Антиоксидантный потенциал экстрактов Artemisia capillaris, Portulaca oleracea и Prunella vulgaris для биологического производства наночастиц золота и оценка цитотоксичности

Введение

Интерес к металлическим наночастицам значительно возрос благодаря их широкому спектру приложений [1]. В частности, наночастицы золота (AuNP) имеют множество ценных применений в качестве средств доставки лекарств / генов, катализаторов, агентов визуализации и химических / биологических сенсоров [2]. Для изготовления AuNP доступны различные химические и физические методы, такие как ионное распыление, обратная мицелла и химическое восстановление. Однако эти методы ограничены опасениями относительно их стоимости и потенциальной токсичности. Использование растительных экстрактов в биопроизводстве (или зеленом синтезе) AuNP имеет преимущества по сравнению с другими методами, что делает его чрезвычайно многообещающей альтернативой [2]. Процесс биотехнологии рентабелен и легко масштабируется. Он использует экологически чистые материалы и демонстрирует синергетический эффект, объединяя действия двух материалов (AuNP и растительные экстракты). Биотехнология не вводит вредных химических восстановителей во время синтеза, что делает процесс полностью экологически чистым. Кроме того, эта особенность увеличивает биосовместимость полученных AuNP и увеличивает их стабильность. Различные фитохимические вещества, полученные из растительных экстрактов, используются не только как восстанавливающие агенты, но также как покрывающие и стабилизирующие агенты [3].

Артемизия капиллярная принадлежит к роду Artemisia , который является одним из крупнейших родов семейства сложноцветных [4]. С давних времен А. капилляры широко используется в качестве лечебного средства на травах из-за его различных фармакологических эффектов, которые включают антибактериальное, противовоспалительное, антиоксидантное и гепатопротекторное действие. Предыдущие исследования приписывали эти эффекты активным компонентам A. капилляры , включая капиллин, капиллен, скопарон и β-ситостерин [4,5,6]. Portulaca oleracea , однолетний суккулент из семейства Portulacaceae, проявляет различные фармакологические эффекты, такие как антибактериальное, противогрибковое, противовоспалительное, антиоксидантное и противояльцерогенное действие. Было показано, что эти эффекты являются результатом различных активных компонентов, включая алкалоиды, жирные кислоты, флавоноиды, полисахариды и терпеноиды [7, 8]. Prunella vulgaris - многолетнее травянистое растение семейства Lamiaceae. Ряд исследований продемонстрировали противовирусное [9], противоопухолевое [10], иммуномодулирующее [11], антиоксидантное [11, 12] и гипогликемическое действие [13] P. vulgaris . Основными активными компонентами, которые способствуют этим эффектам, являются органические кислоты, фенольные кислоты и тритерпеноиды, включая линоленовую кислоту, пальмитиновую кислоту, цис- и транс- кофейная кислота, розмариновая кислота, олеаноловая кислота и урсоловая кислота [14].

Часто существует большой разрыв между результатами исследований наночастиц in vitro и in vivo из-за «белковой короны». Попадая в биологическую среду, поверхность наночастиц покрывается слоем разнообразных белков, который называется белковой короной [15]. Наночастицы, покрытые белковой короной, проникают в клетку и влияют на клеточное поглощение, цитотоксичность, биораспределение, экскрецию, клеточный ответ, высвобождение лекарства и терапевтическую эффективность [16]. Интересно, что физико-химические свойства металлических наночастиц, такие как их форма, размер, поверхностный заряд и шероховатость поверхности, сильно влияют на адсорбцию сывороточного белка при формировании белковой короны [17]. Шаннахан и его коллеги сообщили, что формирование белковой короны на наночастицах серебра (AgNP) опосредует клеточную токсичность против эпителиальных клеток легких крысы и эндотелиальных клеток аорты крысы через рецепторы поглотителей [18]. Сывороточный альбумин влияет на заключенные в гидрогель коллоидные AgNP, снижая их антибактериальные и цитотоксические эффекты [19].

В настоящем отчете мы оценили антиоксидантную активность водных экстрактов A. капилляры , П. oleracea , и П. vulgaris . Впоследствии было проведено биологическое производство AuNP с использованием этих трех экстрактов, чтобы исследовать, как антиоксидантная активность экстрактов влияет на цвет коллоидного раствора и форму полосы поверхностного плазмонного резонанса (SPR) AuNPs. В дальнейшем, биологические AuNP названы по научному названию каждого растения:AuNP, полученные с использованием экстракта A. капилляры называются AC-AuNP, AuNP, полученные с использованием экстракта P. oleracea называются PO-AuNP, а AuNP, полученные с использованием экстракта P. vulgaris называются PV-AuNP. Антиоксидантная активность P. vulgaris экстракт был самым высоким; Таким образом, мы охарактеризовали PV-AuNP различными спектроскопическими и микроскопическими методами, включая УФ-видимую спектрофотометрию, просвечивающую электронную микроскопию высокого разрешения (HR-TEM), дифракцию рентгеновских лучей высокого разрешения (HR-XRD) и индуктивно связанную плазму. оптическая эмиссионная спектроскопия (ICP-OES). Гидродинамический размер PV-AuNP измеряли с помощью динамического рассеяния света (DLS) вместе с дзета-потенциалом. Кроме того, мы исследовали антиоксидантную активность PV-AuNP, отслеживая активность улавливания радикалов 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил (DPPH). Цитотоксичность против трех раковых клеток исследовали с помощью анализа водорастворимого тетразолия (WST) либо в присутствии, либо в отсутствие фетальной бычьей сыворотки (FBS) в культуре клеток. Были использованы следующие раковые клетки:колоректальная аденокарцинома человека (HT-29), клетка аденокарциномы груди человека (MDA-MB-231) и клетка протоковой аденокарциномы поджелудочной железы человека (PANC-1).

