Быстрый, дешевый микрожидкостный электрохимический сенсор, изготовленный прямо на экранно-печатных электродах для ультра-чувствительного определения ПСА

Аннотация

Мы представляем первую демонстрацию микрожидкостной платформы, изготовленной прямо на коммерчески доступном экранно-печатном электроде (ЭПЭ) с использованием простого, быстрого и недорогого процесса. Устройство — названное CASPE-MFD (Commercially Available SPE-Based Microfluidic Device) — сочетает PDMS микроканалы со стеклопокрытым подложкой ЭПЭ. В человеческой сыворотке CASPE-MFD достигает предела обнаружения (ПО) 0,84 пг/мл (25,8 фМ) для простатично-специфического антигена (ПСА) и показывает отличную линейность в диапазоне 0,001–10 нг/мл. Эта платформа предлагает масштабируемое, дешевое решение для точечной диагностики, экологического мониторинга и анализа безопасности пищевых продуктов.

Введение

Микрожидкостные системы манипулируют объемами от нанолитров до пиколитров в микрометровых каналах, обеспечивая высокопроизводительные, реагентно-эффективные анализы. Их интеграция с электрохимическими сенсорами наделяет замечательной чувствительностью, быстрым откликом и минимальными инструментальными требованиями, делая их идеальными для он-сайт биомедицинской диагностики.

Электрохимические методы детектирования изначально совместимы с микрожидкостью, устраняя громоздкую оптику и упрощая изготовление. Синергия микрожидкости и ЭПЭ — уже широко используемых в клинических точечных устройствах — обещает полностью интегрированную, одноразовую сенсорную платформу.

В этой работе мы изготавливаем CASPE-MFD путем связывания PDMS микроканалов со стеклопокрытым ЭПЭ через активацию кислородной плазмой. Устройство тестируют на квантификацию ПСА в фосфатном буфере и человеческой сыворотке с помощью хроноамперометрии (ХА) и квадрантной вольтамметрии (КВ).

a Изготовление PDMS микроканалов через SU-8 фотолитографию. b Сборка CASPE-MFD: PDMS каналы связываются со стеклопокрытым ЭПЭ, содержащим два золотых рабочих/контрэлектрода и серебряный псевдо-референсный электрод. c Фотография готового CASPE-MFD.

Материалы и методы

Реактивы и материалы

ПСА, HRP-конъюгированный анти-ПСА, биотинилированный анти-ПСА, стрептавидин магнитные бисеры, БСА, гидрохинон, Твен-20, H₂O₂ и ферроценкарбоновая кислота получены от коммерческих поставщиков (Petsec Energy Ltd., Fisher Scientific, Sigma-Aldrich). PDMS пре-полимер и отвердитель получены от Dow Corning. Все буферы готовили на ультрачистой воде (Millipore Milli-Q).

Приборы

Флуоресцентная визуализация: Olympus U-CMAD3. Плазменная очистка: Harrick PDC-32G. Электрохимические измерения: CHI 760B потенциостат (трехэлектродная схема: золотой рабочий/контрэлектрод, серебряный псевдо-референсный).

Изготовление микрожидкостного чипа

PDMS каналы паттернили на кремниевой подложке, покрытой SU-8 2075, экспонировали UV светом и отвердели. Подложка ЭПЭ покрывали тонким стекольным слоем через соль-гель смесь (TEOS:MTES:этанол:вода = 1:1:1:1) и отверждение при 65 °Covernight. Обе поверхности PDMS и ЭПЭ активировали 30 с O₂ плазмой перед выравниванием и связыванием, образуя герметичную уплотнение.

Хроноамперометрические эксперименты

Измерения проводили в 1× pH 7,4 ФСБ, содержащем 4,5 мМ гидрохинона и 0,1 мМ H₂O₂. CASPE-MFD сначала активировали циклованием между 0,5–1,5 В в 0,5 М H₂SO₄. Затем вводили 50 мкл магнитно-бисер-сопряженного анти-ПСА антитела при 50 мкл/мин, затем блокирование, инкубацию ПСА, добавление HRP-анти-ПСА и наконец электроактивный раствор. Хроноамперометрию проводили при –2,0 мВ относительно серебряного псевдо-референса, записывая стационарный ток через 30 с.

Результаты и обсуждение

Характеристика устройства

Флуоресцентные микробисеры, введенные в CASPE-MFD, заполняли каналы равномерно без пузырьков, подтверждая надежную жидкостную характеристику при расходах до 100 мкл/мин (Рис. 2).

a Флуоресцентная микробисерная инфильтрация на ЭПЭ. b Яркополевое изображение заполненного CASPE-MFD. c Увеличенный вид распределения флуоресценции.

Циклическая вольтамметрия с 0,5 мМ ферроценкарбоновой кислотой подтвердила реверсибельный электронный перенос (E_pa–E_pc = 62 мВ) и диффузионно-контролируемую кинетику (i_pa ∝ √v). Токи в CASPE-MFD совпадали с токами в объемном растворе, указывая, что микрожидкостная архитектура не компрометирует чувствительность (Рис. 3).

a ЦВ при скоростях сканирования 10–350 мВ/с. b Калибровочные графики i_pa и i_pc против √скорости сканирования.

Характеристики детектирования ПСА

Хроноамперометрические кривые (Рис. 5a) показывают монотонный рост тока с концентрацией ПСА (0–10 нг/мл). Линейный диапазон (0,001–10 нг/мл) дает регрессию I (мкА) = 14,87 + 3,927 × log C_ПСА (R² = 0,9985). ПО 0,84 пг/мл превосходит коммерческие анализы (0,1 нг/мл) более чем в 100 раз и обходит сравнимые микрожидкостные сенсоры.

Квадрантная вольтамметрия (КВ) дала параллельные результаты, подтверждая надежность электрохимического считывания (Рис. 5c).

a Хроноамперометрия для 0–10 нг/мл. b Линейные графики в буфере (синий) и человеческой сыворотке (красный). c КВ кривые. d Линейная аппроксимация для КВ (R² = 0,9884).

Селективность и анализ реальных образцов

В человеческой сыворотке CASPE-MFD сохранял ту же линейность и ПО, демонстрируя совместимость с сложными биологическими матрицами. Никаких значимых интерференций от потенциальных компонентов матрицы не наблюдалось, подчеркивая селективность анализа.

Заключение

CASPE-MFD сочетает дешевое изготовление, микрожидкостный контроль и электрохимию ЭПЭ для достижения ультра-чувствительного определения ПСА (<0,85 пг/мл) в переносимом формате. Его простота сборки, воспроизводимость и потенциал мультиплексирования делают его перспективной платформой для точечной диагностики онкомаркеров, электролитов и нуклеиновых кислот.

Аббревиатуры

MFD

Микрожидкостные устройства

CASPE-MFD

Микрожидкостные устройства на базе экранно-печатных электродов

PDMS

Полидиметилсилоксан

ПСА

Простатично-специфический антиген

ХА

Хроноамперометрия

КВ

Квадрантная вольтамметрия

ПО

Предел обнаружения

HRP

Перекисная пероксидаза

TEOS

Тетраэтоксисилан

MTES

Метилтриэтоксисилан

BNP

B-типе натрийретический пептид