Датчик на основе оксида титана обеспечивает раннюю нанодетекцию рака головы и шеи

Аннотация

Рак головы и шеи — гетерогенное заболевание, возникающее в плоских клетках, выстилающих гортань (голосовой аппарат), ротовую полость, глотку (фаринкс), носовую полость и слюнные железы. Поздняя диагностика значительно снижает выживаемость пациентов, что делает обязательной раннюю идентификацию с подходящим биомаркером. Антиген плоскоклеточного рака (SCC-Ag) — циркулирующий сывороточный онкомаркер, уровень которого повышен у пациентов с раком головы и шеи и сильно коррелирует с объемом опухоли. В настоящем исследовании детектировали и количественно определяли уровень SCC-Ag на модифицированном оксидом титана (TiO₂) интердигитированном электроде (IDE) с помощью антител к SCC-Ag. Детекция SCC-Ag осуществлялась на уровне 100 фМ, а при конъюгации антител с золотыми нанозвездами чувствительность улучшилась до 10 фМ, что представляет десятикратное улучшение. Интересно, что это повышение чувствительности на 1000 раз превосходит другие субстраты. Более того, анализ специфичности с двумя контрольными белками показал, что антитело распознает только SCC-Ag, указывая на специфическую детекцию на сенсирующей поверхности IDE-TiO₂.

Введение

Рак головы и шеи проявляется в аномальном росте клеток в области головы и шеи и широко встречается. Он возникает в горле, рту, слизистой оболочке полости рта, слюнных железах и носовой полости; является шестым по частоте раком во всем мире и затрагивает более 644 000 человек ежегодно. Большинство пациентов диагностируются на поздних стадиях, что сильно влияет на выживаемость. Ранняя идентификация обязательна для улучшения выживаемости и качества жизни. Сывороточные онкомаркеры используются для диагностики и управления лечением. Плоские клетки выделяют преобладающий антиген плоскоклеточного рака (SCC-Ag), его повышенный уровень наблюдается у онкобольных и SCC-Ag является перспективным маркером для плоскоклеточных раков (гинекологические, легкие, пищевод, анальные). Для рака головы и шеи более высокие уровни SCC-Ag ассоциированы с метастазами, рецидивами и смертностью. Исследователи обнаружили, что сывороточный SCC-Ag находится на значительном уровне риска для раков гипофаринкса, полости рта и гортани. Кроме того, существует корреляция между уровнем SCC-Ag и объемом опухоли. Разумно количественно определять уровень SCC-Ag для выявления состояния рака головы и шеи с целью раннего лечения. Текущее исследование фокусировалось на детекции SCC-Ag на низком уровне с использованием наночастиц на интердигитированном электроде (IDE) с антителом к SCC-Ag.

IDE — электрохимический биосенсор с перспективными особенностями: низкая стоимость, портативность, чувствительность, широкое применение в экологическом мониторинге и медицинской диагностике. Улучшение электрических свойств сенсирующей поверхности повышает детекцию биомолекул. Наноматериалы широко применяются в биосенсорах для усиления биомолекулярной детекции. Они малы по размеру, имеют большую площадь поверхности, хорошую термическую и электрическую проводимость, биосовместимость и огромный потенциал в биосенсорах. Наноматериалы применяются двумя способами: функционализация поверхности и конъюгация аналита/мишени для улучшения детекции. Золото — устоявшийся наноматериал, применяемый в различных сенсорах: поверхностный плазмонный резонанс, волноводные сенсоры, электрохимические сенсоры, колориметрия. Кроме того, серебро, графен, медь и титановые наноматериалы применяются в биомедицине. Как экологически чистый полупроводник и дешевый материал, оксид титана (TiO₂) с широкой запрещенной зоной используется для модификации поверхности IDE для детекции SCC-Aг. Благодаря высоким электрическим и оптическим свойствам TiO₂ широко используется для суперконденсаторов, фотоctalизатора и фотоэлектрического преобразования. Более того, его гидрофильная природа и большая площадь поверхности подходят для модификации поверхности и помогают детектировать биомолекулы на более низком уровне. В этом исследовании TiO₂ наносили на сенсирующую поверхность IDE для усиления электрического тока при взаимодействии биомолекул. Для улучшения детекции SCC-Ag антитело конъюгировали с золотой нанозвездой (GNS-антитело) и иммобилизовали на поверхности, покрытой TiO₂. Доказано, что золотые наноматериалы, конъюгированные с биомолекулами, демонстрируют более высокую стабильность и обеспечивают правильно ориентированные иммобилизованные биомолекулы, что улучшает предел детекции. Кроме того, на одну золотую частицу можно иммобилизовать больше биомолекул, что привлекает более высокие уровни мишени. В этой работе использовали два наноматериала: TiO₂ (для модификации поверхности) и GNS (для конъюгации антител) для улучшения детекции SCC-Ag на сенсирующей поверхности IDE. Применение GNS ожидается усилить характеристики сенсора за счет большей площади поверхности для захвата большего числа антител.