Методы

Материалы

Калий, золото (III) хлорид (KAuCl ₄ ), бутилированный гидрокситолуол (BHT), одноосновный фосфат натрия, двухосновный фосфат натрия, трихлоруксусная кислота, фенольный реагент Фолина-Чокальтеу, карбонат натрия, галловая кислота, тартрат калия-натрия, бикарбонат натрия, серная кислота, 2,2'-азино-бис- 3-этилбензтиазолин-6-сульфоновая кислота (ABTS), персульфат калия и d - (+) - глюкоза были приобретены у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США). DPPH был приобретен у Alfa Aesar (Уорд Хилл, Массачусетс, США). Гексацианоферрат (III) калия был получен от Wako (Осака, Япония). Сульфат натрия, тетрагидрат гептамолибдата гексааммония и гептагидрат гидрокарсената динатрия были закуплены у Junsei (Токио, Япония). Хлорид железа (III) был получен от Duksan (Gyeonggi, Республика Корея), а пентагидрат сульфата меди был получен от Deajeng (Gyeonggi, Республика Корея). Остальные реагенты были аналитической чистоты и использовались без изменений. Среда Игла, модифицированная Дульбекко с высоким содержанием глюкозы (DMEM), пенициллин-стрептомицин (10000 Ед / мл), трипсин-ЭДТА (0,5%, без фенолового красного) и фосфатно-солевой буфер (PBS) были приобретены у Gibco (Thermo Fisher Scientific, г. Массачусетс, США). FBS был получен от GE Healthcare HyClone ™ (Виктория, Австралия).

Инструменты

Спектрофотометр Shimadzu UV-2600 был использован для получения спектров в УФ-видимом диапазоне и наблюдения SPR (Shimadzu Corporation, Киото, Япония). Информация о размере и форме частиц была получена из изображений HR-TEM. Для получения изображений HR-TEM использовался прибор JEM-2100F, работающий при 200 кВ (JEOL, Токио, Япония). Коллоидный раствор PV-AuNP наносили на покрытую углеродом медную сетку (углерод типа B, 300 меш, Ted Pella, Redding, CA, USA). Сетка с загруженным образцом сушилась на воздухе при температуре окружающей среды. Дифрактометр Rigaku Miniflex (40 кВ, 30 мА) использовался для получения картины HR-XRD с источником излучения CuKα ( λ =1,54056 Å) в диапазоне от 10º до 80 ° (2 θ шкала) (Ригаку, Япония). Сублимационная сушилка FD5505 была использована для приготовления порошкообразных образцов для HR-XRD анализа (Il Shin Bio, Сеул, Республика Корея). Для оценки выхода реакции ИСП-ОЭС проводили на приборе Perkin Elmer Optima 8300 (Waltham, MA, USA). Центрифугирование было проведено (18 500 g сила, 7 ч, 18 ° C), и супернатант собирали. Два образца, т.е. коллоидный раствор PV-AuNP и супернатант, подвергали анализу ICP-OES. Для центрифугирования использовали центрифугу Eppendorf 5424R (Eppendorf AG, Гамбург, Германия). Гидродинамический размер и дзета-потенциалы измеряли с помощью анализатора NanoBrook 90 Plus Zeta (Brookhaven Instruments Corporation, Холтсвилл, Нью-Йорк, США).

Приготовление водных экстрактов A. капилляры , П. oleracea , и П. vulgaris

Высушенные надземные части P. vulgaris и А. капилляры , включая цветы и листья, были приобретены у Omniherb (Тэгу, Республика Корея) и P. oleracea был получен от Handsherb (Youngchun, Республика Корея). Водные экстракты надземных частей каждого растения получали обработкой ультразвуком (WUC-A22H, Daihan Scientific Co. Ltd., Республика Корея). Для каждого растения 100 г измельченного растения трижды экстрагировали деионизированной водой (1000 мл). Процедура экстракции включала обработку растений ультразвуком при 25 ° C в течение 3 часов. Водный экстракт фильтровали, и фильтрат лиофилизировали в вакуумной сублимационной сушилке (FD8518, IlShinBioBase Co. Ltd., Республика Корея). Наконец, порошок экстракта каждого растения был получен и перед использованием хранился при -20 ° C.

