Формирование комплекса наночастиц и HSA на основе пуллулана и высвобождение лекарства под влиянием поверхностного заряда

Фон

Система доставки нанолекарств, такая как наночастицы (НЧ), нагруженные низкомолекулярными противоопухолевыми лекарственными средствами, обладает устойчивыми и контролируемыми свойствами высвобождения лекарств, а также направленным действием. Таргетная терапия НЧ стала основным направлением лечения опухолей, поскольку они могут значительно уменьшить побочные эффекты лекарств и повысить их эффективность [1,2,3].

НЧ, нагруженные лекарством, должны пройти по трем путям, чтобы достичь места-мишени, то есть через кровообращение, путь от ткани к клетке и внутриклеточное движение [4,5,6]. Им также необходимо преодолеть сосудистый барьер, чтобы достичь ткани-мишени, а затем барьер клеточной мембраны, чтобы достичь клетки-мишени [7, 8]. Адсорбция и обмен белков вовлечены во все пути НЧ. Наконец, НЧ, адсорбированные белком, достигают клеток-мишеней и высвобождают лекарства [1, 9].

Белки с высоким содержанием, такие как сывороточный альбумин человека (HSA), липопротеины и глобулин, обычно адсорбируются на поверхности загруженных лекарством НЧ, таким образом изменяя характер высвобождения in vivo и сайты нацеливания НЧ [10]. Количество и тип адсорбированных белков тесно связаны с концентрацией белков в плазме и сродством НЧ [11]. Чем выше концентрация белка в плазме, тем больше поверхностная адсорбция НЧ [12]. Белок с высоким сродством может заменить белок со слабым сродством [13]. Следовательно, поверхность НЧ занята белком с высокой концентрацией и сильным сродством, образуя нанобелковую корону [14]. Нанобелковые короны незаменимы для функционирования НЧ in vivo [15]. Например, если поверхность модифицирована полисорбатом, НЧ могут доставлять лекарство через гематоэнцефалический барьер в ткань мозга [16]; гидрофобно-модифицированные полисахаридные наноматериалы могут взаимодействовать с HSA в организме, тем самым усиливая контроль высвобождения лекарства [17].

На поглощение НЧ клетками влияет множество факторов, таких как физические и химические свойства НЧ, концентрация нанолекарств, адсорбция белка и клеточная адгезия [18]. Типы и количество адсорбции белка влияют на функцию НЧ, включая контроль высвобождения лекарственного средства и нацеливание. Кроме того, физические и химические свойства НЧ, такие как размер частиц, заряд и поверхностная гидрофобность, влияют на адсорбцию белка [19]. Природа NP определяет его судьбу в процессе in vivo [20]. Амфифильные макромолекулярные материалы, такие как гидрофобно модифицированные полисахаридные полимеры, могут самоорганизовываться в частицы нанометрового размера. Размер NP играет важную роль в его функциях нацеливания и контроля высвобождения лекарства [21]. Гидрофобная группа в полимере является движущей силой образования ядерной структуры НЧ. НЧ меньше, чем больше степень замещения гидрофобной группы [22]. Полимерные материалы с карбоксильными группами, аминогруппами и их производными участвуют в самосборке НЧ, поэтому они влияют на размер НЧ и обеспечивают поверхностный заряд для легкого присоединения к белку с противоположным зарядом [23]. НЧ с разным поверхностным зарядом обладают разной способностью к адсорбции белков и разными биологическими функциями [24]. Следовательно, нам необходимо изучить взаимодействие между различными поверхностными компонентами НЧ и белка.

HSA - самый распространенный белок в крови. Он необходим для транспорта, распределения и метаболизма чужеродных и эндогенных веществ. Многие низкомолекулярные лекарства попадают в организм и образуют адсорбенты HSA-лекарства при транспорте крови, что изменяет фармакологические эффекты лекарств [25]. НЧ, нагруженные лекарствами, после попадания в организм объединяются с HSA; из-за сложной структуры НЧ характеристики адсорбции отличаются от низкомолекулярных комбинаций ЧСА [26]. Например, низкомолекулярные лекарства адсорбируются молекулами HSA быстро; однако адсорбция HSA на НЧ происходит медленно и сложно [27].

Наночастицы ГПК в качестве носителя лекарств изучались в течение долгого времени, что показало отличные наноматериалы для доставки лекарств [28, 29]. В предыдущем эксперименте мы изучили взаимодействие между ЧСА и НЧ пуллулана с разной степенью замещения холестерина, пуллуланом (ГГП), модифицированным гидрофобно холестериком (ГГ), и обнаружили в основном два процесса:ЧСА быстро прикреплялся к поверхности НЧ, а затем медленно вставлялся в гидрофобное ядро ​​НЧ [30]. Гидрофобные взаимодействия играли основную роль в образовании комплексов CHP-HSA [31]. Гидрофобность и структура оболочка-ядро частиц в основном ответственны за изменения конформации альбумина во время взаимодействия НЧ и ЧСА [30].