Материалы и методы

Реактивы и биомолекулы

SCC-антиген (гликопротеин с изоформами 45–55 кДа) приобретен в Randox Life Sciences (Малайзия). Противо-SCC антитело закуплено в Next Gene (Малайзия). (3-Аминопропил)триэтоксисилан (APTES), этаноламин, альбумин (основной белок крови 45 мг/мл; 50–70% белка крови, мол. масса 66,5 кДа), фосфатно-буферный раствор (PBS; pH 7,4) и изопропоксид титана (IV) приобретены в Sigma Aldrich (США). Серпин (распространенный ингибитор сериновых протеаз, мол. масса 40–50 кДа) из Sino Biological (Китай). Золотые нанозвезды синтезировали по методу Shan et al. Все реагенты и химикаты хранили по рекомендациям производителя.

Фабрикация интердигитированных электродов

Базовый дизайн и фабрикация IDE следовали ранее опубликованному методу. Изначально кремниевый пластинку очищали стандартными растворами, а алюминиевый IDE-электрод осаждали традиционным мокрым травлением на кремниевой пластинке. Затем положительный фоторезист наносили на поверхность пластинки, затем проводили термическое окисление. Осаждение алюминия выполняли фотолитографической техникой в три этапа: шаг 1 — 1200 об/мин в течение 10 с, шаг 2 — 3500 об/мин в течение 20 с, затем 500 об/мин в течение 10 с. Затем ультрафиолетовое излучение экспонировало сенсирующую поверхность для переноса структуры IDE на образец. После этого разработчик RD-6 использовали 15 с для проведения процесса разработки. Фоторезист удаляли для устранения неэкспонированных областей. Разработанный образец выдерживали при 100 °C для удаления лишней влаги и улучшения адгезии между слоем SiO₂ и алюминием. Наконец, 23 с алюминиевым травленцем удаляли неэкспонированные области и очищали ацетоном. Финальная поверхность модифицировали TiO₂ для детекции SCC-Ag. Фабрицированную поверхность IDE наблюдали под высокой микроскопией и 3D нанопрофилером. Изображения захватывали ассоциированной системой при ×50 увеличении.

Покрытие TiO₂ на сенсирующей поверхности IDE

На фабрицированной поверхности IDE наносили раствор TiO₂, используя изопропоксид титана (IV) как предшественник. Этанол смешивали с изопропоксидом титана и интенсивно перемешивали 5 мин. Затем под мешанием добавляли стабилизатор (100 мкл уксусного кислоты) и нагревали на горячей пластине при 85 °C. Молярное соотношение фиксировали как 9:1:0,1 (этанол:TIP:уксусная кислота). После 3 ч перемешивания получали прозрачный раствор. После 24-часового старения раствор наносили на подложки диоксида кремния (SiO₂) центрифугированием со скоростью 2000 об/мин. После покрытия поверхность сушили 15 мин при 175 °C и отжигали 1 ч при 450 °C. Пленка TiO₂ получает достаточную толщину после нанесения трех слоев.

