Получение и характеристика головастиков и сферических наночастиц гемина для повышения растворимости

Введение

Железо является важным элементом метаболических процессов организма, таких как перенос электронов, их хранение и перенос кислорода [1]. Дефицит железа - один из наиболее распространенных недостатков питания, от которого страдает примерно 20% населения мира [2]. Самым негативным последствием дефицита железа является сидеропеническая анемия. В основном это вызвано недостаточным поступлением железа с пищей, часто когда потребность в нем высока. У людей пищевое железо может поступать в организм в двух основных формах:первая представляет собой неорганическое железо (негемовое железо), в основном высвобождаемое из овощей и растительных продуктов, а другая - гемовое железо, получаемое при расщеплении гемоглобина или миоглобина, присутствующего в организме. животные. Гемин был обнаружен в крови и мясных продуктах, входит в состав многих гемопротеинов (включая миоглобин, гемоглобин и цитохромы b и c) и всасывается в два или три раза легче (50–87%), чем негемовое железо [3] . Недавно исследователи стали свидетелями значительного прогресса в нашем понимании физиологической роли гемина. К сожалению, гемин гидрофобен из-за наличия большого тетрапиррольного макроцикла [4]. Из-за высокой гидрофобности и плохой растворимости гемина в нейтральном водном растворе его применение в различных областях было ограничено. Таким образом, существует острая необходимость в повышении растворимости гемина.

Чтобы решить эту проблему, много усилий было направлено на улучшение растворимости гемина. Бернер [5] обнаружил, что белок частичного ферментного раствора (соевый изолят, соевая мука или соевый концентрат) может объединяться с гемовым железом для усиления абсорбции железа, что улучшает биодоступность железа. Wang et al. [6] показали, что кристаллический гемин и L-аргинат могут обеспечить коацервацию водорастворимого гемина и аргината, который может быть использован в качестве новой добавки гемового железа в пищевых добавках, функциональных продуктах питания и фармацевтических препаратах. Zhang et al. [7] сообщили, что гемин может соединяться с β-циклодекстрином с помощью циклического олигосахарида из семи α-связанных единиц глюкозы [1, 4], что приводит к значительному улучшению растворимости гемина. Хотя был достигнут некоторый прогресс в улучшении растворимости гемового железа, индустриализация была нелегкой из-за сложного процесса получения. Следовательно, разработка простого метода повышения растворимости гемина по-прежнему остается серьезной проблемой.

Нанонаука и нанотехнологии могут предоставить новые решения в разработке функциональных веществ, в частности, включение биоактивных соединений, не влияя на сенсорное восприятие потребителей и улучшая усвоение определенных компонентов [8]. Наночастицы обладают рядом преимуществ [9], в том числе способствуют растворимости гидрофобных веществ [10]. Duhem et al. [11] разработали новые наномедицины на основе витамина Е с помощью нанотехнологий, которые предложили множество преимуществ в доставке лекарств, таких как биосовместимость, улучшенная растворимость лекарств и противораковая активность. Chang et al. [12] сообщили, что наночастицы, полученные из коротких цепей глюкана, модифицированных янтарным ангидридом, могут загружать гидрофобный лютеин, что может повышать растворимость лютеина в воде. Несмотря на огромный потенциал наночастиц, о гемине в нанометровом масштабе еще не сообщалось. Мы предположили, что растворимость наночастиц гемина может быть увеличена по сравнению со свободным гемином, что может иметь ценные применения.

Основная цель настоящей работы - разработать наночастицы гемина различной формы с использованием простой методики диализа и повысить их растворимость. Оценивали параметры приготовления исходной концентрации гемина и условий диализа. Дополнительно оценивали растворимость и стабильность по отношению к pH, термической обработке и соли образованных наночастиц гемина. В целом, улучшения растворимости гемина имеют множество потенциальных областей применения.

Материалы и методы

Материалы

Геминовые и диализные мембраны с отсечкой по молекулярной массе 8–12 кДа были приобретены у Beijing Solarbio Science &Technology Co., Ltd. (Пекин, Китай). Ацетон (CH ₃ COCH ₃ , ≥ 99,5%) закупали у Kant Chemical Co., Ltd. (Лайян, Китай). Все остальные реактивы были аналитической чистоты.

