Зеленый синтез золотых наночастиц из экстрактов Artemisia capillaris, Portulaca oleracea и Prunella vulgaris: антиоксидантная активность и цитотоксичность

Аннотация

Три водных растительных экстракта — Artemisia capillaris, Portulaca oleracea и Prunella vulgaris — использовались для биофабрикации золотых наночастиц (AuNP). Их антиоксидантные профили, включая способность к поглощению свободных радикалов, общее фенольное содержание и восстановительную способность, были количественно определены и коррелированы с эффективностью синтеза AuNP. Prunella vulgaris продемонстрировала наивысшую антиоксидантную активность и служил наиболее эффективным восстановителем, давая AuNP (PV-AuNP) с пиком поверхностного плазмонного резонанса (SPR) на 530 нм и разнообразной морфологией. Высокоразрешающая рентгеновская дифракция подтвердила кубическую гранецентрированную кристаллическую решетку, а ИСС-ОЭС оценила выход реакции в 99,3%. Динамическое рассеяние света выявило гидродинамический диаметр 45 ± 2 нм и дзета-потенциал –13,99 мВ. PV-AuNP проявили дозозависимую антиоксидантную активность и значительную цитотоксичность по отношению к клеткам человечной колоректальной аденокарциномы (HT-29) без фетальной телячьей сыворотки (ФТС), тогда как клетки панкреатического проточного аденокарциномы (PANC-1) показывали максимальный отклик в присутствии ФТС. Эти выводы подчеркивают экстракт P. vulgaris как мощный, экологически чистый восстановитель для производства биоактивных AuNP с терапевтическим потенциалом.

Введение

Растущий спрос на металлические наночастицы, особенно золотые наночастицы (AuNP), обусловлен их универсальностью как носителей препаратов, катализаторов, агентов для визуализации и биосенсоров. Конвенциональные методы síntesis — ионное распыление, образование обратных мицелл и химическое восстановление — часто требуют дорогих реагентов и вызывают токсикологические опасения. Зеленый синтез, использующий растительные экстракты как природные восстановители, стабилизаторы и каппирующие агенты, предлагает дешевый, масштабируемый и биосовместимый альтернативу. Фитохимикаты, такие как фенолы, терпеноиды и флавоноиды, не только восстанавливают ионы металлов, но и придают антиоксидантные свойства и повышают стабильность наночастиц.

Artemisia capillaris (семейство Asteraceae) давно используется в традиционной медицине за антибактериальные, противовоспалительные и гепатопротекторные эффекты, приписываемые компонентам вроде капиллина и скопарона. Portulaca oleracea (семейство Portulacaceae) обладает антибактериальной, антигрибковой и антиоксидантной активностью, связанной с алкалоидами, жирными кислотами и флавоноидами. Prunella vulgaris (семейство Lamiaceae) проявляет антивирусную, антиопухолевую, иммуномодулирующую и антиоксидантную активность, во многом благодаря фенольным кислотам и терпеноидам, таким как розмариновая и урсолиновая кислоты.

Белковый корона — адсорбционный слой сывороточных белков, образующийся при попадании наночастиц в биологические жидкости — критически влияет на клеточный захват, биодистрибуцию и цитотоксичность. Заряд поверхности, размер и морфология AuNP диктуют состав короны, тем самым модулируя терапевтическую эффективность. В этом исследовании мы изучали, как антиоксидантная потенция трех растительных экстрактов влияет на формирование AuNP и как полученные наночастицы взаимодействуют с раковыми клетками в присутствии или отсутствии ФТС.

Материалы и методы

Реактивы

Все реактивы аналитического чистоты. Хлорид калия золота(III) (KAuCl₄) и стандартные антиоксиданты (BHT, витамин C) приобретены у Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Реактивы для клеточной культуры получены от Gibco (Thermo Fisher Scientific) и GE Healthcare HyClone™ (Victoria, Australia). Подробные спецификации приведены в дополнительной таблице.

Приборы

UV-vis спектры записывали на спектрофотометре Shimadzu UV-2600 (λ = 300–800 нм). HR-TEM визуализация на JEM-2100F (JEOL, 200 кВ). Рентгеновская дифракция на Rigaku Miniflex (CuKα, 1,54056 Å). ИСС-ОЭС анализ на Perkin Elmer Optima 8300. Динамическое рассеяние света и дзета-потенциал на NanoBrook 90 Plus. Все приборы калибровали по инструкциям производителя.