Подготовка GNS-конъюгированного анти-SCC-Ag

Антитело SCC-Ag иммобилизовали на GNS с помощью линкера 16-меркаптундекановой кислоты (16-MDA). Изначально 5 мМ разбавленного 16-MDA смешивали с 100 мкл GNS и выдерживали при комнатной температуре (RT) 30 мин. Связанный 16-MDA с GNS удаляли центрифугированием при 13 000×g, 5 мин. Собранный золотой пеллет активировали EDC (400 мМ) и NHS (50 мМ) в соотношении 1:1 инкубацией 15 мин при RT. Несвязанные EDC и NHS удаляли центрифугированием при 13 000×g, 5 мин. Пеллет с активированными GNS собиравли для конъюгации антител. Затем 200 нМ антитела SCC-Ag смешивали с EDC-NHS-активированными GNS и выдерживали при RT 1 ч. Наконец, несвязанные антитела удаляли центрифугированием при 13 000×g, 5 мин. Конъюгированное с GNS антитело хранили при 4 °C для дальнейшего использования, конъюгация подтверждалась UV-Vis спектроскопией. Сканирование проводили в области 480–560 нм, пиковые максимумы определяли.

Иммобилизация GNS-антитела на поверхности TiO₂-IDE

Покрытую TiO₂ поверхность IDE дальше модифицировали в аминовую APTES для иммобилизации GNS-антитела. 3% APTES (разбавлен в 30% этаноле) наносили на поверхность TiO₂ и выдерживали 3 ч при RT. Поверхность промывали 30% этанолом трижды для удаления несвязанного APTES. Для иммобилизации антител следовали этапу активации, описанному выше. Антитело или GNS-антитело наносили на поверхности и ждали 1 ч для завершения иммобилизации. Наконец, поверхность промывали пять раз буфером PBS для полного удаления несвязанных антител. Эти модифицированные антителом или GNS-антелом поверхности использовали для детекции SCC-Ag и сравнения. GNS-антител-модифицированную TiO₂ поверхность анализировали атомно-силовой микроскопией (AFM), полевой эмиссионной трансляционной электронной микроскопией (FETEM) и рентгеновским энергетически-дисперсионным анализом (EDX) как описано ранее. AFM наблюдения в масштабе 5 мкм, SEM — в масштабе 100 нм при 15 кВ. Наличие элементов определяли EDX.

Детекция SCC-антигена на поверхностях антитела/золотой нанозвезды антитела

Для детекции SCC-Ag поверхности, модифицированные антителом или GNS-антелом на TiO₂-IDE, блокировали 1 М этаноламином для маскировки свободных от антител областей и выдерживали 30 мин при RT. На заблокированной поверхности 1 нМ SCC-Ag взаимодействовал, и токовые ответы фиксировали до и после добавления SCC-Ag. Для оценки предела детекции SCC-Ag титровали от 10 фМ до 1 нМ и наносили по отдельности на поверхности, модифицированные антителом или GNS-антелом, фиксируя токовые ответы. Эксперименты проводили в трипликатах и вычисляли статистику. Для измерений использовали линейное сканирующее напряжение 0–2 В с шагом 0,01 В. Предел детекции (LOD) считался наименьшей концентрацией аналита (из калибровочной линии при низких концентрациях) против фонового сигнала (S/N = 3:1), иными словами, LOD = стандартное отклонение базовой линии + 3σ.

Секретивная детекция SCC-Ag

Для проверки селективного взаимодействия SCC-Ag с его антителом проводили контрольные эксперименты с двумя белками: серпином и альбумином. Концентрация 1 нМ этих контрольных белков наносили на поверхности, модифицированные антителом или GNS-антелом, и фиксировали изменения тока до и после взаимодействия. Эти уровни тока сравнивали с специфической детекцией SCC-Ag его антителом и GNS-антелом. Другие контрольные установки включали взаимодействие SCC-Ag с GNS в одиночку и SCC-Ag с поверхностью TiO₂-IDE, покрытой нанимате-иммунным антителом, помеченным GNS. Эксперименты проводили в трипликатах и вычисляли статистику. Для измерений использовали линейное сканирующее напряжение 0–2 В с шагом 0,01 В.