В этом исследовании мы произвели три NPs, CHP, CH-модифицированный анимированный пуллулан (CHAP) и CH-модифицированный карбоксилированный пуллулан (CHSP). Их структура и свойства были охарактеризованы с помощью инфракрасного излучения с преобразованием Фурье (FTIR) и ЯМР, а их размеры и потенциалы были определены с помощью динамического рассеяния света (DLS). Изотермическая калориметрия титрования (ITC) и флуоресцентная спектроскопия были использованы для исследования характеристик взаимодействия комплексов NP-HSA и влияния трех типов наночастиц на структуру HSA. Мы раскрываем влияние на высвобождение лекарства с помощью свойств комплексов NP-HSA, что имеет жизненно важное значение для будущего применения системы доставки лекарств.

Методы

Материалы

HSA был приобретен у Sigma Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США). N , N -Имидазол был получен из биотехнологии стокового раствора в Шанхае (Шанхай). Этилендиамин, янтарный ангидрид, был предоставлен Tianjin Star Chemical Reagent (Тяньцзинь). Все остальные химические реагенты были аналитической чистоты и были от Changsha Huicheng Co. (Чанша, Китай).

Синтез CHP, CHSP и CHAP

Синтез CHP

Сукцинат холестерина (ХС) синтезировали, как описано ранее [32]. 2 г полисахарида пуллулана растворяли в 10 мл раствора дегидратированного диметилсульфоксида (ДМСО). Затем 1,06 г CHS, 0,505 г EDC • HCl и 0,268 г DMAP растворяли в соответствующем количестве раствора ДМСО. Вышеупомянутые две группы реагентов смешивали и активировали при комнатной температуре в течение 1 часа, затем инкубировали на нагретой масляной бане при 50 ° C в течение 48 часов. После остановки реакции и охлаждения до комнатной температуры добавляли соответствующее количество безводного этанола, и белое твердое вещество осаждали при перемешивании и получали повторными фильтрациями с отсасыванием. Продукты промывали соответствующим количеством безводного этанола, этилового эфира и тетрагидрофурана, затем сушили в струйной сушилке при 50 ° C до образования белого твердого вещества (рис. 1).

Синтез полимеров CHP, CHSP и CHAP

Синтез CHAP

Количество 1,80 г CHP и 1,00 г N , N -диимидазол растворяли в 100 мл ДМСО. После нагревания и перемешивания на масляной бане при 50 ° C в течение 4 часов добавляли 3,60 г этилендиамина с последующим дальнейшим нагреванием и перемешиванием в течение 24 часов. Когда реакционная жидкость охлаждалась до комнатной температуры, ее диализовали в диализном мешке с перехватом 4000 с бидистиллированной водой в течение 1 дня, затем лиофилизировали, чтобы получить светло-желтое твердое вещество, которое было продуктом гидрофобно модифицированного анимированного пуллулана.

Синтез CHSP

1,80 г КГП растворяли в 100 мл дегидратированного ДМСО, затем 0,5 г янтарного ангидрида и 0,05 г 4-диметиламинопиридина (ДМАП) растворяли в 10 мл ДМСО, активированного в течение 1 ч; после нагревания и перемешивания на масляной бане при 50 ° C в течение 20 часов реакцию останавливали. Когда реакционная жидкость охлаждалась до комнатной температуры, ее помещали в соответствующее количество безводного этанола и перемешивали для осаждения белого твердого вещества. Белое твердое вещество несколько раз промывали подходящим количеством безводного этанола, диэтилового эфира и тетрагидрофурана и сушили в струйной сушилке при 50 ° C. Полученный продукт представлял собой гидрофобно модифицированный карбоксилированный полисахарид пуллулана.

FTIR и ЯМР-спектроскопия

Спектры FTIR для CHP, CHSP и CHAP были получены в таблетках KBr для FTIR-спектроскопии (Nicolet NEXUS 470-ESP, Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США). Химические структуры CHP, CHSP и CHAP были подтверждены на 500 МГц ¹ H-ЯМР с ДМСО-d6 в качестве растворителя. Степень замещения холестерина в полимерах ГПК определялась гликозидной связью альфа-1,4 и альфа-1,6 и площадью пика метилена.

Приготовление и характеристика НП

НЧ ГПК, ЦГШП и ЦГАП получали методом диализа [33]. Вкратце, CHP, CHSP и CHAP растворяли в 10 мл ДМСО. Для образования НЧ раствор смеси вводили в диализный мешок на 24 ч для удаления ДМСО. Раствор НЧ CHP, CHSP и CHAP просеивали с помощью мембранного фильтра (размер пор 0,45 мкм, Millipore, Бостон, Массачусетс, США) для удаления более крупных агрегированных НЧ CHP, CHSP и CHAP. Распределение по размерам и дзета-потенциал полученных частиц определяли с помощью DLS (Zetasizer 3000 HS, Malvern Instruments, Малверн, Великобритания) при 11,4 В / см, 13,0 мА.

