Выявление генотип-специфических макромолекул E. coli с помощью наномеханического картирования АФМ

Аннотация

Классификация микробных штаммов традиционно основана на молекулярных методах, и редко изучаются морфологические характеристики бактериальных штаммов. В этом исследовании мы раскрыли макромолекулярные структуры бактериальной поверхности с помощью наномеханического картирования АФМ, разрешающая способность которого определяется не только наномасштабным размером наконечника, но и механическими свойствами образца. Этот метод позволил наномасштабное изучение мембранных структур микробных штаммов с простой подготовкой образца и гибкими рабочими условиями, преодолев множество ограничений электронной микроскопии и биохимических аналитических методов с маркировкой. Характерные макромолекулы, расположенные на клеточной поверхности, были расценены как белки поверхностного слоя (S-слой) и оказались специфичными для генотипов Escherichia coli, при этом средние молекулярные размеры характеризовались диаметрами от 38 до 66 нм, а формы молекул — почковидными или круглыми. В заключении, поверхностные макромолекулярные структуры имеют уникальные характеристики, связанные с генотипом E. coli, что предполагает, что геномные эффекты на клеточную морфологию могут быть быстро идентифицированы с помощью наномеханического картирования АФМ.

Введение

Из-за низкого разрешения оптической микроскопии и ограниченной рабочей среды электронной микроскопии исследователи в микробиологии редко используют внешний вид бактериальных клеток, а вместо этого прибегают к молекулярным или химическим аналитическим методам для идентификации геномных фрагментов, экспрессии белков и т.д. Неудивительно, что эти методы имеют ряд недостатков, включая трудоемкость и затратность времени, поэтому необходимы более прямой, эффективный и гибкий подходы. Изобретенный в 1982 году Бинигом и др., атомно-силовой микроскоп (АФМ) предназначен для использования наномасштабного зонда, контролируемого лазерным лучом, для наблюдения поверхности образца с наноскопическим или даже атомным разрешением. Изображение морфологии через физический зондовый наконечник позволяет преодолеть предел разрешения и экологические ограничения как оптической, так и электронной микроскопии и имеет ряд преимуществ, таких как простая подготовка образца и гибкие рабочие среды в окружающем воздухе или жидких условиях. Тем не менее, в отношении микробиологических исследований текущие применения АФМ в основном ограничиваются качественным изображением статических или динамических морфологий бактериальных клеток или экспрессии жгутиков и пили, тогда как мало исследований фокусируются на поверхностной ультраструктуре микробных клеток и количественном анализе клеточных свойств.

В этом исследовании АФМ был выбран для поверхностного изучения клеток Escherichia coli (E. coli), и формы и размеры отдельных бактерий наблюдались с помощью топографических и фазовых изображений АФМ. Кроме того, одновременное механическое картирование позволило выявить дополнительную биомеханическую информацию о поверхностных компонентах, где небольшие различия в адгезивных характеристиках между макромолекулами и окружающей матрицей могли быть обнаружены при каждом физическом контакте между наконечником и образцом. Применяя такие передовые техники к микробиологическим областям, мы исследовали три генотипа E. coli, содержащих один лабораторный штамм и два патогенных для человека штамма для идентификации поверхностных макромолекул. Результаты показали, что эта техника может обеспечить разрешение изображения, превышающее масштаб наконечника АФМ, за счет 감живания механического распределения образца. В заключение мы предполагаем, что такое развитие в поверхностной науке не только предоставит исследователям в микробиологических областях детали клеточного внешнего вида, но также внесет вклад в наше знание поверхностных характеристик других био- или наноматериальных систем.

Методы

Микробные образцы

Три штамма E. coli, использованные в этом исследовании, были клинически изолированы и предоставлены проф. Ching-Hao Teng's лабораторией в Институте молекулярной медицины, Национальном университете Чэньгун. MG1655 — кишечный и дикий лабораторный штамм E. coli K-12, а два других штамма — человеческие патогены — CFT073, главная причина мочевых трактовых инфекций, и RS218, ассоциированный с новорожденческим менингитом у младенцев.