Результаты и обсуждение

Рак головы и шеи описывается как различные опухоли, развивающиеся в или вокруг носа, рта, гортани и пазух. Ранняя диагностика и лечение с подходящим биомаркером обязательны для улучшения выживаемости. SCC-Ag найден как подходящий сывороточный биомаркер; здесь эксперименты проводились для детекции и количественного определения уровня SCC-Ag на модифицированном оксидом титана интердигитированном электроде (IDE-TiO₂) с помощью его антител. TiO₂ используется здесь для улучшения токового ответа при взаимодействии биомолекул. По сравнению с другими наноматериалами, TiO₂ считается привлекательным в электрохимических сенсорах благодаря активному поведению на поверхности вдоль электродов и улучшению электроcatalyticческой активности. Более того, он дает большую стабильность поверхности, что обеспечивает воспроизводимость ответа электрода и улучшение предела детекции за счет увеличения пикового тока. Для использования этой положительной особенности в этом исследовании покрытое TiO₂ на поверхности IDE (IDE-TiO₂) улучшает токовый поток. Другой наноматериал GNS использовали для иммобилизации анти-SCC-Ag антител на поверхности IDE-TiO₂ и улучшения предела детекции. Поскольку доказано, что поверхность с иммобилизованными золотом-конъюгированными биомолекулами улучшает детекцию мишени, здесь SCC-Ag детектировали и сравнивали на поверхностях, модифицированных антителом и GNS-антелом. Как обобщается в других работах, с увеличением площади поверхности наночастицы будет усиление биомолекулярного сцепления. В этом контексте GNS имеет большую площадь по сравнению с сферическими золотыми наночастицами. Для реализации этой идеи текущий эксперимент выполнен с использованием GNS для усиления чувствительности.

Характеризация поверхности и иммобилизация GNS-антитела

Рис. 1 показывает схематческое представление детекции SCC-Ag на сенсирующей поверхности IDE-TiO₂. Как показано на рис. 1a, изначально сенсирующая поверхность IDE покрывали TiO₂, затем антитело иммобилизовывали с конъюгацией GNS или без нее. Эти антител-модифицированные поверхности использовали для детекции уровня SCC-Ag. Перед выполнением детекции конъюгацию GNS с антителом подтверждали UV-Vis спектроскопией. Профили сканирования GNS в желаемом диапазоне длин волн до и после конъюгации с антителом определяли. Четко видно, что после иммобилизации сдвиг переместился с 535 на 545 нм (рис. 1b). Этот результат подтверждает конъюгацию антител на поверхности GNS. С другой стороны, фабрицированную сенсирующую поверхность наблюдали морфологически. Рис. 2a показывает изображение высокой микроскопии, а рис. 2b — изображение от 3D нанопрофилера. Оба профиля четко показывают зазоры и электродные области, формирующие пальцы. Расположение зазоров и пальцев выглядит однородным и целым.

a Схематческое представление детекции SCC-Ag. Поверхность IDE-TiO₂ модифицирована в аминовую APTES с последующей иммобилизацией антитела или GNS-антитела. Аминовая группа от APTES реагирует с карбоксильной группой на антителе. SCC-Ag детектировался взаимодействием в антигенной области и сравнивался. b UV-Vis спектроскопия GNS. Сканирование в области 480–560 нм, пиковые максимумы ~ 530 нм. GNS с и без антител указаны стрелками

a Изображение высокой микроскопии на поверхности IDE. Изображения захвачены при ×50. b Изображение 3D нанопрофилера на поверхности IDE. Изображения захвачены при ×50. Электродные и зазорные области показаны. Зазоры отмечены звездами. Однородное расположение указывает на успешную фабрикацию. c Атомно-силовая микроскопия. AFM показывает четкое различие между TiO₂ и GNS темными и светлыми точками соответственно. d Полевой эмиссионной трансляционной электронной микроскопии. e Энергетически-дисперсионный рентгеновский анализ. Показаны найденные на поверхности элементы

Сравнение иммобилизации антитела и GNS-антитела на сенсирующих поверхностях TiO₂-IDE

