В в течение 10 циклов в свежеприготовленных 0,5 MH ₂ SO ₄ растворы с использованием циклической вольтамперометрии. Приведена типичная вольтамперограмма чистого поликристаллического золота. Затем CASPE-MFD был промыт ультрачистой водой и растворами PBS.

Результаты и обсуждение

Подготовка CASPE-MFD

Однородное распределение использовалось для исследования полезности CASPE-MFD. Раствор флуоресцентных микрогранул вводили в каналы CASPE-MFD со скоростью потока 5 мкл / мин, и очевидно, что каждый угол CASPE-MFD был заполнен раствором флуоресцентных микрогранул и пузырьков не образовалось. в устройстве (рис. 2). Скорость потока была увеличена до 100 мкл / мин, чтобы доказать надежность CASPE-MFD, которая показала, что устройство подходит для обнаружения аналитов.

а Фотоэлектрод с трафаретной печатью, используемый для получения флуоресцентных изображений. б Флуоресцентное изображение CASPE-MFD. Мы используем фотоэлектрод в качестве модели флуоресцентного изображения, чтобы продемонстрировать, что рабочая зона заполнена красителями и не имеет пузырьков в CASPE-MFD. c Частично увеличенный рисунок флуоресцентного изображения

Процесс изготовления также исследовали с помощью циклических вольтамперограмм, как показано на рис. 3. Ферроценкарбоновая кислота использовалась в качестве модельного окислительно-восстановительного соединения, а на рис. 3а показана взаимосвязь токов окислительно-восстановительных пиков с различными скоростями развертки потенциала. Окислительно-восстановительный пик кривых CV показывает типичную обратимую электрохимическую реакцию, в которой скорость реакции определяется диффузией электроактивных частиц к поверхности электрода. Разделение потенциалов между пиками катодного потенциала ( E _ПК ) и пикового анодного потенциала ( E _pa ) составляет 62 мВ, что близко к теоретическому значению 59 мВ для окислительно-восстановительной пары ферроцена. Кроме того, положение пиков потенциалов не изменяется в зависимости от скорости сканирования потенциала, а анодный пиковый ток ( i _pa ) примерно равен катодному пиковому току ( i _ПК ) в диапазоне от 10 до 350 мВ / с. Обратимое поведение соответствует сигналу в объеме раствора (дополнительный файл 1:рис. S1A), который указывает на отсутствие побочных реакций и, как и ожидалось, кинетика переноса электронов достаточно быстрая, чтобы поддерживать поверхностные концентрации окислительно-восстановительного потенциала. -активные виды при значениях, требуемых уравнением Нернста. На рисунке 3b показано, что оба анодных пикового тока ( i _pa ) и катодный пиковый ток ( i _ПК ) были пропорциональны квадратному корню из скоростей сканирования, что подразумевает типичный процесс, управляемый диффузией [18]. Кроме того, ток, измеренный в CASPE-MFD, довольно близок к значению тока в растворе в массе (дополнительный файл 1:рис. S1B), что указывает на то, что анализ в устройстве не снижает его чувствительности.

а Циклические вольтамперограммы 0,5 мМ ферроценкарбоновой кислоты в 0,1 М водном растворе KCl (pH 7,0) в CASPE-MFD при различных скоростях сканирования (по возрастанию по y по оси):10, 25, 50, 80, 100, 150, 200, 250, 300 и 350 мВ / с. б Градуировочные графики анодного ( i _pa ) и катодный пиковый ток ( i _ПК ) по сравнению со скоростью сканирования квадратов. Две линии представляют собой линейную кривую с уравнением регрессии соответственно: Y ( я _pa ) =0,9932 X - 0,2563 ( R ² =0,9996, n =8); Г ( я _ПК ) =- 0,9384 X - 0,1774 ( R ² =0,9996, n =8)