Функционализированный субстрат

Два этапа поверхностных модификаций применялись для ковалентного связывания между твердой поверхностью и микробными клетками. Сначала раствор 3-аминопропилтриэтоксисилана (APTES, Sigma-Aldrich Co. LLC, США) использовался для формирования начального NH₂-функционализированного слоя на поверхности, где стабильное APTES-покрытие обеспечивалось стабильными Si-O связями — Si от APTES и O от оксидированной поверхности. Глутаральдегид, обладающий двумя COOH функциями, соединяется с NH₂ функцией APTES одной COOH и работает с NH₂ на бактериальной поверхности другой COOH.

Чистые субстраты погружали в раствор APTES, с смесью 5% APTES в этаноле, на час и промывали этанолом и ddH₂O. Стеклышки сушили азотным потоком и затем помещали в раствор глутаральдегида, 2% в PBS, на ночь, и промывали PBS.

Подготовка образца

Одиночные колонии штаммов E. coli выбирали из агаровых пластинок лизогенического бульона (LB) и инкубировали в LB бульоне. После времени культивирования 12 ч бактериальный раствор разбавляли 1:100 в свежем предварительно равновешенном LB бульоне. После еще 12 ч для микробного культивирования бактериальный раствор подвергали центрифугированию при 1500×g (4000 об/мин) в течение 3 мин и ресуспендировали в LB бульоне, этот процесс повторяли дважды. Двести микролитров бактериального раствора капали на функционализированный субстрат и оставляли на 30 мин. Образец затем погружали в дистиллированную воду дважды для удаления неприкрепленных клеток и сразу изображали под АФМ в окружающем воздухе.

АФМ характеристика

Выбирали АФМ инструмент (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, USA) и нитрид кремния зонд с откалиброванной константой пружины 0,7 Н/м и радиусом наконечника 10 нм для поверхностного исследования микробных образцов. Скорость сканирования АФМ и пиксели линий составляли 0,5 Гц и 256 линий соответственно для размера сканирования 10 мкм для первого обнаружения топографии, а параметры затем устанавливали как 0,3 Гц и 512 линий для размера сканирования 2 мкм для детального наблюдения. Режим PeakForce quantitative nanomechanical (QNM) использовался для наномеханического картирования, где адгезивные свойства поверхности вычислялись из максимального притягивающего усилия среди кривых силу-расстояние при отрыве.

Наше предыдущее исследование Streptococcus mutans показывало механическую эволюцию на бактериальной поверхности в течение 2 ч, отслеживаемую непрерывным АФМ механическим картированием, и микробные образцы были подтверждены живыми в течение такой длительности. Для обеспечения жизнеспособности образцов E. coli, использованных в этой работе, проводились предварительные исследования на бактериальных образцах, и непрерывное изменение поверхностной адгезии в течение 4 ч подразумевало, что клетки остаются живыми как минимум 4 ч после подготовки образца (показано в Дополнительном файле 1). Следовательно, микробные образцы, испытанные в этой работе, измерялись АФМ в течение 2 ч после подготовки образца. Все генотипы E. coli культивировали индивидуально и в разное время, и АФМ измерения проводили сразу после подготовки образца. Другими словами, бактериальные образцы не выстраивались в очередь для исследования, поэтому эффекты времени удержания на различия между штаммами E. coli были минимизированы. Количественные данные для каждого штамма E. coli собирались из измерений, взятых в течение 2 ч в этом исследовании.

Статистический анализ

Prism (GraphPad Software, США) использовался для статистического анализа в этой работе. Клеточные длины и макромолекулярные размеры представлялись как средние значения вместе со стандартной ошибкой среднего (SEM). Множественные сравнения между генотипами E. coli обрабатывались с помощью обычного одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA). Уровень доверия 95% (p < 0,05) выбирался, а звездочки указывают степень найденной значимой разницы. Размер выборки n каждого штамма > 40.