Приготовление наночастиц гемина

Наночастицы гемина получали с использованием метода диализа:0,1 мг / мл (или 0,5 мг / мл) гемина, растворенного в ацетоне, подкисленного 0,1 мл концентрированной соляной кислоты. Раствор гемина диализовали в течение разных дней, воду меняли каждый день и лиофилизировали для получения наночастиц гемина. Чтобы установить влияние переменных параметров на получение наночастиц гемина, объемные соотношения гемин / вода были установлены на уровне 1:3, 1:5, 1:10 и 1:50; температура культивирования составляла 4 и 25 ° C; а время инкубации было установлено на 1, 3 и 5 дней.

Просвечивающая электронная микроскопия (ТЕМ)

ПЭМ-изображения наночастиц получали с помощью просвечивающего электронного микроскопа 7700 (Hitachi, Токио, Япония) с ускоряющим напряжением 80 кВ. Крошечная капля образца была нанесена на покрытую углеродом медную сетку, а затем подвергнута сушке вымораживанием для наблюдения.

Измерения среднего размера и дзета-потенциала

Средний размер, дзета-потенциал (ζ-потенциал) и индекс полидисперсности (PDI) частиц измеряли с помощью динамического светорассеяния (DLS) с использованием Malvern Zetasizer Nano (Malvern Instruments Ltd., Великобритания). Образцы разбавляли водой MilliQ и анализировали при 25 ° C. Концентрация разбавленных образцов составляла 0,05%.

Спектр поглощения УФ – видимой области

Измерения УФ-видимой спектроскопии свободных гемина и наночастиц гемина, растворенных в подкисленном водном ацетоне, проводили на спектрофотометре УФ-видимого диапазона (TU-1810, Пекин, Китай). Молекулярное поглощение сканировали на длине волны 200-800 нм с интервалом 1 нм для получения спектра.

Анализ растворимости

Количественную растворимость в воде чистого гемина и наночастиц исследовали в соответствии с методом, описанным Gidwani et al. [13]. Вкратце, перенасыщенные растворы чистого гемина и наночастиц добавляли отдельно к 5 мл деионизированной воды в пробирках соответственно. Пробирки постоянно перемешивали (500 об / мин) при разной температуре (25, 37, 60 и 80 ° C) в течение 30 мин. Затем раствор центрифугировали при 3500 g и супернатант разбавляли подходящим образом подкисленным водным ацетоном. Концентрацию образцов определяли при 640 нм на спектрофотометре UV – Vis. Для каждого измерения базовый уровень был установлен с использованием холостого раствора подкисленного водного ацетона в качестве эталона.

pH, температура и устойчивость к соли

Размер, ζ-потенциал, PDI и мутность наночастиц (0,5 мг / мл) измеряли и сравнивали с начальными значениями для оценки стабильности наночастиц. Суспензии частиц были разделены на десять групп:шесть групп были доведены до желаемых значений pH [2, 3, 5, 7, 9, 11] с использованием соляной кислоты (0,1 М) или раствора гидроксида натрия (0,1 М); три группы нагревали до 25, 60 и 80 ° C, а затем охлаждали до комнатной температуры; другой был проведен с различными концентрациями хлорида натрия (NaCl, 0, 10, 50, 100, 250 и 500 мМ) соответственно. Смешанные растворы оставляли на ночь при 25 ° C.

Инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье (FTIR)

Химическая структура наночастиц гемина была подтверждена с помощью FTIR-спектров (Tensor 27, Jasco Inc., Истон, Мэриленд, США). Всего 32 скана с разрешением 4 см ^{- 1} были собраны с использованием программного обеспечения быстрого сканирования в OMNIC 8.0 для получения единого спектра. Спектральный диапазон 400–4000 см ^{- 1} . .

Флуоресцентная спектроскопия

Измерения флуоресценции свободного гемина и наночастиц проводили с использованием флуоресцентного спектрофотометра (F-7000, Hitachi, Япония). Спектры флуоресценции образцов были получены при длинах волн от 300 до 600 нм при возбуждении на длине волны 402 нм.

Рентгеновская дифрактограмма (XRD)

XRD свободного гемина и наночастиц получали с использованием рентгеновского дифрактометра (AXS D8 ADVANCE; Bruker, Карлсруэ, Германия), и образцы исследовали в 2 θ диапазон 4–40 °. Относительную кристалличность свободного гемина и наночастиц определяли путем нанесения базовой линии пиков на дифрактограмму и вычисления площади с помощью программного средства просмотра спектра на основе метода, описанного Jivan et al. [14]. Области выше и ниже кривой соответствуют кристаллическим доменам и аморфным областям соответственно. Отношение верхней площади к общей площади принимали за относительную кристалличность:

Относительная кристалличность (%) =Площадь под пиками / Общая площадь кривой × 100.