Производительность CASPE-MFD при обнаружении PSA

Недавние сообщения показали, что концентрация простатоспецифического антигена (ПСА) в диапазоне 4–10 нг / мл обычно указывает на высокую вероятность наличия карциномы простаты [19]. Поэтому PSA был выбран в качестве цели для оценки эффективности приготовленного CASPE-MFD (рис. 4). На рис. 4а показано, что подготовленный CASPE-MFD можно напрямую подключить к портативной электрохимической рабочей станции. Как показано на фиг. 4c, конъюгированные с магнитными шариками анти-PSA-антитела иммобилизовали на поверхности золотого электрода (рабочего электрода) с помощью магнита. Затем антиген PSA вводили в микрофлюидные каналы приготовленного CASPE-MFD и конъюгировали с антителом против PSA, иммобилизованным на рабочем электроде. Затем модифицированное HRP антитело против PSA конъюгировали с антигеном PSA. Хроноамперометрия использовалась для обнаружения электрохимических сигналов, производимых гидрохиноном и перекисью водорода.

а Все устройство обнаружения. Шприцевой насос использовали для впрыскивания раствора в CASPE-MFD, а электрохимическую рабочую станцию ​​использовали для обнаружения электрохимических сигналов. б CASPE-MFD используется для обнаружения PSA. Конъюгированные с иммуномагнитными гранулами антитела против PSA вводили растворы через впускной канал и использовали магнит для захвата магнитных гранул. c Схема CASPE-MFD при обнаружении антигена PSA. Иммуномагнитные гранулы анти-PSA-антитела иммобилизовали на рабочем электроде с помощью магнита. Антиген PSA вводили в CASPE-MFD и конъюгировали с антителом против PSA. Затем модифицированное HRP антитело против PSA конъюгировали с антигеном PSA. Хроноамперометрия использовалась для обнаружения электрохимических сигналов, производимых гидрохиноном и перекисью водорода

Хроноамперометрия дает лучшее отношение сигнал / шум по сравнению с другими амперометрическими методами [20,21,22,23,24], а использование тонкой пластины жидкости, механически закрепленной на электродах, более устойчиво к вибрации, чем анализ в больший объем раствора. Для токов, ограниченных фарадеевской диффузией, временная характеристика описывается уравнением Коттрелла.

где n - количество электронов, F постоянная Фарадея (96 485 Кл / моль), A площадь электрода (см ² ), D - коэффициент диффузии (см ² / с) и C - концентрация (моль / см ³ ).

Приготовленный CASPE-MFD использовали для обнаружения ПСА в серии растворов аналита, концентрация от 0 до 10 нг / мл ^-1 . Хроноамперометрические ответы обнаружения ПСА в CASPE-MFD показаны на рис. 5а. Пиковые токи увеличивались с увеличением концентрации PSA в PBS с pH 7,4, содержащем 4,5 мМ гидрохинона и 0,1 мМ пероксида водорода. Как показано на рис. 5b (синяя линия), пиковые токи были пропорциональны логарифмическому значению концентраций PSA в диапазоне от 0,001 до 10 нг / мл, а уравнение линейной регрессии: I (мкА) =14,87 + 3,927 × log C _PSA (нг / мл) ( R ² =0,9985, n =8). Низкий предел обнаружения (0,84 пг / мл) и хорошая линейная зависимость позволяют предположить, что приготовленный CASPE-MFD можно использовать для обнаружения ПСА на практике. Кроме того, мы также обнаружили различные концентрации PSA в CASPE-MFD с помощью прямоугольной вольтамперометрии (SWV) на рис. 5c. Ответы SWV также соответствовали хроноамперометрическим результатам.