SCC-Ag детектировали на поверхности TiO₂-IDE антител- или GNS-антел-иммобилизованными поверхностями. Прикрепление GNS на поверхности TiO₂ подтверждали AFM, SEM наблюдениями и EDX анализом (рис. 2c). При AFM наблюдении замечено четкое различие между TiO₂ и GNS темными и светлыми точками соответственно. Это подтверждалось SEM и EDX анализами, где наблюдались выраженные золотые и умеренные титановые пики. Эти результаты свидетельствуют о наличии GNS на поверхности TiO₂. Рис. 3 показывает процессы иммобилизации антитела и GNS-антитела на амин-модифицированных сенсирующих поверхностях IDE-TiO₂. TiO₂-модифицированная сенсирующая поверхность IDE показывает уровень тока 4,65E-12 (рис. 3a). После добавления APTES уровень тока увеличился до 5,37E-11; этот прирост указывал на модификацию поверхности в аминовую APTES. При иммобилизации антитела уровень тока изменился с 5,375E-11 на 1,05E-9. Разница в токе составила 1,04E-9 (рис. 3a). Эта иммобилизация произошла из-за химического взаимодействия аминовой группы от APTES и COOH группы в антителе. Изменения тока подтвердили связывание антитела на APTES-модифицированной поверхности. После этого оставшаяся поверхность покрывали 1 М этаноламином для уменьшения биофаулинга от неспецифического связывания биомолекул на сенсирующей поверхности. Аналогично иммобилизовывали GNS-антитело на поверхности TiO₂-IDE, и при иммобилизации GNS-антитела на APTES-модифицированной поверхности уровень тока увеличился с 4,41E-12 до 1,23E-9 (рис. 3b). Четко установлено, что когда антитело иммобилизовано на поверхности GNS, оно показывает более высокий ответ на амин-модифицированной поверхности. Это может быть связано с большим числом антител, связывающихся на поверхности одной GNS, и сильным связыванием этого комплекса на амин-модифицированной поверхности. Это связывание произошло из-за амино-терминальной группы в APTES, вытесняющей цитратные группы на GNS и химически фиксирующейся на APTES-модифицированной поверхности IDE. Известно, что детекция биомолекул на сенсирующих поверхностях главным образом зависит от двух факторов: аффинности связывания взаимодействующих молекул и правильной иммобилизации молекул на сенсирующей поверхности. Более высокая иммобилизация биомолекул на сенсирующей поверхности резко улучшает детекцию мишени на ее низком уровне. В этом исследовании GNS использовали для иммобилизации анти-SCC-Ag антител на поверхности IDE-TiO₂ для повышения шанса более высокого связывания антител, что ведет к эффективной детекции SCC-Ag.

Процессы иммобилизации на поверхностях IDE-TiO₂. a С антителом. b С GNS-антелом. Модификации поверхности начинались с 3% APTES, за которым следовала активация EDC и NHS для иммобилизации антитела; 1 М этаноламина использовался для блокировки неприкрепленной антител области. Для измерений использовали линейное сканирующее напряжение 0–2 В с шагом 0,01 В. Правильные изменения тока после каждой иммобилизации подтверждали связывание антитела и GNS-антитела на сенсирующих поверхностях

Сравнительная детекция SCC-Ag на поверхности IDE-TiO₂ антителом или GNS-антелом

Поскольку GNS-антитело показывает эффективную иммобилизацию на поверхности IDE-TiO₂, похожие 1 нМ концентрации SCC-Ag детектировали на поверхностях антитела и GNS-антитела и сравнивали изменения уровня тока. Рис. 4a показывает детекцию 1 нМ SCC-Ag на поверхности, модифицированной антителом. Перед детекцией поверхность, модифицированная антителом, покрывали блокирующим агентом этаноламином для избежания неспецифического связывания биомолекул. Этаноламин показывал изменение тока 4,65E-12. После добавления 1 нМ SCC-Ag уровень тока увеличился до 1,33E-09. Эти изменения тока четко указывали на связывание SCC-Ag с его антителом. В случае GNS-антел поверхности этаноламин показывал уровень тока 1,33E-11; после добавления 1 нМ SCC-Ag он увеличился до 1,62E-09 (рис. 4b). Изменения тока с GNS-антелом были выше по сравнению с только антител-модифицированной поверхностью для похожей концентрации SCC-Ag. Это может быть связано с более высоким числом антител, связанных на поверхности IDE-TiO₂ через GNS.