Действия по удалению радикалов DPPH

В каждой лунке 96-луночного микропланшета 20 мкл каждого экстракта смешивали с раствором радикала DPPH в этаноле (0,1 мМ, 180 мкл) с получением нескольких конечных концентраций экстракта (31,25 мкг / мл, 62,5 мкг / мл, 125 мкг / мл и 250 мкг / мл). Планшет инкубировали в темноте в течение 30 мин при температуре окружающей среды, а затем оптическую плотность каждой лунки измеряли при 517 нм с использованием считывающего устройства с несколькими детекциями (Synergy HT, BioTek Instruments, Winooski, VT, USA). BHT использовался как стандарт. Все эксперименты проводили в трех повторностях. Поглощение AuNP вычитали из поглощения каждого образца, чтобы исключить внутреннее поглощение AuNP при 517 нм.

Действия ABTS по радикальной очистке

Катион-радикал ABTS был получен реакцией 1:1 ( об. / Об. ) смесь 7,4 мМ раствора ABTS и 2,6 мМ раствора персульфата калия в течение 24 ч в темноте при температуре окружающей среды. Раствор радикала ABTS разбавляли этанолом до оптической плотности 0,74 при 730 нм для измерений. В каждую лунку 96-луночного микропланшета раствор радикала ABTS в этаноле (180 мкл) добавляли к 20 мкл каждого экстракта (конечные концентрации экстракта 15,63 мкг / мл, 31,25 мкг / мл, 62,5 мкг / мл, и 125 мкг / мл). После инкубации в течение 10 минут в темноте при температуре окружающей среды оптическую плотность каждой лунки измеряли при 730 нм с использованием считывающего устройства с множественным детектированием. Раствор витамина С готовили стандартно. Все эксперименты проводились в трех экземплярах.

Уменьшение мощности

Равные объемы (500 мкл) экстрактов различной концентрации смешивали с 0,2 М фосфатным буфером (pH 6,6, 500 мкл) и 1% гексацианоферратом (III) калия (500 мкл). Конечные концентрации экстрактов составляли 52,1 мкг / мл, 104,2 мкг / мл, 208,3 мкг / мл и 416,7 мкг / мл. Каждую смесь инкубировали при 50 ° C. Через 20 минут к смеси добавляли трихлоруксусную кислоту (10%, 500 мкл) с последующим центрифугированием при 3400 g . сила в течение 10 мин. Затем раствор хлорида железа (0,1%, 100 мкл) добавляли к 500 мкл супернатанта. Через 10 мин оптическую плотность реакционной смеси измеряли при 700 нм с использованием считывающего устройства с множественным детектированием. BHT использовался как стандарт. Все эксперименты проводились в трех экземплярах.

Общее содержание фенолов

Исследована зависимость антиоксидантной активности от содержания фенольных соединений. Двадцать микролитров экстракта смешивали со 100 мкл реагента Фолина-Чокальтеу (разбавленного в 10 раз деионизированной водой) и 80 мкл карбоната натрия (7,5%, вес / объем ). Реакцию проводили в темноте при температуре окружающей среды. Через 30 мин измеряли оптическую плотность при 765 нм и определяли общее содержание фенола с использованием калибровочной кривой, построенной с использованием галловой кислоты. Все определения были выполнены в трех экземплярах.

Биотехнология PO-AuNP, AC-AuNP и PV-AuNP

Перед реакциями биопроизводства были приготовлены два исходных раствора:хлорид калия и золота (III) (10 мМ) и экстракт (2%, вес / объем ). Основной раствор каждого экстракта (2%) центрифугировали (18 500 g усилие, 30 мин, 18 ° C). Супернатант собирали и использовали для реакции биопроизводства. Конечные концентрации были доведены до 0,5 мМ хлорида калия и золота (III) и 0,05% ( мас. / Об. ) экстракт в стеклянном флаконе объемом 2 мл для биопроизводства AuNPs. После смешивания солей Au с экстрактом проводили инкубацию при 37 ° C в сушильном шкафу в течение 5 ч. Затем были получены УФ-видимые спектры в диапазоне 300 ~ 800 нм.

Культура клеток

Три раковых клетки (HT-29, PANC-1 и MDA-MB-231) были приобретены в Korean Cell Line Bank (Сеул, Республика Корея). Клетки выращивали в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы с добавлением 10% FBS, пенициллина (100 единиц / мл) и стрептомицина (100 мкг / мл). Клетки культивировали при 37 ° C (подавали 5% CO ₂ ) в инкубаторе и поддерживала примерно 80% конфлюэнтности до трипсинизации.