ITC

Определенную концентрацию раствора HSA по каплям наносили на растворы CHP, CHSP и CHAP NP, и изменение тепла измеряли с помощью ITC (VP-ITC, Microcal, Нортгемптон, Массачусетс, США). 0,9 мМ HSA вводили в 0,01 мМ клетки для титрования CHP, CHSP и CHAP NP для 20-кратного титрования. Первая капля - 2 мкл, время реакции - 180 с; количество оставшихся капель составляло 10 мкл на каплю, время реакции составляло 210 с, а температуру устанавливали на уровне 25 ° C. Термодинамические параметры и кривые соединений были получены при 28-кратном титровании.

Флуоресцентная спектроскопия

HSA и CHP NPs смешивали при молекулярном соотношении HSA к CHP 3,6:1 для получения смесей CHP-HSA, CHSP-HSA и CHAP-HSA. Полученные смеси помещали в пробирки ЕР объемом 2 мл и встряхивали при 20 об / мин при 25 ° C в течение 24 ч. Спектры флуоресценции и интенсивность флуоресценции (FI) свободного HSA и NP-связанного HSA регистрировали с помощью флуоресцентной спектрофотометрии (Shimadzu RF-4500, Япония). Хромофор триптофана в молекуле HSA возбуждали на длине волны 280 нм, а спектры испускания регистрировали при длине волны 290-450 нм. Ширина щелей возбуждения и излучения составляла 5 и 12 нм.

Семь растворов НЧ различной концентрации смешивали с раствором HSA. Смешанные растворы переносили в пробирки EP на 2 мл на 9 ч реакции. Полученные образцы собирали для измерения спектров флуоресценции при длине волны 290–450 нм. Спектры флуоресценции чистого раствора HSA использовали в качестве эталона для определения констант связывания согласно анализу Штерна-Фольмера. Данные по тушению флуоресценции были проанализированы с использованием улучшенного уравнения Штерна – Фольмера [34]:

где K _q - константа гашения Штерна – Фольмера, F ₀ и F - интенсивности флуоресценции при 342 нм в отсутствие и в присутствии тушителя, и [ Q ] - концентрация тушителя.

Анализ кругового дихроизма

Комплексы CHP-HSA получали двумя разными способами. Первый (комплекс I) был получен простым смешиванием растворов HSA и CHP. Второй (комплекс II) выдерживали в пробирках ЕР объемом 2 мл, которые устанавливали на качалке со скоростью 20 об / мин на 12 ч при 25 ° C. Спектры кругового дихроизма (КД) для свободного ЧСА и НЧ, добавленных к белку, регистрировали при длине волны 200–250 нм с помощью спектрометра КД (JASCO J-810, Япония) при 37 ° С с кюветной ячейкой 0,1 см. Концентрация HSA составляла 1,0 мг / мл во всех образцах. Относительное содержание α-спирали в HSA рассчитывали следующим образом [35]:

где θ ₂₀₈ - эллиптичность среднего остатка (град см ⁻² дмол ⁻¹ ) при 208 нм, θ эллиптичность, M молекулярная масса HSA, C - концентрация HSA (мг / мл), л - длина ячейки кюветы (см), а N _r количество аминокислот в молекуле HSA.

Высвобождение лекарства in vitro

НЧ, нагруженные митоксантроном (МТО), получали методом диализа [36]. Стандартная кривая для митоксантрона была получена с помощью УФ-спектрофотометрии. Загрузка лекарственного средства и эффективность инкапсуляции рассчитывались, как описано [33]. Высвобождение МТО изучали in vitro путем диализа в физиологическом растворе с фосфатным буфером. Вкратце, раствор НЧ, нагруженных МТО (2 мг / мл), помещали в вязкую диализную трубку и подвергали диализу против высвобождающей среды при 37 ° C в шейкере с воздушной баней при 50 об / мин. В заранее определенное время собирали высвобождающую среду и добавляли свежую высвобождающую среду. Высвободившееся количество МТО определяли УФ-спектрофотометрией (UV-384 plus, Molecular Devices, США) при 608 нм. Накопленный процент выпуска ( Q %) рассчитывали, как описано ранее [37]. Определенное количество раствора HSA (0,1 мг / мл) было добавлено в диализную трубку для определения высвобождения лекарственного средства трех типов НЧ.

Результаты

Характеристика полимеров CHP, CHSP и CHAP

FTIR-спектры

На рис. 2 показаны спектры FTIR для CHP, CHSP и CHAP. Данные для спектров ГПК:1731 см ^-1 (–C =пик валентных колебаний O) и 1161 см ⁻¹ (–C =пик валентных колебаний O). Этот результат демонстрирует образование сложноэфирных связей на пуллулане, что указывает на успешный синтез ГПК.

FTIR-спектры CHP (a), CHAP (b) и CHSP (c)

По сравнению со спектрами CHP данные для спектров CHAP составили 1648 см ^-1 (–C =пик поглощения колебаний O), 1734 см ⁻¹ (–C =пик поглощения колебаний O), 1539 см ⁻¹ (Пик изгибных колебаний –N – H) и 3742 см ⁻¹ (–NH ₂ пик растягивающих колебаний). Судя по этим характерным пикам, на КГП присутствуют амидные связи, и СНАР был успешно синтезирован реакцией этерификации.