Подготовка водных экстрактов

Сушеные наземные части P. vulgaris и A. capillaris приобрели у Omniherb (Daegu, Республика Корея); P. oleracea — у Handsherb (Youngchun, Республика Корея). Каждое растение (100 г) ультразвуково обрабатывали в 1 л деионизированной воде при 25 °C в течение 3 ч, повторяли трижды. Фильтрат лиофилизировали в порошок, хранили при –20 °C до использования.

Антиоксидантные тесты

Способность к поглощению свободных радикалов (DPPH и ABTS), восстановительная способность и общее фенольное содержание количественно определяли по стандартным протоколам. Все тесты проводили в триplicates, результаты выражали как IC₅₀ (мкг мл⁻¹) или мг GAE г⁻¹. Подробные методики в дополнительных материалах.

Биофабрикация AuNP

Стоковые растворы KAuCl₄ (10 мМ) и растительных экстрактов (2% масс.) готовили. После центрифугирования (18 500 g, 30 мин, 18 °C) supernatранты смешивали до конечных концентраций 0,5 мМ Au и 0,05% масс. экстракта в 2-мл флаконах. Реакция шла при 37 °C в течение 5 ч. UV-vis спектры записывали для мониторинга развития SPR.

Клеточная культура

Клетки HT-29 (толстая кишка), PANC-1 (поджелудочная) и MDA-MB-231 (молочная железа) культивировали в DMEM с высоким глюкозом + 10% ФТС, 100 Ед/мл пенициллин, 100 мкг/мл стрептомицин при 37 °C, 5% CO₂.

Тест на цитотоксичность

Жизнеспособность клеток оценивали тестом EZ-CYTOX WST. Клетки (5 × 10³ клеток/мл) посеяли в 96-колодчатые пластины, инкубировали 24 ч, затем обрабатывали PV-AuNP (0–478,3 мкг/мл Au) ± 10% ФТС в течение 24 ч. Абсорбцию на 450 нм измеряли с вычитанием фоновой абсорбции самих PV-AuNP.

Статистический анализ

Данные представлены как среднее ± SE. Значимость оценивали односторонним ANOVA с пост-хок тестом Тьюки (p < 0,05). Анализ в GraphPad Prism 5.02.

Результаты и обсуждение

Антиоксидантные профили экстрактов

Выход экстрактов составил 14,1% (A. capillaris), 39,12% (P. oleracea) и 28,6% (P. vulgaris). Антиоксидантные тесты показали, что P. vulgaris имел наименьшие IC₅₀ для DPPH (50,35 ± 1,22 мкг мл⁻¹) и ABTS (38,6 ± 0,44 мкг мл⁻¹), превосходя BHT (71,37 ± 0,84 мкг мл⁻¹). Восстановительная способность и общее фенольное содержание следовали тому же тренду: 162,98 мкг мл⁻¹ (P. vulgaris) против 235,38 мкг мл⁻¹ (A. capillaris) против 396,16 мкг мл⁻¹ (P. oleracea). Общие фенолы: 90,53 ± 6,81 мг GAE г⁻¹ для P. vulgaris, 39,88 ± 4,55 мг GAE г⁻¹ для A. capillaris и 18,32 ± 2,76 мг GAE г⁻¹ для P. oleracea. Эти результаты подтверждают, что P. vulgaris содержит наиболее мощные антиоксидантные компоненты.

Зеленый синтез AuNP

Каждый экстракт способствовал формированию AuNP, что подтверждалось отличительными пиками SPR и видимыми изменениями цвета: PO-AuNP (темно-синий, широкая полоса 500–700 нм), AC-AuNP (коричневый, пик 555 нм) и PV-AuNP (вино-красный, пик 530 нм). Высокая антиоксидантная активность P. vulgaris перевелась в более высокую интенсивность SPR, более узкую полосу и улучшенную коллоидную стабильность. PO-AuNP агрегировали через 30 мин при 25 °C, показывая наименьшую стабильность среди трех.

Морфология и распределение размеров (PV-AuNP)

HR-TEM выявил разнообразную морфологию: сферы (23,8 ± 1,3 нм), равносторонние треугольники (25,7 ± 2,2 нм), стержни (28,4 ± 0,4 нм, соотношение сторон = 2,4) и ромбы (большая диагональ = 22,0 ± 0,6 нм, малая диагональ = 15,4 ± 0,3 нм). Все частицы были кристаллическими, как подтвердили решетчатые фринги. Гистограммы размеров показали гауссово распределение для каждой формы.