Цитотоксичность

Набор EZ-CYTOX от DoGenBio (Gyonggi, Республика Корея) использовали для анализа WST для оценки цитотоксичности против раковых клеток. Клетки высевали в 96-луночные планшеты плотностью 5,0 × 10 ³ . ячеек / лунка. Инкубацию проводили в течение 24 часов в инкубаторе при 37 ° C в атмосфере CO ₂ . (5%) атмосфера. После инкубации среду выбросили. Затем к клеткам с культуральной средой в присутствии или отсутствие ФБС. Еще через 24 часа инкубации при 37 ° C в инкубаторе добавляли реагент EZ-CYTOX (10 мкл), и клетки инкубировали в CO ₂ инкубатор еще на 1 час. Поглощение измеряли при 450 нм с использованием гибридного многомодового ридера Cytation (BioTek Instruments, Winooski, VT, USA). Собственная абсорбция PV-AuNP мешала измерению цитотоксичности при 450 нм. Поэтому фоновое поглощение PV-AuNP вычитали из поглощения каждой точки данных, измеренной при 450 нм. Фоновое поглощение PV-AuNP измеряли в условиях без WST. Кроме того, такой же объем деионизированной воды был использован в качестве контроля вместо PV-AuNP.

Статистический анализ

Все эксперименты были выполнены в трех экземплярах, и результаты представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка (SE). Достоверность различий исследовали с помощью ANOVA (односторонний дисперсионный анализ) с последующим тестом множественного сравнения Тьюки или тестом множественного сравнения Ньюмана-Кеулса. Статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения GraphPad (версия программного обеспечения GraphPad 5.02, Сан-Диего, Калифорния, США). Результаты считались статистически значимыми для значений p <0,05.

Результаты и обсуждение

Антиоксидантная активность экстрактов

Водные экстракты надземных частей каждого растения получали обработкой ультразвуком. Выходы экстракции A. капилляры , П. oleracea , и П. vulgaris составляли 14,1%, 39,12% и 28,6% соответственно. Самый высокий выход экстракции был показан в P. oleracea , за которым следует P. vulgaris и, наконец, А. капилляры . Чтобы оценить антиоксидантную активность экстрактов, мы измерили активность по улавливанию свободных радикалов, снижающую способность и общее содержание фенолов. Активность экстрактов по улавливанию свободных радикалов определяли с помощью анализов DPPH и ABTS. DPPH широко используется для оценки антиоксидантной активности фенольных соединений, потому что радикал DPPH является стабильным свободным радикалом, который теряет интенсивность поглощения, когда он восстанавливается антиоксидантами. Тест ABTS измеряет способность антиоксиданта улавливать радикалы, которые образуются в результате реакции сильного окислителя с ABTS. Оценено снижение поглощения радикала ABTS антиоксидантами с водорододонорными свойствами. Водные экстракты проявляли активность по улавливанию в зависимости от дозы. При испытанных концентрациях (15,63 мкг / мл, 31,25 мкг / мл, 62,5 мкг / мл, 125 мкг / мл и 250 мкг / мл) экстракт P. vulgaris (IC ₅₀ 50,35 ± 1,22 мкг / мл против радикала DPPH; IC ₅₀ 38,6 ± 0,44 мкг / мл против радикала ABTS) проявил наиболее сильную активность против радикалов DPPH и ABTS, за которым следует экстракт A. капилляры (IC ₅₀ 156,72 ± 0,97 мкг / мл против радикала DPPH; IC ₅₀ 147,28 ± 2,95 мкг / мл против радикала ABTS), а затем экстракт P. oleracea (IC ₅₀ 247,33 ± 1,57 мкг / мл против радикала DPPH; IC ₅₀ 305,54 ± 4,86 ​​мкг / мл против радикала ABTS). Примечательно, что П. vulgaris показал более сильную активность по улавливанию свободных радикалов DPPH, чем BHT (IC ₅₀ 71,37 ± 0,84 мкг / мл), который использовали в качестве стандарта (табл. 1 и рис. 1а, б). Выписка из П. vulgaris продемонстрировал наивысшую активность по улавливанию радикалов DPPH и ABTS среди трех экстрактов. Этот результат означал, что возможно больше антиоксидантных соединений будет существовать в P. vulgaris чем в A. капилляры и П. oleracea.

Активность по улавливанию радикалов DPPH и ABTS и снижение способности водных экстрактов A. капилляры , П. oleracea , и П. vulgaris . а Активность по нейтрализации радикалов DPPH. б ABTS радикально убирают мусор. c Снижение силы экстрактов. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Звездочки указывают на значимость разницы по сравнению со стандартом (BHT или витамин C):* p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001. Результаты являются репрезентативными для трех независимых экспериментов

Мы также исследовали антиоксидантную активность экстрактов через анализ снижающей мощности. В присутствии антиоксидантов феррицианид калия (Fe ³⁺ ) превращается в ферроцианид калия (Fe ²⁺ ), который реагирует с хлоридом трехвалентного железа с образованием комплекса двухвалентное железо. Комплекс трехвалентное железо имеет максимальное поглощение при 700 нм, что можно использовать для оценки восстанавливающей способности антиоксиданта. В текущем отчете восстанавливающая способность выражается как концентрация (мкг / мл) каждого экстракта, которая дает оптическую плотность 0,7 при 700 нм. Как показано на рис. 1c, P. vulgaris (162,98 мкг / мл) проявляли значительно более высокую восстанавливающую способность, чем A. капилляры (235,38 мкг / мл) и П. oleracea (396,16 мкг / мл). Как упоминалось ранее, результаты снижения мощности также показали, что, возможно, больше антиоксидантных соединений будет существовать в P. vulgaris чем в A. капилляры и П. oleracea.