По сравнению со спектрами ГПК данные для спектров ГПК составили 1710 см ^-1 (–C =пик валентных колебаний O), 1158 см ⁻¹ (–C =пик валентных колебаний O), 1560 см ⁻¹ (двойной –C =O пик вибрации связи) и 1421 см ⁻¹ (Пик изгибных колебаний –O – H). Это показывает, что на ГПК были карбоксильные группы, и часть из них стала солями.

¹ H ЯМР

На рисунке 3 показан ¹ Спектры ЯМР 1Н для CHP, CHSP и CHAP. Всего от 0 до 2,40 м.д. относились к водородному сигналу холестерина, что свидетельствует об успешном синтезе ГПК. Характерные пики ДМСО-d 6 и метилен (–CH ₂ Канал ₂ -) показал сигналы при 2,49 и 2,53 м.д. соответственно. По сравнению с CHP, CHAP показал сигналы при 8–9 м.д., которые принадлежали аминогруппе, и доказали, что этилендиамин был привит на CHP. Степень замещения холестерина на 100 единиц глюкозы в КГП может быть рассчитана по отношению протонов метилена к протонам сахара по следующему уравнению [38]:

¹ Спектры HNMR для НЧ CHP (a), CHSP (b) и CHAP (c)

где A _δ2,53 - площадь спектра под характеристическим пиком поглощения метилена (водорода), а A _δ4,74 и A _δ5.01 представляют собой площадь спектра под характеристическими пиками поглощения для гликозидных связей альфа-1,6 и альфа-1,4 соответственно.

Из ¹ Спектры ЯМР 1Н в КГП, степень замещения холестерина сукцинатом (ХС) составила 4,50%. Для НЧ ЧСП метиленовые группы (–CH ₂ Канал ₂ -) включает два аспекта:янтарный ангидрид и CHS. Степень замещения метиленовых групп составила 12,34% (–CH ₂ Канал ₂ -) и 7,84% для карбоксильных групп. Для НЧ CHAP метиленовые группы (–CH ₂ Канал ₂ -) включали два аспекта:этилендиамин и CHS. Степень замещения метиленовых групп составляла 18,6% (–CH ₂ Канал ₂ -) и 14,1% для аминогрупп.

Свойства NP, CHP, CHSP и CHAP

Амфифильные полимеры могут быть самоорганизованы путем диализа с образованием НЧ ядро-оболочка с гидрофильной оболочкой и гидрофобным ядром, которые могут быть загружены противораковыми лекарствами с образованием НЧ, нагруженных лекарствами. Свойства НЧ, такие как поверхностный заряд и размер, играли жизненно важную роль в эффективности лечения в качестве носителя лекарственного средства [39, 40]. Распределение по размерам и дзета-потенциал НЧ CHP, CHSP и CHAP, измеренные с помощью DLS, представлены на рис. 4. Средний размер НЧ составлял 73,1, 116,9 и 156,9 нм для CHP, CHAP и CHSP, соответственно. Дзета-потенциал составлял -0,698, + 12,9 и -15,4 мВ соответственно (Таблица 1).

Дзета-потенциал ( a ) и распределение по размерам ( b ) ТЭЦ АЭС ( ), NPs CHAP ( ) и НП CHSP ( )

Для НЧ пуллулана с той же гидрофобной группой размер был больше для отрицательно заряженного CHSP и положительно заряженного CHAP, чем для нейтральных НЧ CHP. Таким образом, заряженная группа препятствует самосборке НЧ, образуя НЧ большего размера с рыхлой структурой в водном растворе. Дзета-потенциалы НЧ КГП, НЧ СНАР и ЧСП составляли -0,698 мВ, + 12,9 мВ и -15,4 мВ, соответственно. Таким образом, амино- и карбоксильные группы в полимере могут создавать НЧ с разными поверхностными зарядами и, таким образом, изменять поверхностные свойства.

Термодинамический анализ

Термодинамический анализ выполняли с использованием ИТК с титрованием ЧСА до растворов НЧР, CHSP и CHAP. При ЧСА-титровании до раствора НЧ пуллулана с разными зарядами мы определили изменения тепла, уравновешивая свойства связи трех типов материалов, связи и количество соединений. Исходный спектр термометра изотермического титрования отражает изменение тепла. Восходящий пик указывает на реакцию выделения тепла, а пик вниз указывает на реакцию поглощения тепла [41, 42]. При титровании НЧ CHP, CHAP и CHSP с помощью HSA выделяемое сочетание тепла постепенно уменьшалось со временем (рис. 5). В целом, 26 капель раствора HSA титровали в раствор НЧ ГПК, и пики спектра были восходящими, что указывает на экзотермический характер реакции. То же явление наблюдалось при титровании раствора HSA до раствора CHSP NP. Однако, когда раствор HSA был титрован до раствора CHAP NP, пики спектра для первых четырех капель были восходящими, тогда как после пятой капли пики повернулись вниз, указывая на эндотермическую реакцию. Поглощение ЧСА НЧ ГПК и ЦГШП было экзотермическим, поэтому реакция была спонтанной. Поглощение HSA НЧ CHAP было частично эндотермическим и частично экзотермическим, что может быть связано с положительным зарядом CHAP.