Гидродинамический размер и заряд поверхности

ДРС измерения дали гидродинамический диаметр 45 ± 2 нм (полидисперсность = 0,258) и отрицательный дзета-потенциал –13,99 мВ, указывая на эффективную стерическую и электростатическую стабилизацию поверхностно-связанными фитохимикатами.

Кристалличность (HR-XRD)

HR-XRD паттерны показывали характерные пики при 2θ = 38,1°, 44,5°, 64,8° и 77,4°, соответствующие плоскостям (111), (200), (220) и (311) кубической гранецентрированной решетки. Анализ Шеррера пика (111) дал приблизительный кристаллитный размер 16,7 нм.

Выход реакции

ИСС-ОЭС определил 96,337 ppm Au в коллоидном растворе и 0,679 ppm в supernatранте, давая 99,3% эффективность конверсии.

Антиоксидантная активность PV-AuNP

PV-AuNP демонстрировали дозозависимое поглощение DPPH с IC₅₀ 165,0 мкг мл⁻¹ Au (≈49,4 мкМ витамина C). Эта активность параллельна отчетам для растительно-медированных AuNP и атрибутируется поверхностно-связанным фенолам.

Цитотоксичность в раковых клеточных линиях

В безсывороточных условиях клетки HT-29 были наиболее чувствительны к PV-AuNP (65,6% ингибирования при 478,3 мкг мл⁻¹). PANC-1 и MDA-MB-231 показывали меньший отклик. С 10% ФТС клетки PANC-1 проявляли усиленную цитотоксичность (37,5% при 478,3 мкг мл⁻¹), тогда как цитотоксичность HT-29 снижалась, подчеркивая белковую-корона-зависимый, тканеспецифический эффект. Отрицательный дзета-потенциал вероятно способствует селективной адсорбции белков (например, фибриногена), влияя на клеточный захват и токсичность.

Заключение

Водные экстракты A. capillaris, P. oleracea и P. vulgaris демонстрировали измеримую антиоксидантную активность. P. vulgaris стал наиболее мощным восстановителем, давая высококристалличные, вино-красные AuNP (PV-AuNP) с 99,3% конверсией и гидродинамическим диаметром 45 ± 2 нм. PV-AuNP проявили дозозависимую антиоксидантную способность и селективную цитотоксичность по отношению к колоректальным, панкреатическим и молочным раковым клеткам, с модуляцией эффективности белковой короной. Эти находки подчеркивают ценность высокоантиоксидантных растительных экстрактов в зеленом синтезе наночастиц и указывают на PV-AuNP как перспективных кандидатов для таргетной доставки препаратов, особенно в комбинации с кардиопротекторными фитохимикатами из P. vulgaris. Будущая работа сосредоточится на загрузке химиотерапевтиков на PV-AuNP для использования как антиопухолевых, так и защитных эффектов.

Аббревиатуры

ABTS:

2,2′-Азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновой кислоты)

AC-AuNP:

Золотые наночастицы, синтезированные из экстракта A. capillaris

AgNP:

Серебряные наночастицы

AuNP:

Золотые наночастицы

BHT:

Бутилированный гидрокситолуол

DMEM:

Модифицированная среда Эйгла Дюльбекко

DPPH:

2,2-Дифенил-1-пикрилгидразил

FBS:

Фетальная телячья сыворотка

GAE:

Галловая кислота эквивалент

HR-TEM:

Высокоразрешающая передаточная электронная микроскопия

HR-XRD:

Высокоразрешающая рентгеновская дифракция

HT-29:

Клеточная линия человечной колоректальной аденокарциномы

IC₅₀:

Полумаксимальная ингибирующая концентрация

ICP-OES:

ИСС-ОЭС

MDA-MB-231:

Клеточная линия человечной аденокарциномы молочной железы

PANC-1:

Клеточная линия человечного проточного аденокарциномы поджелудочной железы

PO-AuNP:

Золотые наночастицы, синтезированные из экстракта P. oleracea

PV-AuNP:

Золотые наночастицы, синтезированные из экстракта P. vulgaris

SPR:

Поверностный плазмонный резонанс

WST assay:

Тест водорастворимой тетразолиевой соли