Результаты и обсуждение

Поверхностная ультраструктура множественным картированием

При сканировании АФМ на масштабе наблюдения 10 мкм на бактериальном образце можно было увидеть несколько одиночных клеток E. coli MG1655, и клеточная форма в трех измерениях могла быть замечена на топографическом изображении (рис. 1a); четкие контуры клеток в двух измерениях получались на изображении ошибки дефлекции (рис. 1b), и несколько трубочек рядом с бактериальными клетками могли быть найдены. Волнообразные филаменты (рис. 1c) соответствовали внешнему виду микробных жгутиков, сообщаемым в другой работе, что подтвердило такое нахождение как жгутики, и более короткие и волосяные пили также могли быть замечены. При уменьшении области наблюдения зонда для детального изучения одиночных микробных клеток топография показывала незначительную разницу в вертикальном направлении среди клеточных поверхностей, как показано на рис. 1d, а изображение ошибки дефлекции казалось предоставляющим больше морфологической информации, тогда как собранный экологический шум был слишком велик для исследования ультраструктуры клеточной поверхности (рис. 1е). Когда одновременные биомеханические свойства образца измерялись во время контакта наконечника с испытуемым объектом, обнаруживалось, что бактериальная поверхность на самом деле состоит из огромного количества макромолекул с определенной формой и размером, как было раскрыто картой адгезивной силы (рис. 1f); таким образом, морфологическое разрешение в топографических и изображениях ошибки дефлекции было дополнительно улучшено с биомеханической информацией.

На рис. 2a экспрессия жгутиков E. coli MG1655 могла быть явно замечена, где размер филаментов был похож на те на рис. 1b, с адгезивными свойствами относительно ниже, чем у субстрата. Кроме того, бактериальная поверхность обнаруживалась составленной из круговых компонентов, которые характеризовались как менее адгезивные по сравнению с окружающей матрицей. Это наблюдение похоже на наши предыдущие находки на тканевых слоях кожи мышей, и повторяющиеся и сравнимые зерна считались макромолекулами, структура которых более плотная и последовательная, чем в интермолекулярной области, так что различия в адгезивной производительности могли быть легко почувствованы. Внешний слой клеточной оболочки в грамотрицательных бактериях — это слой самосборных белков, как проиллюстрировано на рис. 2b, известный как белок поверхностного слоя (S-слой). S-слой структуры традиционно измерялись электронной микроскопией, тогда как требования вакуумной среды и проводящего покрытия теряли нативную и реальную информацию о белках. Хотя некоторые исследования извлекали S-слой белки и реассемблировали их на слюдяном субстрате для АФМ сканирования, результаты не обеспечивали in situ и реального времени производительности S-слой структуры. Основываясь на клеточной архитектуре и некоторых предыдущих изображениях микробной поверхности электронной микроскопией, мы рассматривали наблюдаемые макромолекулы как S-слой белки.

Сравнивая АФМ и трансляционную электронную микроскопию (TEM) измерения, первое имеет несколько преимуществ над вторым, такие как более простая подготовка образца, менее ограниченные экспериментальные требования и более биологически-дружественные приложения визуализации. Выбор TEM в биологической области обычно обусловлен его способностью видеть внутриклеточные органеллы и ультра-разрешение (обычно нанометр или субананометр) изображения, которые могут быть получены. АФМ адгезионное картирование в текущей работе улучшило разрешение признаков и представило расположения поверхностных макромолекул способом, не зависящим от размера наконечника, а от внутренней структуры самого образца. Кроме того, этот подход обеспечивает наномасштабное разрешение микробной поверхности в диапазоне десятков квадратных микрометров.

