Поверхностный заряд определяет комплексацию наночастиц пуллана с сывороточным альбумином и контролируемое высвобождение лекарства

Аннотация

Проектирование наночастиц опирается на то, как поверхностная химия управляет адсорбцией белков в кровеносном потоке. Мы синтезировали три модифицированных пуллана: холестерин-модифицированный пуллан (CHP), CH-модифицированный амированный пуллан (CHAP) и CH-модифицированный карбоксилированный пуллан (CHSP), и получили наночастицы диализом. Динамическое рассеяние света показало, что размер частиц зависит от числа заряженных групп: CHP (73,1 нм, −0,698 мВ), CHAP (116,9 нм, +12,9 мВ), CHSP (156,9 нм, −15,4 мВ). Изотермическая титровая калориметрия выявила разные термодинамические профили связывания с HSA: константы связи (K_b) 1,41×10⁴, 27,7×10⁴ и 412×10⁴ М⁻¹ для CHSP, CHP и CHAP соответственно, отражая влияние поверхностного заряда. Флуоресценция и дихроизм подтвердили, что HSA теряет α-спираль при комплексации, причем CHP вызывает наибольшие конформационные изменения. In vitro высвобождение митоксантрона показало, что адсорбция HSA заметно замедляет выработку: через 48 ч CHSP–HSA выделило 35,8%, CHP–HSA 33,9%, CHAP–HSA 32,5%, тогда как свободные наночастицы дали 53,7%, 58,5% и 63,2%. Результаты подчеркивают, что размер, заряд и формирование белковой короны критически определяют кинетику высвобождения и терапевтическую эффективность.

Введение

Направленная нано-доставка лекарств стала краеугольным камнем современной онкологии, обеспечивая устойчивое высвобождение и снижение системной токсичности. Чтобы наночастица (НЧ) достигла опухоли, она должна пройти кровоток, эндотелий, внеклеточную матрицу и войти в раковые клетки. Адсорбция белков — особенно высококонцентрированных плазменных белков, таких как сывороточный альбумин человека (HSA) — образует «белковую корону», которая может изменить биораспределение, клеточный захват и высвобождение лекарства. Состав короны определяется концентрацией белка, аффинностью НЧ и поверхностными свойствами: зарядом, гидрофобностью и размером.

Пуллан — нейтральный полисахарид, который можно хيميчески модифицировать, вводя гидрофобные холестериновые группы, получая амфифильные полимеры, самособирающиеся в ядро-оболочечные НЧ. Ранее показано, что холестерин-модифицированный пуллан (CHP) инкапсулирует антинеопластические препараты и связывает HSA через гидрофобные взаимодействия. На этой основе мы создали два варианта: CHAP с аминогруппами и CHSP с карбоксилгруппами. Эти модификации позволяют систематически изучить влияние поверхностного заряда на адсорбцию белка и высвобождение лекарства.

Методы

Материалы

HSA (Sigma-Aldrich), N,N-имидазол, этилендиамин, сукциновый ангидрид и другие реактивы аналитического чистоты.

Синтез CHP, CHSP, CHAP

CHP получен этерификацией пуллана сукцинатом холестерина (CHS) в DMSO с последующей очисткой. CHAP синтезировали реакцией CHP с N,N-диимидазолом и этилендиамином; CHSP — путем сопряжения с сукциновым ангидридом. Структуру подтвердили FTIR и ¹H-NMR, степени замещения холестерином составили 4,5% (CHP), 7,8% (CHSP), 14,1% (CHAP).

Приготовление и характеристика НЧ

Наночастицы получили диализом полимеров в DMSO против воды с последующей фильтрацией (0,45 мкм). Размер и дзета-потенциал измерили ДРС. CHP, CHAP, CHSP НЧ имели средние диаметры 73,1; 116,9; 156,9 нм и дзета-потенциалы −0,698; +12,9; −15,4 мВ соответственно.

ITC

Изотермическая титровая калориметрия определила термодинамику связывания HSA с каждой НЧ при 25 °C. Экзотермическое связывание для CHP и CHSP, а для CHAP — начальная экзотермическая фаза, смененная эндотермической, отражает интерплей гидрофобных и электростатических сил.

Флуоресценция

Флуоресценция HSA (возбуждение 280 нм, эмиссия 290–450 нм) отслеживали после смешивания с НЧ. Анализ кво칭 по модифицированному уравнению Штерна-Вольмера дал константы связи 2,02; 2,99; 4,72×10⁵ М⁻¹ для CHSP, CHP, CHAP, подтверждая наисильнейшее взаимодействие для положительно заряженного CHAP.

Циркулярный дихроизм

CD-спектры (200–250 нм) оценивали изменения вторичной структуры HSA при связывании с НЧ. α-спиральное содержание снизилось с 55% (свободный HSA) до 48–52% для комплексов, с наибольшим уменьшением для CHP–HSA.