Детекция SCC-Ag с a антителом и b GNS-антелом. Протестировано на поверхностях IDE-TiO₂ с вышеуказанными шагами до блокировки 1 М этаноламином. Для измерений использовали линейное сканирующее напряжение 0–2 В с шагом 0,01 В. После взаимодействия 1 нМ SCC-Ag уровни тока увеличились в обоих случаях; при этом с GNS-антелом наблюдается более высокое изменение тока

Предел детекции SCC-Ag на поверхности IDE-TiO₂ антителом или GNS-антелом

Поверхности, модифицированные антителом или GNS-антелом, показывают четкую детекцию SCC-Ag, и предел детекции оценивали на обеих поверхностях для сравнения (рис. 5a, b). Для этого концентрации от 10 фМ до 1 нМ SCC-Ag разбавляли и наносили по отдельности на эти поверхности, фиксируя изменения тока. Рис. 5a показывает разные концентрации SCC-Ag связывания на поверхности, модифицированной антителом. После этаноламина 10 фМ SCC-Ag взаимодействовал, и никакого изменения тока не заметили. При увеличении концентрации до 100 фМ был незначительный изменение тока с 4,65E-12 до 6,54E-11. Далее концентрации увеличивали до 1 пМ, 10 пМ, 100 пМ и 1 нМ, и уровни тока увеличивались как 4,69E-10, 7,91E-10, 8,78E-10 и 1,33E-09 соответственно. Эти результаты четко указывают, что с увеличением концентраций связывание также увеличивается. Предел детекции рассчитывали на основе 3σ и составлял 100 фМ (рис. 6a).

Доза-зависимые взаимодействия с a антителом и b GNS-антелом на поверхностях IDE-TiO₂. Поверхность с вышеуказанными шагами до блокировки 1 М этаноламином. Для измерений использовали линейное сканирующее напряжение 0–2 В с шагом 0,01 В. Концентрации SCC-Ag от 10 фМ до 10 нМ взаимодействовали на обеих поверхностях, и изменения тока фиксировали. Промывка выполнялась пятью реакционными объемами на каждом этапе с использованием 10 мМ PBS (pH 7,4). С увеличением концентраций SCC-Ag уровни тока постепенно увеличивались в обоих случаях. GNS-антитело показывает изменения тока от 10 фМ, тогда как изменения от 100 фМ замечены только с антителом. В обоих случаях (антитело и GNS-антитело) 1 нМ SCC-Ag демонстрировало насыщение. При дальнейшем увеличении концентрации никаких значимых изменений тока не наблюдалось

Сравнение изменений тока с разными концентрациями SCC-Ag на поверхностях, модифицированных антителом и GNS-антелом. a График линейной регрессии для предела детекции SCC-Ag. С антителом (красная линия) и с GNS-антелом (синяя линия) отображены. Предел детекции найден как 10 фМ с GNS-антелом и 100 фМ с только антителом. b Изменения тока при взаимодействии SCC-Ag и антитела. При всех концентрациях более высокий уровень изменений тока найден на поверхности GNS-антитела. Для измерений использовали линейное сканирующее напряжение 0–2 В с шагом 0,01 В. Полоса ошибки указывает усредненные значения из трипликатов (n = 3) со стандартными отклонениями в диапазоне ± 0,1–0,15 × 10⁻⁹ А. Предел детекции (LOD) считался наименьшей концентрацией аналита (из калибровочной линии при низких концентрациях) против фонового сигнала (S/N = 3:1), иными словами, LOD = стандартное отклонение базовой линии + 3σ