Данные калориметрии изотермического титрования для титрования HSA в a ТЭЦ, б CHSP и c CHAP NPs при 25 ° C. Концентрация NP в ячейке (250 мкл) составляла 12 мкМ, а концентрация белка в шприце составляла 230 мкМ. Верхние графики показывают необработанные данные, а нижние графики показывают интегрированную теплоту

Значение энтальпии отражает тепло, выделяемое комбинацией HSA и NP. Изменения энтальпии НЧ ГПК, ЦГШП и ЦГАП под действием ЧСА составили 42,827, 80,3712 и 22,3951 кДж / моль соответственно (таблица 2). В сочетании с изменением энтальпии, экзотермической реакцией, химической структурой амфифильных наночастиц и отрицательным зарядом HSA гидрофобное взаимодействие может в основном управлять взаимодействием HSA с CHP и CHSP NP. Следует отметить, что при HSA-титровании CHAP тепло имеет отрицательное значение. Молекулы HSA содержат гидрофобный карман, который может быть объединен с гидрофобным центром NP [43], поэтому взаимодействие, запускаемое первыми четырьмя каплями HSA и CHAP, в первую очередь осуществляется за счет гидрофобных сил. Хотя HSA заряжен отрицательно, а CHAP заряжен положительно, начиная с пятой капли, существует также сила заряда между HSA и CHAP из-за эндотермического характера реакции.

Величина изменения энтропии может отражать сложность реакции между HSA и NP. Энтропии НЧ HSA и CHP, CHSP и CHAP составляли 0,251, 2,775 и 0,201 кДж / моль К соответственно (таблица 2), поэтому НЧ CHP и CHAP легче связываются с HSA, а НЧ CHSP труднее связывать. привязать к HSA.

Охват HSA и CHP, CHSP и CHAP NP составил 1,17, 0,404 и 0,845 соответственно. Концентрация НЧ рассчитывается на основе концентрации полимера, а не количества частиц. Мы не знаем, сколько отдельных полимерных частиц содержат одну НЧ, поэтому мы не можем точно определить, сколько каждой НЧ адсорбируется HSA, но, основываясь на величине покрытия, мы можем сделать вывод, что НЧ КГП имеют самую высокую адсорбцию HSA.

В предыдущих экспериментах мы показали, что значение сродства K _A , отражает силу силы связывания между НЧ и HSA [32]. Чем сильнее гидрофобность КГП НЧ, тем сильнее сродство [44]. Константа связывания HSA и CHP составляла 27,7 × 10 ⁴ . M ^-1 , то для HSA и CHSP было 1,41 × 10 ⁴ M ^-1 , а HSA и CHAP - 412 × 10 ⁴ M ^-1 . Таким образом, комбинация HSA и положительно заряженного CHAP была самой сильной, за ней следовали нейтрально заряженный CHP и отрицательно заряженный CHSP. Самая сильная комбинация HSA и CHAP может быть связана с гидрофобной силой, взаимным притяжением силы заряда и, вероятно, взаимоисключающим зарядом между HSA и CHSP.

Флуоресцентная спектроскопия

С помощью спектров флуоресценции мы изучили взаимодействие между HSA и тремя НЧ с разными поверхностными зарядами. HSA содержит 585 аминокислотных остатков, только один остаток Trp на уровне 214 (Trp214), и его спектр флуоресценции доминирует в УФ-области. Когда другие молекулы взаимодействуют с HSA, спектр флуоресценции Trp может изменяться в зависимости от взаимодействия между HSA и другими молекулами. Когда три НЧ были смешаны с HSA, максимальный пик излучения спектра флуоресценции HSA не претерпевал химического сдвига; только интенсивность была ослаблена до некоторой степени (рис. 6А). Максимальный пик эмиссии HSA наблюдался при сочетании HSA с НЧ CHAP.

А Спектры флуоресценции HSA (1,5 × 10 ^{- 5} моль / л) без (а) и с (б) НЧ ЦГП, (в) и (г) НЧ ЦАП с одинаковой концентрацией (4,2 × 10 ^{- 6} Молл). Б Интенсивность эмиссии HSA с НЧ CHSP, CHP и CHAP при 343 нм с течением времени

Экспериментальные исследования показали, что объединение НЧ HSA и пуллулана представляет собой сложный процесс [45]. Мы добавили три НЧ в раствор ЧСА и обнаружили, что интенсивность флуоресценции трех комплексов НЧ-ЧСА постепенно снижалась (рис. 6В). Равновесие было достигнуто для HSA-CHSP при 556,3 нм через 12 часов, для CHP-HSA при 534,3 нм через 10 часов и для CHAP-HSA при 512,3 нм через 8 часов. Время, необходимое для уравновешивания интенсивности флуоресценции различных комплексов NP-HSA, связано с зарядом, переносимым NP. Наибольшее время, необходимое для достижения равновесия, наблюдалось на отрицательно заряженном CHSP-HSA, а затем на незаряженном CHP-HSA.