Также исследовали общее содержание фенолов в каждом экстракте. Хорошо известно, что фенольные соединения являются потенциальными антиоксидантами и обладают способностью улавливать радикалы благодаря своим гидроксильным группам. Таким образом, антиоксидантная активность экстракта растений может хорошо коррелировать с его фенольным содержанием. Стандартная калибровочная кривая была построена с использованием галловой кислоты, и эта кривая показала линейную зависимость ( y =6,0617 x + 0,1293, r ² =0,9983). Используя стандартную кривую, было рассчитано общее содержание фенолов, которое выражается в миллиграммах эквивалента галловой кислоты (GAE) на грамм экстракта. Общее содержание фенолов в экстрактах составляло 90,53 ± 6,81 мг ГАЭ / г для P. vulgaris , 39,88 ± 4,55 мг ГАЭ / г для A. капилляры и 18,32 ± 2,76 мг ГАЭ / г для P. oleracea . Сумма общего фенольного содержания была наибольшей в P. vulgaris среди трех отрывков.

Обнаружена положительная корреляция между общим содержанием фенолов и способностью экстрактов улавливать радикалы или их восстанавливающей способностью. Взятые вместе, водные экстракты A. капилляры , П. oleracea , и П. vulgaris проявили значительную антиоксидантную активность. В частности, экстракт P. vulgaris продемонстрировал наибольшую активность по улавливанию радикалов против радикалов DPPH и ABTS, самую сильную восстанавливающую способность и самое высокое общее содержание фенолов, что означает, что экстракт P. vulgaris будет проявлять самую сильную активность в качестве восстановителя для биопроизводства AuNPs. Эти интересные результаты биотехнологии AuNP с использованием трех экстрактов будут обсуждаться в следующем разделе.

Биопроизводство AC-AuNP, PO-AuNP и PV-AuNP

Мы предположили, что антиоксидантная активность экстракта сильно влияет на процесс биопроизводства AuNPs. Поскольку антиоксидантная активность является основной движущей силой восстановления солей Au до AuNP, P. vulgaris , обладающий наивысшей антиоксидантной активностью, может быть наиболее эффективным восстановителем. Процесс биотехнологии сопровождался УФ-видимой спектрофотометрией, так как AuNP обладают отличительным SPR в видимом и ближнем инфракрасном диапазоне длин волн. Биопроизводство AuNPs выполняли путем смешивания солей Au с каждым раствором экстракта. Каждый экстракт содержал различные фитохимические вещества, которые очень эффективны для восстановления солей Au до AuNP.

Четкая полоса ППР AuNP привела к изменению цвета первоначально бледно-желтого раствора на темно-синий для PO-AuNP, флуоресцентный коричневый для AC-AuNP и винно-красный для PV-AuNP (рис. 2). . УФ-видимые спектры записывали после инкубации при 37 ° C в сухой печи в течение 5 часов, чтобы наблюдать отчетливую полосу SPR каждого набора AuNP (рис. 3). Максимальное поглощение наблюдалось при 530 нм для PV-AuNP и при 555 нм для AC-AuNP. В случае ПО-AuNP наблюдалась широкая полоса ППР от 500 до 700 нм. Три экстракта генерировали AuNP с характерной полосой ППР в УФ-видимом спектре. Каждое изменение цвета вместе с отдельной полосой SPR однозначно подтверждают успешное биопроизводство AuNP с каждым экстрактом. Мы предположили, что три фактора, связанные с антиоксидантной активностью (активность по улавливанию свободных радикалов, общее содержание фенолов и восстанавливающая способность), влияют на биофабрикацию AuNP. Выписка из П. vulgaris набрал наибольшее количество баллов по всем трем факторам, за ним следует A. капилляры и, наконец, П. oleracea . Интересно, что PO-AuNPs агрегировали после хранения при температуре окружающей среды (25 ° C) в течение 30 минут. Этот результат свидетельствует о том, что PO-AuNP были наиболее нестабильными по антиоксидантной активности, общему количеству фенольных соединений и снижающей способности P. oleracea были самыми низкими среди этих трех экстрактов. Напротив, PV-AuNP показали самое высокое поглощение и прозрачный винно-красный раствор. Поглощение AC-AuNP было между абсорбцией PO-AuNP и PV-AuNP. Таким образом, на основании этих наблюдений было определено, что более высокая активность по улавливанию свободных радикалов, общее содержание фенолов и снижающая способность P. vulgaris экстракт привел к синтезу более стабильных AuNP по сравнению с AuNP, продуцируемыми экстрактами A. капилляры и П. oleracea . В совокупности максимальные полосы SPR показали батохромные и гипохромные сдвиги с уменьшением антиоксидантной активности экстракта. Кроме того, форма полосы SPR имела тенденцию к расширению с уменьшением антиоксидантной активности. Соответственно, PV-AuNP были дополнительно охарактеризованы с помощью HR-TEM, HR-XRD, измерений гидродинамического размера и дзета-потенциала. Для определения выхода реакции был проведен анализ ICP-OES. Антиоксидантная активность и цитотоксичность в присутствии / отсутствии FBS были дополнительно оценены против раковых клеток.