Статистический анализ

Были получены трехкратные образцы всех количественных результатов. Результаты были представлены как средние значения и стандартные отклонения. Статистический анализ проводился с помощью тестов Дункана с множеством диапазонов с использованием пакета статистических программ SPSS V.17 (SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс, США).

Результаты и обсуждение

Образование и характеристика наночастиц гемина

Морфология и размер наночастиц гемина, полученных методом диализа, были исследованы с помощью ПЭМ. Когда концентрация гемина составляла 0,5 мг / мл, наноструктуры гемина разных размеров формировались при различных объемных соотношениях гемин / вода и для разных дней диализа (рис. 1, дополнительный файл 1:рис. S1 – S3). Наночастицы имели четко очерченную сферическую форму и диаметр 50–100 нм при объемном соотношении гемин / вода 1:10 после 3 дней диализа. При увеличении объемного соотношения гемин / вода (1:50) наночастицы собирались в частицы в форме стержней (рис. 1). В частности, мы обнаружили, что по мере увеличения времени диализа с 1 до 3 дней наночастицы гемина становились равномерно диспергированными (дополнительный файл 1:Рисунок S1-S3). Температура (4 и 25 ° C) диализа мало влияла на размер частиц и дисперсию наночастиц гемина (дополнительный файл 1:Рисунок S4).

ПЭМ-изображения наночастиц гемина, полученных путем диализа в течение 3 дней с различными объемными соотношениями гемин / вода, включая 1:3 ( a ), 1:5 ( b ), 1:10 ( c ) и 1:50 ( d ) при 25 ° C. Концентрация гемина составляла 0,5 мг / мл

На рис. 2 показаны типичные ПЭМ-изображения наночастиц гемина, приготовленных для разных дней диализа с концентрацией гемина 0,1 мг / мл. Продукты в основном представляли собой четко очерченные, однокомпонентные, структурно необычные наночастицы в форме головастиков. Наночастицы, похожие на головастиков, предпочтительно распределялись в течение 3 дней диализа. Головастик демонстрировал значительную разницу в размерах от максимальной ширины головы (200 нм) до хвоста (100 нм). Наши результаты показали, что однородно диспергированные наночастицы могут быть сформированы при объемном соотношении гемин / вода 1:10 и после диализа в течение 3 дней при 25 ° C как для сферических, так и для головастых наночастиц. Таким образом, мы выбрали эти два вида наночастиц гемина для следующего исследования.

ПЭМ-изображения наночастиц гемина, полученные с объемным соотношением гемин / вода 1:10 в различные дни диализа, включая 1 день ( a ), 3 дня ( b ) и 5 ​​дней ( c ) при 25 ° C. Концентрация гемина составляла 0,1 мг / мл

Для дальнейшего изучения размера наночастиц гемина было использовано определение DLS для подтверждения образования наноструктур. Диаметр наночастиц сферической формы и головастика составлял примерно 218,2 ± 6,2 и 299,8 ± 7,6 нм соответственно (рис. 3а). Размер наночастиц, измеренный с помощью DLS, был несколько больше, чем результаты, измеренные с помощью ПЭМ; это различие было связано с набуханием наночастиц в водном растворе. Известно, что измерение DLS указывает на гидродинамический диаметр наночастиц в растворе [15]. Ζ-потенциал сферических наночастиц (-21,4 мВ) был примерно вдвое выше, чем у наночастиц в форме головастика (-10,8 мВ) (рис. 3b). PDI наночастиц гемина также определяли для анализа распределения частиц по размерам. Результаты показали, что PDI сферических и головастых наночастиц составлял 0,348 и 0,402 соответственно (рис. 3c). Это открытие указывает на то, что полученные наночастицы гемина обладают хорошей полидисперсностью.

Средний размер ( a ), ζ-потенциал ( b ), PDI и мутность ( c ) и эффект Тиндаля ( d ) наночастиц гемина разной формы

Когда световой луч проходит через коллоидную дисперсию, часть света рассеивается коллоидными частицами, присутствующими в растворе, что приводит к расходимости светового луча. Такое поведение называется эффектом Фарадея-Тиндаля [16]. В этом случае раствор свободного гемина не давал эффекта Тиндаля (дополнительный файл 1:рисунок S5). Тем не менее, эффект Тиндаля наблюдался в суспензии сферических и головастых наночастиц (рис. 3d), подтверждая образование коллоидов или наночастиц в тонкой суспензии. Механизм образования наночастиц гемина методом диализа может быть связан с диффузией растворителя через границу раздела между водной фазой снаружи и фазой органического растворителя внутри, что привело к снижению растворимости гемина и образованию ядра кристалла. Впоследствии наночастицы гемина разной формы были сформированы из-за роста и самосборки ядра монокристалла различными способами.