Быстрое снижение начальной интенсивности флуоресценции трех комплексов NP-HSA (показано на рис. 6A) происходит из-за быстрой адсорбции NPs и HSA. Последующая интенсивность флуоресценции медленно снижается до постоянного состояния, поскольку взаимодействие НЧ с HSA представляет собой медленный процесс объединения. Постоянная интенсивность флуоресценции отражает состояние насыщения комплексообразования. Взаимодействие между тремя разными заряженными НЧ и HSA претерпевает процесс быстрой быстрой рекомбинации и более поздний процесс медленной рекомбинации. Комбинация отрицательно заряженного HSA с отрицательно заряженным CHSP требовала более длительного времени для достижения комплексного насыщения по сравнению с незаряженным CHP. Отрицательно заряженный HSA в сочетании с положительно заряженным CHAP требовал кратчайшего времени для достижения комплексного насыщения.

На рис. 7A – C показаны спектры HSA в сочетании с различными концентрациями CHSP, CHP и CHAP NP с образованием комплексов NP-HSA. С увеличением концентрации НЧ пик максимального поглощения комплекса НЧ-ЧСА уменьшался, показывая обратную корреляцию.

Спектры флуоресценции ЧСА (1,5 × 10 ^{- 5} моль / л) с CHSP ( A ), ТЭЦ ( B ) и CHAP ( C ) при различных концентрациях (а) 0, (б) 2,07 × 10 ⁻⁷ , (в) 3.31 × 10 ⁻⁷ , (г) 4.14 × 10 ⁻⁷ , (д) ​​8,28 × 10 ⁻⁷ , (е) 20,7 × 10 ⁻⁷ , (ж) 33,1 × 10 ⁻⁷ , а (з) 41.4 × 10 ⁻⁷ Молл. D Графики ( n =7) для F ₀ / ( F ₀ - F) против 1 / [ Q ], Q - концентрация CHSP (- ◆ -), CHP (- ■ -) и CHAP (- ▲ -), соответственно

Положительно заряженный CHAP-HSA показал самое короткое время для достижения равновесия.

Мы использовали модифицированное уравнение Штерна – Фольмера для анализа данных тушения флуоресценции:

где f _а - доля контакта флуоресцентного вещества с гасителем, K _q - константа закалки Штерна – Фольмера, F ₀ - интенсивность флуоресценции при 342 нм без гасителя, F - интенсивность флуоресценции при 342 нм с гасителем, а [ Q ] - концентрация тушителя.

Из функционального образа F ₀ / ( F ₀ - F ) пара 1 / [ Q ], we can obtain the values of f _а and K _q from the slope and the intercept (Fig. 7D). Assuming that the observed fluorescence intensity changes mainly due to the interaction between NPs and HSA, the quenching constant can be seen as a binding constant for the formation of complexes. The binding constants for HSA and CHSP, CHP, and CHAP molecules were 2.02, 2.99, 4.72 × 10 ⁵ M ⁻¹ , соответственно. In the previous study, we discussed the interaction between HSA and CHP NPs with different hydrophobicity substitutions [30]. The hydrophobic interaction between HSA molecules and CHP cholesterol played an important role in the formation of CHP–HSA. The greater the hydrophobic substitution of CHP, the greater the binding constant of CHP and HSA.

In the present study, we found that the value of the binding constant (K _b ) is related to the electrical properties of the NP. A surface with a positive charge, such as CHAP, has the largest K _b , and a surface without a charge, such as CHP, has the second largest K _b . The K _b for CHSP, with a negative charge, was the lowest. Therefore, in addition to the hydrophobic interaction between NPs and HSA, the electrostatic interaction between them also plays an essential part in the formation of NP–HSA complexes.

In addition, the f _а values for CHSP, CHP, and CHAP NPs were 0.269, 0.288, 0.38, respectively, so part of the Trp residue was involved in this reaction. Furthermore, the amount of HSA was too much at a given NP/HSA concentration, so free HSA molecules presented in the reaction system.

CD Spectrum Analysis

Figure 8A shows the CD spectra (a) free HSA, (b) CHSP–HSA, (c) CHAP–HSA, and (d) CHP–HSA in solution at 25 °C. The samples were complex I. There are two negative bands at 208 and 222 nm of the UV region in HSA spectra, which are the characteristic peaks of the α -helical structure. The α -helical content of free HSA was 55%. At the beginning of the complex, with the recombination of HSA and CHSP, CHAP, and CHP NPs, the α -helical content of HSA was reduced to 52.0%, 48.57%, and 48.0%, respectively.

А CD spectra for (a) free HSA, (b) CHSP–HSA, (c) CHAP–HSA, and (d) CHP–HSA in solution at 25 °C. The samples were complex I. B CD spectra for (a) free HSA, (b) CHSP–HSA, (c) CHAP–HSA, and (d) CHP–HSA in solution at 25 °C. The samples were complex II. C Ellipticity at 208 nm for HSA interacting with CHSP (–▲–), CHAP (–●–) and CHP (–■–) over time

Figure 8C shows that the ellipticity changes of the three samples at 208 nm over time. The ellipticity of HSA combined with CHAP and CHP NPs increased from 0 to 12 h and leveled off at 12 h, but that of HSA with CHSP NPs increased faster, i.e., the ellipticity increased from 0 to 9 h and leveled off at 9 h. Therefore, the ellipticity of the three samples gradually increased over time and the α-helical content gradually decreased; when the ellipticity maintained constant, the recombination of the sample and HSA was completed.