Геномно-определяемые различия в морфологических характеристиках

После наблюдения поверхностной ультраструктуры клеток E. coli MG1655, одним вопросом интереса является то, как макромолекулы расположены в других штаммах. Человеческие патогены E. coli CFT073 и RS218 были исследованы АФМ с теми же экспериментальными параметрами, и значимых различий в клеточных формах и размерах между этими тремя генотипами на размере признака 10 мкм не обнаружено, видно на рис. 3a–c. Адгезионное картирование силы использовалось для идентификации S-слой белков, и несхожие структуры с различными формами и размерами были обнаружены среди разных штаммов E. coli, как показано на рис. 3d–f. Для удобства сравнения детальные адгезионные картирования изображений штаммов E. coli отображены на рис. 3g–i. Поверхностные макромолекулы характеризовались как имеющие круглую форму в клетках MG1655 и RS218, хотя с разными молекулярными диаметрами, которые составляли 38 ± 1,1 нм (n = 80) для MG1655 и 58 ± 2,7 нм (n = 46) для RS218. С другой стороны, клетки CFT073 обладали уникальной формой S-слой белков, которые были почковидными с разницей длины между двумя конечными точками 66 ± 3,2 нм (n = 44). После анализа размеров S-слой белков этих трех генотипов для множественных сравнений результаты продемонстрировали значительные различия между этими штаммами (рис. 4).

Микробные S-слои сообщают об важных ролях во многих функциях, включая защиту клеток от суровых сред, атак фагоцитоза и хищных бактерий. Кроме того, S-слои также служат адгезинами, обеспечивающими эффективную колонизацию. S-слой структуры хорошо изучены TEM и классифицированы в различные решетчатые типы с расстоянием между центрами в диапазоне 4–35 нм. Вариация между нашими АФМ результатами и TEM отчетами из литературы считалась результатом разных методов визуализации, где TEM дает 2D морфологию S-слой структуры, а АФМ захватывает 3D топографию, включающую множественные влияния, вносимые клеточной кривизной и шероховатостью и геометрией АФМ зонда.

Разные типы S-слой структур изначально считались возможными для использования их различных таксономических характеристик для различия среди бактериальных видов, хотя затем обнаружилось, что даже для одного вида микробные штаммы могут обладать разными решетками белков. Хотя некоторые исследования изучали роль S-слоя в филаментном формировании, типы белков на клеточных мембранах и геномные разнообразия в размере среди генотипов E. coli, различия в S-слой белках редко отмечались. Результаты текущего исследования раскрыли различия в морфологических характеристиках среди E. coli MG1655, CFT073 и RS218 и предполагают, что внешние признаки поверхностных макромолекул, вероятно, специфичны для индивидуального генотипа E. coli.

Заключение

В этой работе геномно-специфическая наноструктурная информация о бактериальной поверхности была обнаружена АФМ механическим картированием, которое отличало адгезивные различия между макромолекулами и окружающей матрицей. Поверхностные макромолекулы микробных клеток рассматривались как белки поверхностного слоя, согласно молекулярной архитектуре грамотрицательных микробов. Расположения и размеры этих макромолекул оказались специфичными для испытанных генотипов E. coli с отличительными формами и размерами, эти различия показаны статистически значимыми. В заключение мы считаем, что бактериальная S-слой структура геномно-зависима и может быть потенциальным методом для быстрой диагностики микроб-ассоциированных заболеваний или микробных штаммов. Для реализации практического применения S-слой характеристики требуется исследование большего числа бактериальных генотипов для дополнения каталога. Мы сейчас создаем базу данных, связывающую бактериальные морфологические характеристики и физиологические/патологические показатели, и верим, что это будет перспективным прогрессом для практического применения АФМ исследования.

Аббревиатуры

AFM:

Атомно-силовой микроскоп

ANOVA:

Односторонний дисперсионный анализ

APTES:

3-Аминопропилтриэтоксисилан

LB:

Лизогенический бульон

QNM:

Количественный наномеханический

S-слой:

Поверхностный слой

TEM:

Трансляционная электронная микроскопия