Цифровые фотографии PO-AuNP, AC-AuNP и PV-AuNP

УФ-видимые спектры PO-AuNP (черная линия), AC-AuNP (красная линия) и PV-AuNP (синяя линия)

HR-TEM Изображения PV-AuNP

Микроскопические методы - наиболее эффективные инструменты для визуализации наночастиц. Наряду с HR-TEM, сканирующая электронная микроскопия и атомно-силовая микроскопия обычно используются для определения размера, морфологии, топографии и двумерных / трехмерных структур. Размер и морфологию PV-AuNP исследовали с помощью HR-TEM. Как показано на рис. 4, наблюдались различные формы, включая сферы, треугольники, стержни, ромбы и шестиугольники (рис. 4a ~ e). Наблюдение структур решетки в стержне (рис. 4f, g) и треугольнике (рис. 4h) ясно продемонстрировало, что PV-AuNP имеют кристаллическую природу. Этот результат был полностью подтвержден последующими результатами анализа HR-XRD. Размер каждой формы частицы измеряли по изображениям HR-TEM, и полученные гистограммы размеров проиллюстрированы на фиг. 5. Все гистограммы показали гауссово распределение. Дискретные наночастицы на изображениях были выбраны случайным образом, чтобы получить средний размер каждой формы. Диаметр сфер составил 23,8 ± 1,3 нм из 250 наночастиц (рис. 5а). Интересно, что были получены равносторонние треугольники; Таким образом, мы измерили высоту 64 наночастиц (25,7 ± 2,2 нм, рис. 5б). Двадцать семь наночастиц в форме стержней были случайным образом выбраны для определения средней длины (28,4 ± 0,4 нм, рис. 5c). Среднее соотношение сторон, определяемое как длина, деленная на ширину, стержней было определено равным 2,4. Для формы ромба на изображениях случайным образом было выбрано 38 ромбов. Как показано на рис. 5d, e, измеренные средние длины длинной и короткой диагональных линий составили 22,0 ± 0,6 нм и 15,4 ± 0,3 нм соответственно. PV-AuNP различной формы имели размер менее 30 нм, и в следующем разделе эти размеры сравнивались с гидродинамическими размерами.

HR-TEM-изображения PV-AuNP. Масштабная линейка представляет a 50 нм, b 50 нм, c 50 нм, d 50 нм, e 10 нм, f 2 нм, г 2 нм и h 2 нм

Гистограммы размеров PV-AuNP. а Диаметр сфер. б Высота равносторонних треугольников. c Длина стержней. г Длина (длинная диагональная линия) ромбов. е Длина (короткая диагональная линия) ромбов

Гидродинамический размер и дзета-потенциал PV-AuNP

Гидродинамический размер и дзета-потенциал являются важными характеристиками в исследованиях наночастиц для дальнейшего применения. Как правило, размер, измеренный с помощью изображений HR-TEM, меньше, чем размер гидродинамического размера, поскольку гидродинамический размер отражает биомолекулы, связанные на поверхности наночастиц. Как показано на рис. 6а, гидродинамический размер был определен как 45 ± 2 нм с показателем полидисперсности 0,258, что было больше, чем размер сфер, измеренный по изображениям HR-TEM (23,8 ± 1,3 нм от 250 наночастиц). . Этот результат ясно указывает на то, что фитохимические вещества в экстракте связываются с поверхностью PV-AuNP и стабилизируют их. Кроме того, PV-AuNP обладают отрицательным дзета-потенциалом -13,99 мВ (фиг. 6b). Эти результаты показали, что фитохимические вещества с отрицательными зарядами, скорее всего, способствовали отрицательному дзета-потенциалу. Этот отрицательный дзета-потенциал создает силы отталкивания в коллоидном растворе PV-AuNP, обеспечивая его стабильность. Поэтому одна из наших будущих работ будет включать фитохимический скрининг экстракта P. vulgaris для выяснения точных соединений, которые вносят вклад в отрицательный дзета-потенциал.