Figure 8C illustrates that the fastest surface absorption rate was presented on the combination of CHSP and HSA. The size, charge, and hydrophobicity of NPs can influence the migration rate of HSA to the center of NPs. The surface of CHP is not charged, the surface of CHSP is negatively charged, and the surface of CHAP is positively charged. Owing to the presence of the negative-charge mutual exclusion between CHSP and HSA, the resistance of HSA migrating to the CHSP NP center becomes larger. The traction of NPs on HSA is driven by the hydrophobic interaction forces. The traction of the three NPs on HSA is identical, so the lowest velocity of HSA migrating to the center of NPs was observed on the combination of HSA and CHSP NPs. Because the particle size is in the order of CHSP> CHAP> CHP, the particle density displays a reverse order, i.e., CHSP

The ITC results show that the amount of HSA migrating toward the center of CHSP NPs is the smallest but with the fastest speed compared with other types of NPs. Table 3 shows that the α-helix content of HSA migrating toward the center of CHP NPs was the lowest. The more the secondary structure of HSA was damaged, the faster the HSA migrated toward the center. The fastest speed was observed on HSA migrating to the center of CHSP NPs (Fig. 8C).

Figure 8B shows CD spectra for (a) free HSA, (b) CHSP–HSA, (c) CHAP–HSA, and (d) CHP–HSA in solution at 25 °C. The samples were complex II. After the complexation is completed, the α -helical content of HSA recombined with CHSP, CHAP, and CHP was reduced to 46.27%, 44.55%, and 42.91%, respectively (Table 3). With the increase in interaction time, the secondary structure of HSA was changed and the α -helical content was reduced during the process of complexation with NPs.

Drug Release

We measured the drug release rate of MTO with the three kinds of drug-loaded NPs and drug-loaded NP–HSA complexes. The drug release for free MTO was about 99.8% at 4 h (Fig. 9). The release rate in 48 h for CHP, CHAP, and CHSP NPs was 53.68%, 58.54%, and 63.24%, respectively. The drug release from all NPs was fast in the first 8 h, which was a burst release process, and the drug release remained stable after 12 h, which was a sustained release process. In vitro drug release from NPs is not affected by gastrointestinal pH and enzymes, and the dissolution of nanomaterials results in little drug release. The release is mainly determined by dissolution and diffusion [46]. The 48-h drug release rate was in the order of CHSP> CHAP> CHP, corresponding to the size of NPs. The fastest release rate was found on CHSP, which was negatively charged with the largest size. The second fast drug release rate was found on which was positively charged with the size smaller than CHSP. CHP was electrically neutral, and its drug release rate was minimal. Hence, the polymer surface groups involved in the formation of NPs affect the size of NPs and ultimately the drug release of NPs.

Mitoxantrone (MTO) release of pullulan NPs in phosphate-buffered saline (PBS) at 37 °C in vitro (□:free mitoxantrone, ○:CHP, △:CHAP, ▽:CHSP, ◁:CHAP–HSA,◇:CHP–HSA, ▷:CHSP–HSA)

The drug release rate from the combinations of HSA and CHAP, CHP, and CHSP in 48 h was 32.45%, 33.86%, and 35.76%, respectively. After the combination of NPs and HSA, the drug release in 48 h was significantly decreased as compared with HSA-free NPs, which was mainly attributed to the resistive effect and adsorption effect of HSA. At 48 h, the drug release of the compounds was in the order of CHSP–HSA> CHP–HSA> CHAP–HSA, while the drug release of HSA-free NPs was in the order of CHSP> CHAP> CHP. Although NP–HSA compounds showed significantly slow drug release, the total release of CHP-HSA decreased by 21.23% in 48 h, whereas the total release of CHAP-HSA decreased by 25.68% and that of CHSP-HSA by 28.48%. The drug release of the NPs is related to the size of the NPs and the polymer hydrophobic groups on NP surface. The adsorption of HSA can lead to significant slowdown in drug release, which is related to the hydrophobicity of NPs and also to the surface charge of NPs [46]. The adsorption of HSA is closely related to the size of the NPs and the degree of substitution of the hydrophobic groups of the polymer during the self-assembly process. Nevertheless, the drug release of the NPs is ultimately determined by the properties of the NP itself.

Discussion

As shown in Fig. 10, the formation of the NP–HSA complex is driven by a hydrophobic force between cholesterol groups of the particle core and the aromatic amino acid of the hydrophobic domain of HSA. After mixing, HSA interacts with the surface cholesterol unit and is rapidly adsorbed to the NP surface. Then, the adsorbed HSA on the NP surface is processed because of the hydrophobic forces derived from the cholesteric unit in the particle core. When overcoming the steric hindrance of polysaccharide chains in the NP shell, the adsorbed HSA gradually migrates to the core. After the hydrophobic interaction and resistance of the hydrophilic polysaccharide chain are balanced, the HSA molecule enters the particle core to become hydrophobically bound to cholesterol groups to form the NP–HSA complex.