а Хроноамперометрические кривые для различных концентраций антигена ПСА (восходящие по y по оси):0, 0,001, 0,01, 0,1, 1 и 10 нг / мл в буфере PBS с pH 7,4, содержащем 4,5 мМ гидрохинона и 0,1 мМ H ₂ О ₂ раствор в CASPE-MFD при - 2,0 мВ по сравнению с серебряным электродом псевдо-сравнения. б Линейная зависимость между током пика и концентрацией антигена PSA в CASPE-MFD в буфере PBS с pH 7,4 (синяя линия) и в сыворотке крови человека (красная линия). Уравнение линейной регрессии синей линии: Y =14,87 + 3,927 × X ( R ² =0,9985, n =8), а уравнение линейной регрессии для красной линии равно Y =14,15 + 3,622 × X ( R ² =0,9986, n =8). c Прямоугольные вольтамперограммы для различных концентраций антигена PSA в буфере PBS с pH 7,4, содержащем 4,5 мМ гидрохинона и 0,1 мМ H ₂ О ₂ решение в CASPE-MFD (по возрастанию по y по оси):0, 0,001, 0,01, 0,1, 1 и 10 нг / мл соответственно. г Соответствующая линейная зависимость различных концентраций антигена PSA. Уравнение линейной регрессии: Y =34,53 + 9,246 × X ( R ² =0,9884, n =8)

Выборочное обнаружение PSA с помощью CASPE-MFD

Чтобы проверить возможное применение нашего устройства на реальных образцах, мы проанализировали различные концентрации ПСА в образцах сыворотки человека с помощью хроноамперометрии. Полученные результаты в дополнительном файле 1:рис. S2 продемонстрировали, что пиковые токи PSA также увеличивались с увеличением концентрации PSA в сыворотке крови человека, содержащей 4,5 мМ гидрохинона и 0,1 мМ перекиси водорода. Кроме того, соответствующая калибровочная кривая показана на рис. 5b (красная линия), а уравнение линейной регрессии - I (мкА) =14,15 + 3,622 × log C _PSA (нг / мл) ( R ² =0,9986, n =8). Очевидно, что между двумя группами почти не было статистических различий, что указывает на то, что приготовленный CASPE-MFD может работать в реальных образцах. Кроме того, было продемонстрировано, что CASPE-MFD обладает высокой селективностью в отношении целевого ПСА и может использоваться в клинической практике для диагностики рака простаты.

Выводы

Мы разработали простой, недорогой и портативный коммерческий микрофлюидный электрохимический датчик на основе электрода с трафаретной печатью. Кроме того, мы продемонстрировали применение наших CASPE-MFD для количественного анализа PSA в буфере PBS и в образцах сыворотки крови человека. Измерение показало хорошую чувствительность и воспроизводимость, так как устройство было изготовлено непосредственно на имеющихся в продаже электродах с трафаретной печатью. У CASPE-MFD пять преимуществ:(i) он легкий, портативный, многоцелевой; (ii) он стандартизирован; (iii) он имеет отличную воспроизводимость с высокой чувствительностью и точностью; (iv) он прост в использовании и не требует профессионального медицинского персонала или сложных инструментов; и (v) это позволяет интегрировать системы обнаружения высокой плотности в небольшое устройство. Кроме того, использование миниатюрного потенциостата может сделать CASPE-MFD пригодными для полевой или домашней диагностики. Кроме того, коммерческие электроды и простота изготовления могут обеспечить стандартизацию и индустриализацию CASPE-MFD. Поэтому мы считаем, что эта платформа широко используется для диагностики в месте оказания медицинской помощи, такой как небольшие молекулы (натрий, калий, хлорид, глюкоза), маркеры рака (натрийуретический пептид B-типа или BNP, тропонин I), клетки (CD ₄ ) и нуклеиновые кислоты (ДНК, РНК).

Сокращения

МФУ:

Микрожидкостные устройства

CASPE-MFD:

Микрожидкостные устройства на основе электродов с трафаретной печатью

PDMS:

Полидиметилсилоксан

PSA:

Простатоспецифический антиген

CA:

Хроноамперометрия

SWV:

Прямоугольная вольтамперометрия

LOD:

Предел обнаружения

HRP:

Пероксидаза хрена

TEOS:

Тетраэтоксисилан

MTES:

Эмиссионная спектроскопия с метастабильным переносом

BNP:

Натрийуретический пептид B-типа