Те же концентрации SCC-Ag взаимодействовали независимо на поверхностях, модифицированных GNS-антелом. Когда 10 фМ SCC-Ag наносили на поверхность, она четко изменила ток с 1,33E-11 до 3,74E-11. Этот результат показывает, что даже 10 фМ SCC-Ag может четко взаимодействовать с GNS-антел-иммобилизованной поверхностью, что не может быть детектировано в случае только с антителом. Более того, при увеличении концентраций до 100 фМ, 1 пМ, 10 пМ, 100 пМ и 1 нМ уровни тока увеличивались дальше до 4,69E-10, 9,23E-10, 1,41E-09, 1,48E-09 и 1,62E-09 соответственно (рис. 5b). Статистические расчеты со стандартными отклонениями в диапазоне ± 0,1–0,15 × 10⁻⁹ А. При сравнении сенсирования на вышеуказанных двух поверхностях, GNS-антел-модифицированная поверхность показывает более высокие изменения тока при всех тестированных концентрациях SCC-Ag (рис. 6b). На основе 3σ находили предел детекции как 10 фМ (рис. 6a), это в 10 раз лучше (ниже) детекция по сравнению с только антител-модифицированной поверхностью. Статистические расчеты со стандартными отклонениями в диапазоне ± 0,1–0,15 × 10⁻⁹ А. Ранее SCC-Ag оценивали на разных наноматериалах, таких как стронциевые наночастицы и графен; однако эти поверхности показывали ~ 1000-кратно меньшую чувствительность по сравнению с текущим исследованием.

Секретивная детекция SCC-Ag на поверхностях, модифицированных антителом/GNS-антелом

Секретивная детекция SCC-Ag сравнивали с двумя контрольными белками: серпином и альбумином, которые обильны в кровотоке. Серпин — ингибитор протеаз, выполняющий различные физиологические функции и биологические процессы человека, тогда как альбумин составляет 45 мг/мл и вносит 50–70% в сыворотку крови. Как показано на рисунке, 1 нМ концентрация этих двух контрольных белков и SCC-Ag наносили по отдельности на поверхности антитела или GNS-антитела (рис. 7a); четко видно, что изменения тока замечались только с SCC-Ag в обоих случаях, указывая на то, что антитело способно распознавать только SCC-Ag. Никаких значительных изменений тока при взаимодействии контрольных белков не замечали. Этот эксперимент подтверждает, что текущая экспериментальная установка может специфически детектировать/диагностировать SCC-Ag. Дополнительная поддержка давали другие контрольные эксперименты взаимодействием SCC-Ag с GNS в одиночку и SCC-Ag с поверхностью TiO₂-IDE, покрытой нанимате-иммунным антителом, помеченным GNS. Никаких значительных изменений тока не замечали по сравнению с специфическим взаимодействием (рис. 7b).

a Секретивная детекция SCC-Ag на поверхностях, модифицированных антителом и GNS-антелом. Взаимодействия с C1-серпином и C2-альбумином выполнялись. Поверхность с вышеуказанными шагами до блокировки 1 М этаноламином. Значения усредняли трипликатами. В обоих случаях антитело распознавало только SCC-Ag, указывая на специфическую детекцию. b Контрольные измерения. Специфические взаимодействия сравниваются с неспецифическими. Четкие различия замечены. Для измерений использовали линейное сканирующее напряжение 0–2 В с шагом 0,01 В. Полоса ошибки указывает усредненные значения из трипликатов (n = 3) со стандартными отклонениями в диапазоне ± 0,1–0,15 × 10⁻⁹ А

Заключение

Рак головы и шеи — распространенный рак, затрагивающий области рта, горла и слюнных желез. Диагностика рака головы и шеи с подходящим биомаркером обязательна для назначения необходимого лечения пациентам и улучшения их образа жизни. SCC-Ag найден как один из важных биомаркеров для раков; здесь SCC-Ag детектировали на оксиде титана покрытом интердигитированном электроде сенсирующей поверхности (IDE-TiO₂). Антитело для SCC-Ag иммобилизовали на поверхности IDE-TiO₂ и детектировали SCC-Ag. Предел детекции составил 100 фМ, и дальнейшее увеличение предела детекции достигли конъюгацией антитела с золотой нанозвездой (GNS-антитело). Предел детекции улучшился в 10 раз (до 10 фМ), это может быть связано с большим числом антител, связанных на амин-модифицированной TiO₂ поверхности через GNS. Более того, контрольные эксперименты проводили с двумя разными белками и анти-SCC-Ag не смогло их распознать, указывая на селективную детекцию SCC-Ag. Продемонстрированная сенсирующая поверхность IDE-TiO₂ помогает диагностировать рак головы и шеи, стратегию можно следовать для ранней детекции.