Adsorption of HSA to NPs

For CHAP and CHSP NPs, the recombination of HSA is a complex process also subjected to the charge interaction with HSA under the traction of the hydrophobic driving force. The binding constants of the three kinds of NPs with the same hydrophobic substitution and different surface charge were in the order of CHAP> CHP> CHSP. The electrical properties also play a major part in the formation of NP–HSA. In this process, the formation of the CHSP–HSA complex was blocked by the structure of the NP shell and the repulsive force between the negative charges, which led to their loose connection. During the rapid adsorption and slow recombination, the degree of spiraling of HSA is lower for CHSP NPs than CHP NPs and CHAP NPs. Therefore, the surface charge of NPs not only changes the nature of the particles themselves but also affects the protein complex.

In the current study, we investigated the effect of NP surface charge on the interaction between NPs and proteins (Fig. 10). Three different charges of pullulan NPs with HSA adsorption still showed rapid adsorption and slow recombination. The number of HSA molecules with positively charged CHAP complex was the most, including rapid adsorption of NP–HSA by hydrophobic forces, HSA molecule migration to the center, and the HSA molecules adsorbed on the surface of NPs by charge action. CHP- and CHSP-adsorbed HSA molecules were mainly distributed in the hydrophobic center of NPs, with CHSP adsorbing fewer HSA molecules. The adsorbed number of HSA molecules is related to the hydrophobicity of NPs. The greater the degree of substitution of hydrophobicity, the more HSA is adsorbed [41]. The cholesterol substitutions of the three NPs were the same, and the number of HSA molecules adsorbed by positively charged NPs was the highest, so the adsorption of NPs and HSA was related to the hydrophobicity and surface charge of the NPs.

The surface adsorption capacity between NPs and HSA is also related to the hydrophobicity and charge of NPs. The binding force between HSA and NPs is determined by the hydrophobicity, surface charge, size, and structure of NPs. The α-helicity was decreased most at the beginning of adsorption and the complete CHP–HSA complex. CHP NP has the smallest size and highest density. The CHP NPs migrated toward the center by the hydrophobic traction; the sugar chain of the CHP NP shell was larger to inhibit the migration toward the center. The extension of the peptide chain of HSA is larger, with the α -helix decreased the most. Although CHAP NPs have hydrophobic and charge forces, they possess relatively large size, loose structure, small resistance in the periphery, small extension of the peptide chain, and small content of the α -helix. Some HSAs remained on the surface of NPs through the charge force of adsorbing, and the α -helical content is also smaller in this part of the HSA. The α -helix content of CHAP decreased less than that of CHP, mainly due to the peptide chain extension-induced central pulling force which led to α-helix content decline. During the process of the CHSP and HSA complexation, the role of the central pulling force has a reverse direction of the charge force, thereby resulting in weakening the center of the migration force. CHSP NPs are larger than CHAP NPs, and the structure of CHAP NPs is loose. Because the adsorbed number of HSA on CHAP is higher than that on CHSP, the decrease of α -helicity in CHSP is less than that in CHAP NPs. Therefore, the interaction between NPs and HSA and the decrease in α -helicity are all related to the size, density, hydrophobicity of substitution, surface charge of the NPs, and number of HSA connections.

After the NPs enter into the blood, protein adsorption affects the functions of NPs, such as the slow and controlled drug release, the travel from the blood circulation passing through the vascular barrier, targeting tissue, and entering cells. NPs interact with the HSA in the body and affect the in vivo behavior of NPs. The number of adsorbed proteins is closely related to the properties of the NPs. HSA adsorbs NPs, which affects the distribution in organs and removal of NPs, thereby altering the concentration of the drug in the body and the efficacy of the drug.

Finally, the properties of NPs, such as size, hydrophobicity, and surface charge, affect the drug release of NPs in vivo. We can design specific materials to perform specific functions with specific protein adsorption.

Conclusions

In this study, three kinds of nano-drug carriers were constructed, CHP, CHSP, and CHAP. The size, charge, drug loading properties of NPs, interaction between NPs and HSA, and drug release were all closely related to charge amount and charge type of nanomaterials. With the same degree of substitution of hydrophobicity, CHAP NPs with larger amino substitutions were the largest, CHSP NPs the second largest, and CHP NPs the smallest. The size and surface charge of the NPs were essential to the coverage of HSA, the binding constant, and the slow drug release. The positively charged CHAP binding constant was the strongest, showing the fastest drug release, and CHP NPs had the highest coverage. The combination of HSA further retarded the drug release of NPs. CHAP NPs adsorbed HSA had the slowest drug release rate.

Сокращения

CH:

Cholesteric hydrophobically

CHAP:

CH-modified animated pullulan

CHP:

Cholesteric hydrophobically (CH) modified pullulan

CHSP:

CH-modified carboxylated pullulan

DMSO:

Dehydrated dimethyl sulfoxide

HSA:

Human serum albumin

K _b :

The binding constant

MTO:

Mitoxantrone

NP:

Nanoparticle