In vitro высвобождение лекарства

Митоксантрон (MTO) инкапсулировали в каждую НЧ диализом. Профили высвобождения измеряли в ФСБ при 37 °C с HSA (0,1 мг/мл) и без. Свободный препарат выделился на 99,8% за 4 ч. Для НЧ без HSA 48-часовые скорости: 53,7% (CHP), 58,5% (CHAP), 63,2% (CHSP). Присутствие HSA снизило их до 33,9% (CHP–HSA), 32,5% (CHAP–HSA), 35,8% (CHSP–HSA).

Результаты

Характеристика полимеров CHP, CHSP, CHAP

FTIR подтвердил успешную функционализацию: эфирные карбонилы при 1731 см⁻¹ для CHP, амидные пики при 1648 см⁻¹ для CHAP, карбоксиловые при 1710 см⁻¹ для CHSP. NMR-квантификация степеней замещения представлена в таблице 1.

Свойства НЧ CHP, CHSP, CHAP

Размер и поверхностный заряд напрямую влияли на самосборку: отрицательно заряженные CHSP и положительно заряженные CHAP образовали более крупные частицы (156,9 и 116,9 нм) по сравнению с нейтральным CHP (73,1 нм). Зета-потенциалы отразили введенные функциональные группы (−15,4; +12,9; −0,698 мВ). Наличие заряженных групп нарушало упаковку ядра, давая более рыхлые и большие структуры.

Термодинамический анализ

Данные ITC (таблица 2) показали экзотермическое связывание для CHP (ΔH = 42,8 кДж/моль) и CHSP (ΔH = 80,4 кДж/моль), и смешанный экзо-эндо профиль для CHAP (ΔH = 22,4 кДж/моль). Энтропийные изменения указывали на более легкое связывание HSA с CHP и CHAP (ΔS = 0,251 и 2,775 кДж/моль·К) чем с CHSP (ΔS = 0,201 кДж/моль·К).

Флуоресценция

Квочинг флуоресценции подтвердил быструю фазу адсорбции, за которой следует более медленное формирование комплекса. Константы связи из анализа Штерна-Вольмера совпали с ITC, подчеркивая доминирующую роль электростатики для CHAP и гидрофобности для CHP.

CD-спектры

CD-показали прогрессивную потерю α-спирали: CHP–HSA упало до 48,0%, CHAP–HSA до 48,6%, CHSP–HSA до 52,0%. Наиболее быстрое снижение спиралистости у CHP согласуется с его компактным гидрофобным ядром.

Высвобождение лекарства

Адсорбция HSA однородно замедлила высвобождение для всех типов НЧ. Иерархия скоростей (48 ч) соответствовала последовательности размера и заряда: CHSP > CHAP > CHP для свободных НЧ, и CHSP–HSA > CHP–HSA > CHAP–HSA для комплексов с белком. Это демонстрирует, как белковая корона модулирует диффузию и деградацию.

Обсуждение

Данные подтверждают, что поверхностный заряд решает формирование короны HSA и последующую кинетику высвобождения. Положительно заряженный CHAP формирует самый крепкий комплекс НЧ–HSA за счет комбинированного электростатического притяжения и гидрофобного якорения. Отрицательно заряженный CHSP показывает самое слабое связывание, ограниченное зарядовым отталкиванием и более пористой оболочкой, замедляющей миграцию белка к ядру. Нейтральный CHP занимает промежуточное положение, демонстрируя наивысшее покрытие HSA благодаря компактному гидрофобному ядру.

Эти взаимодействия влияют на in vivo судьбу лекарственных НЧ. Плотная белковая корона может препятствовать прохождению через эндотелий, менять органное распределение и снижать клеточный захват. Настраивая поверхностный заряд, можно модулировать состав короны и тем самым точно регулировать фармакокинетику и терапевтическое окно.

Заключение

Мы успешно спроектировали три наночастицы на базе пуллана с разным поверхностным зарядом. Размер, заряд и гидрофобность в совокупности управляют адсорбцией HSA, силой связывания и кинетикой высвобождения лекарства. Положительно заряженный CHAP показывает самое сильное белковое связывание и самое медленное высвобождение, тогда как нейтральный CHP демонстрирует наивысшее покрытие белком, но самое быстрое высвобождение среди свободных НЧ. Эти знания предоставляют черновик для создания наноносителей с заданными профилями белковой короны для оптимизации адресной доставки и контролируемого высвобождения.

Аббревиатуры

EDX

Энергодисперсная рентгеновская спектроскопия

SEM

Развеивающая электронная микроскопия

TEM

Трансляционная электронная микроскопия

XRD

Рентгеновская дифракция