Hydrodynamic size and zeta potential of PV-AuNPs. а Hydrodynamic size. б Zeta potential

HR-XRD Analysis of the PV-AuNPs

X-ray diffraction analysis is generally employed to obtain crystallographic information about metallic nanoparticles. The characteristic diffraction patterns in terms of the Bragg reflections obtained from HR-XRD showed that the PV-AuNPs possessed a crystalline structure. The diffraction peaks (2θ values) observed at 38.1°, 44.5°, 64.8°, and 77.4° corresponded to the (111), (200), (220), and (311) planes, respectively, of a face-centered cubic structure in the PV-AuNPs (Fig. 7). The Scherrer equation (D  = 0.89·λ/W·cosθ ) was used to determine the approximate size of the PV-AuNPs. We selected the most intense (111) peak for application in the equation. The definition of each term in the equation is as follows:D is the size of the PV-AuNPs determined from the (111) peak, θ is the Bragg diffraction angle of the (111) peak, λ is the X-ray wavelength that was utilized, and W is the full width at half maximum (FWHM) of the (111) peak, in radians. From the Scherrer equation, the approximate size of the PV-AuNPs was determined to be 16.7 nm. The size determined from the Scherrer equation was smaller than the sizes measured from both HR-TEM images and the hydrodynamic size. The hydrodynamic size was the largest, possibly due to the fact that phytochemicals in the extract bound to the surface of the PV-AuNPs.

HR-XRD analysis of PV-AuNPs

Reaction Yield of the PV-AuNPs

ICP-OES was used to estimate the reaction yield. First, the total concentration of Au was obtained by analyzing the PV-AuNP solution. Second, the PV-AuNPs were centrifuged and the supernatant was collected. The supernatant was analyzed to ascertain the concentration of unreacted Au in the reduction reaction. Then, the reaction yield was estimated as follows:reaction yield (%) = 100 − [Au concentration in the supernatant/Au concentration in the colloidal solution] × 100.

Based on ICP-OES analysis, the concentrations of Au in the colloidal PV-AuNP solution and the supernatant were determined to be 96.337 ppm and 0.679 ppm, respectively. Therefore, the reaction yield of the PV-AuNPs was determined to be 99.3%. From the ICP-OES results, we concluded that the reaction condition was optimal which produced a high reaction yield of PV-AuNPs.

Antioxidant Activity of the PV-AuNPs

The DPPH radical scavenging activity was examined to evaluate the antioxidant activity of the PV-AuNPs. As shown in Fig. 8, the DPPH radical scavenging activity of the PV-AuNPs was nearly constant at a concentration of less than 20.9 μg/mL (based on the Au concentration). However, as the concentration increased (41.9~334.8 μg/mL based on the Au concentration), the DPPH radical scavenging activity also increased, suggesting that the activity was dose-dependent. The IC₅₀ of the PV-AuNPs was observed to be 165.0 μg/mL, which was equivalent to the IC₅₀ of vitamin C (49.4 μM).

DPPH radical scavenging activity of PV-AuNPs. The concentration was expressed as Au concentration

Green-synthesized AuNPs or AgNPs have been known to possess antioxidant activity in terms of DPPH radical scavenging activity [20, 21]. Ginseng-berry-mediated AuNPs demonstrated antioxidant activity [20]. The absorption of phytochemicals in the ginseng berry extract on the surface of nanoparticles having a large surface area can be credited to the antioxidant activity of AuNPs [20]. Green-synthesized AuNPs using Angelica pubescens roots showed antioxidant activity with a dose-dependent manner [21]. Secondary metabolites in A. pubescens such as flavonoids, sesquiterpenes, and phenolic compounds are potential contributors for the free radical scavenging activity [21]. However, AgNPs demonstrated higher antioxidant activity than AuNPs in the two articles mentioned above.

Cytotoxicity of the PV-AuNPs

The cytotoxicity of the PV-AuNPs against three cancer cells from different tissue types (colon, pancreas, and breast) was evaluated to examine the tissue-specific cytotoxicity of the nanoparticles in the presence/absence of FBS (Fig. 9). When serum was present during the cell culture, various kinds of protein coronas formed. The protein corona was dependent on the characteristics of the nanoparticles, such as the size, shape, surface charge, and surface roughness [22]. The protein corona can either increase or decrease the cellular uptake and cytotoxicity of the nanoparticles [23]. However, there are controversial reports regarding whether the protein corona causes the cytotoxicity to increase or decrease. Thus, the cytotoxicity of the PV-AuNPs was evaluated in the presence and absence of FBS. In the absence of FBS, HT-29 showed the greatest cytotoxicity at the tested concentrations (29.9~478.3 μg/mL) among three cells (Fig. 9a), followed by MDA-MB-231 (Fig. 9b) and lastly by PANC-1 (Fig. 9c). However, in the presence of FBS, these cells demonstrated a different phenomenon. PANC-1 showed the highest cytotoxicity, followed by HT-29 cells. In the absence of FBS and with 478.3 μg/mL Au, both the PANC-1 and MDA-MB-231 cells did not show any significant cytotoxicity, while strong cytotoxicity was observed for the HT-29 cells (65.6% cytotoxicity). However, in the presence of FBS, cytotoxicity was observed for PANC-1 (37.5% cytotoxicity) at 478.3 μg/mL Au. In general, the PV-AuNPs surrounded by a protein corona strongly influenced the cytotoxicity against cancer cells, although the results were tissue-specific. The protein corona produced by FBS increased the cytotoxicity against PANC-1 when compared with the cytotoxicity in the absence of FBS; however, the cytotoxicity decreased in the presence of the protein corona for HT-29 when compared with the cytotoxicity without the protein corona.