Анализ поглощения УФ – видимой области

В соответствии с приведенными выше результатами мы исследовали, существуют ли какие-либо различия между двумя формами наночастиц гемина в их генерации хромофора. Спектр UV-Vis как сферических, так и головастых наночастиц показал одинаковые полосы поглощения при 265 нм (рис. 4а). Наночастицы сферической формы имели узкую полосу поглощения при 667 нм и 775 нм. Для сравнения, раствор наночастиц в форме головастика показал широкий пик при 658 нм без пика 775 нм. Более того, интенсивность поглощения сферических наночастиц была выше, чем у головастиков. Столь большую разницу нельзя было объяснить ни рассмотрением головастика как суммы сферы и сужающегося стержня, ни какой-либо несовершенной конфигурацией шара. Колебания электронов, соответствующие плазмонному поглощению вдоль длинной оси, замедляются и / или отражаются. Таким образом, оптические свойства наночастиц гемина зависят от формы, как и в отчете Hu et al. [17], которые обнаружили, что наночастицы золота в форме головастика и сферы обладают разными оптическими свойствами.

а УФ – видимый спектр, b Спектры FTIR, c спектры излучения флуоресценции и d Рентгенограммы свободного гемина, сферических наночастиц и головастиков. Наночастицы диспергировали в деионизированной воде. RC, относительная кристалличность

Раствор свободного гемина показал максимальное поглощение при 344 нм, и это было приписано полосе Соре, обычно связанной с порфиринами (дополнительный файл 1:Рисунок S5). Полоса поглощения наночастиц гемина сместилась от 344 до 265 нм, что свидетельствует об усилении π-π-конъюгативного эффекта наночастиц гемина. Удивительно, но по сравнению со свободным гемином оба типа наночастиц продемонстрировали высокое и сильное поглощение в ближней инфракрасной области, что очень подходит для применений, основанных на поглощении, таких как фототермическая терапия и фотоакустическая визуализация [18]. Magno et al. [19] также сообщили, что наночастицы порфирина с поглощением в ближней инфракрасной области вызывают значительный интерес для применения в фототерапии и фотодиагностике, даже в качестве магнитных наночастиц для магнитно-гипертермической терапии и систем доставки лекарств.

Растворимость

Растворимость гемина является важным фактором, который может напрямую влиять на эффективность абсорбции в организме. Была протестирована количественная растворимость в воде чистого гемина и наночастиц гемина при различных температурах (таблица 1). С повышением температуры растворимость всех образцов в воде увеличивалась. Например, растворимость свободного гемина при 25, 37, 60 и 80 ° C составляла 0,009 ± 0,000, 0,060 ± 0,002, 0,144 ± 0,004 и 0,245 ± 0,008 мг / мл соответственно (таблица 1).

Количество сферических наночастиц, растворенных при 25, 37, 60 и 80 ° C, составило 1,333 ± 0,023, 1,499 ± 0,072, 1,889 ± 0,081 и 3,853 ± 0,124 мг / мл соответственно, а количество наночастиц в форме головастиков - 0,997 ± 0,045, 1,231 ± 0,035, 1,521 ± 0,058 и 1,795 ± 0,050 мг / мл соответственно. Результаты исследования растворимости наночастиц в воде показали значительное увеличение по сравнению с чистым гемином. Наночастицы сферической формы показали более высокую растворимость при температурах 25, 37, 60 и 80 ° C, чем наночастицы в форме головастика. Это открытие предполагает, что растворимость сферических наночастиц может быть в 308,2 раза выше по сравнению со свободным гемином при 25 ° C. Это увеличение растворимости произошло в основном из-за уникального наноразмерного размера частиц. Этот результат согласуется с другими исследованиями, опубликованными Гидвани и Вьясом [13].

Анализ спектра FTIR

Спектры FTIR могут использоваться для идентификации типов функциональных групп. Ремешок на 3470 см ^{- 1} в основном объясняется валентным колебанием N – H и гидроксильных групп гемина (рис. 4b). Полоса на 1460 см ^{- 1} приписывается вибрации в плоскости N – H из-за изгибной вибрации вне плоскости –CH ₃ из ароматического пиррольного кольца гемина. Пик на 1600 см ^{- 1} представляет собой характерный пик амидной связи из-за валентного колебания C =O поверхностно связанной карбоксильной группы гемина, который показывает, что вторичная амидная связь существует в гемине. Эти результаты согласуются с результатами Xi et al. [20]. Однако пик на 3470 см ^{- 1} Размер наночастиц гемина был шире, чем у свободного гемина, что ясно указывает на усиление взаимодействия водородных связей между наночастицами.