In vitro cytotoxicity on cancer cells. а HT-29. б MDA-MB-231. c PANC-1

It has been reported that a variety of proteins bind to both positively and negatively charged AuNPs, while few proteins bind to AuNPs with a neutral charge [17, 24]. The negatively charged AuNPs showed a higher affinity and a slower release of fibrinogen protein than the positively charged AuNPs, suggesting the existence of specific binding sites for fibrinogen on the negatively charged AuNPs [17]. The PV-AuNPs possessed a negative zeta potential; thus, the binding of fibrinogen may affect the cytotoxicity against cancer cells. The investigation of the protein corona of nanoparticles is beneficial in nanomedicine research for future biomedical and clinical applications.

Conclusions

The aqueous extracts of A. capillaris , П. oleracea , и П. vulgaris exhibited antioxidant activity which was evaluated by free radical scavenging activity, total phenolic content, and reducing power. P. vulgaris exerted the highest antioxidant activity, followed by A. capillaris and P. oleracea . The extract of P. vulgaris possessing the highest antioxidant activity was a very efficient green reducing agent for the biofabrication of AuNPs. The findings of our study demonstrate that the factors of the antioxidant activity, such as the free radical scavenging activity, reducing power, and total phenolic content, are closely correlated with the color of the colloidal solution and the shape of the SPR band of the resulting AuNPs. When the antioxidant activity was high, the resulting AuNPs showed a narrow SPR band with a strong absorbance. In contrast, a broad SPR band was observed for the PO-AuNPs, in which P. oleracea exhibited the lowest antioxidant activity among the three extracts. Furthermore, the PO-AuNPs aggregated easily after storage at ambient temperature. Consequently, the extract of P. vulgaris produced a wine-red colloidal solution of PV-AuNPs with various shapes with a maximum SPR of 530 nm. A face-centered cubic crystalline pattern of PV-AuNPs was confirmed by high-resolution X-ray diffraction analysis. The reaction yield was estimated by ICP-OES to be 99.3%. The hydrodynamic size (45 ± 2 nm) was larger than that measured from HR-TEM images suggesting that phytochemicals bound on the surface of the PV-AuNPs. Furthermore, phytochemicals with negative charges possibly attributed to a negative zeta potential of − 13.99 mV. The antioxidant activity of the PV-AuNPs was dependent on the Au concentration that was assessed based on the DPPH radical scavenging activity. Green-synthesized AuNPs using ginseng-berry and A. pubescens root extracts also showed DPPH radical scavenging activity [20, 21]. The PV-AuNPs showed cytotoxicity against HT-29, PANC-1, and MDA-MB-231 cells. Interestingly, the presence or absence of FBS dramatically affected the cytotoxicity against these cells. This phenomenon was possibly due to the protein corona that surrounded the surface of the nanoparticles.

Currently, AuNPs have diverse applications in nanomedicine as drug delivery vehicles or carriers of anticancer agents such as doxorubicin. P. vulgaris ethylacetate fraction showed cardioprotective effects with a concentration-dependent manner on isolated rat cardiomyocytes subjected to doxorubicin-induced oxidative stress [25]. PV-AuNPs can be applied as doxorubicin delivery vehicles with a cardioprotective ability. Therefore, our subsequent work will explore the anticancer activities of the PV-AuNPs loaded with doxorubicin for future biomedical and pharmaceutical applications. Diverse plant extracts have a potential to be effective reducing agents for biofabricating AuNPs. When the biofabrication reaction is conducted, it is essential to select a plant extract that possesses a high antioxidant activity in order to produce stable AuNPs. Additionally, P. vulgaris extract has a potential to be used as a reducing agent for the green synthesis of other novel metallic nanoparticles with valuable applications in the future.

Сокращения

ABTS:

2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)

AC-AuNPs:

Gold nanoparticles green synthesized by the extract of A. capillaris

AgNPs:

Silver nanoparticles

AuNPs:

Gold nanoparticles

BHT:

Butylated hydroxytoluene

DMEM:

Dulbecco’s modified Eagle’s medium

DPPH:

2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl

FBS:

Fetal bovine serum

GAE:

Gallic acid equivalent

HR-TEM:

Просвечивающая электронная микроскопия высокого разрешения

HR-XRD:

Дифракция рентгеновских лучей высокого разрешения

HT-29:

Human colorectal adenocarcinoma cell

IC₅₀ :

Half maximal inhibitory concentration

ICP-OES:

Inductively coupled plasma optical emission spectroscopy

MDA-MB-231:

Human breast adenocarcinoma cell

PANC-1:

Human pancreas ductal adenocarcinoma cell

PO-AuNPs:

Gold nanoparticles green synthesized by the extract of P. oleracea

PV-AuNPs:

Gold nanoparticles green synthesized by the extract of P. vulgaris

SPR:

Surface plasmon resonance

WST assay:

Water-soluble tetrazolium assay