Спектры флуоресценции

Флуоресцентные свойства свободного гемина и наночастиц гемина также контролировали с помощью флуоресцентной спектроскопии. Сигналы флуоресценции как сферических, так и головастых наночастиц были увеличены в видимом максимуме эмиссии при 500 нм по сравнению со свободным гемином (рис. 4c). Это могло быть связано с повышенной растворимостью гемина после образования наночастиц [21].

XRD-анализ

Кристаллическая природа свободного гемина и наночастиц гемина была подтверждена методом XRD. Как показано на рис. 4d, рентгенограммы свободного гемина показали несколько относительно сильных пиков отражения при 2 θ =6,8, 9,6, 11,5, 16,2, 21,5 и 23,9 °. Характерные пики сферических наночастиц были такими же, как и пики свободного гемина, что указывает на то, что кристаллическая структура сферических наночастиц не изменилась в составах наночастиц. Однако для наночастиц в форме головастиков исчезли наиболее характерные пики. Кроме того, относительная кристалличность сферических наночастиц и наночастиц в форме головастиков значительно снизилась до 47,0% и 35,7%, соответственно, по сравнению с 56,7% для свободного гемина. Эти результаты показали, что составы наночастиц могут разрушать частичные кристаллические области гемина.

Влияние pH, температуры и концентрации соли на стабильность

Были измерены изменения размера, PDI, ζ-потенциала и мутности наночастиц гемина после инкубации при различных уровнях pH [2,3,4,5,6,7,8,9,10,11] (рис. 5a). , б). Размер наночастиц гемина практически не изменился, их средний диаметр составлял примерно 200 нм в кислых условиях (рис. 5а). При низких значениях pH, равном 2, размер наночастиц гемина уменьшился примерно до 122,4 нм. При pH 7 размер наночастиц увеличился до 293,6 нм, и он значительно увеличился ( P <0,05) в щелочных условиях (pH 9 и 11,0) со средним диаметром более 400 нм. PDI наночастиц был менее 0,5 в кислых условиях, что свидетельствует об отсутствии явной агрегации наночастиц [22]. Ζ-потенциал наночастиц уменьшался с увеличением значения pH (рис. 5б). Мутность наночастиц показала ту же тенденцию в размере. Эти результаты показали, что наночастицы стабильны в кислых условиях и нестабильны в щелочных.

Стабильность наночастиц гемина. Влияние различных уровней pH ( a ), температуры ( c ) и концентрации соли ( e ) от размера частиц и PDI наночастиц. Влияние различных уровней pH ( b ), температуры ( d ) и концентрации соли ( f ) от ζ-потенциала и мутности

Было определено влияние термической обработки (25, 60 и 80 ° C) в течение 30 минут на размер, PDI, ζ-потенциал и мутность наночастиц гемина (рис. 5c, d). При повышении температуры размер частиц, PDI, ζ-потенциал и мутность наночастиц незначительно увеличивались. Результаты показывают, что наночастицы гемина обладают превосходной термической стабильностью. Аналогичным образом, по мере увеличения ионной силы размер, ζ-потенциал и мутность наночастиц также увеличивались, что вызывало диссоциацию наночастиц (рис. 5e, f).

Выводы

В этой работе мы впервые разработали наночастицы гемина в форме головастиков и сфер, используя простой метод диализа, который может значительно повысить растворимость в 308,2 раза при 25 ° C. Более того, наночастицы гемина были стабильны в кислых условиях и демонстрировали превосходную термическую стабильность. Кроме того, обе наночастицы продемонстрировали сильное поглощение в ближней инфракрасной области. Дальнейшая работа будет сосредоточена на углубленном изучении конструкции оптотермической системы наноносителя гемина для загрузки активного ингредиента. Наночастицы гемина с повышенной растворимостью могут иметь потенциальное применение в биомедицине, пище, фотодинамической терапии и фотодинамико-фототермической терапии.

Сокращения

DLS:

Динамическое рассеяние света

FTIR:

Инфракрасное преобразование Фурье

ТЕМ:

Просвечивающая электронная микроскопия

XRD:

Рентгеновская дифрактограмма