Сборка углеродных точек в каркасы с повышенной стабильностью и антибактериальной активностью

Введение

Бактериальные инфекции представляют серьезную угрозу для жизни человека, и разработка эффективных лекарств для дезинфекции бактерий пользуется большим спросом [1]. Для лечения бактериальных инфекций использовались различные антибиотики, но чрезмерное использование антибиотиков вызывает другие проблемы, такие как побочные эффекты и проблемы с лекарственной устойчивостью [2]. Наноматериалы, включая антимикробные полимеры [3], металлические наноматериалы [4] и углеродные наноматериалы [5, 6], использовались в качестве альтернативы классическим антибиотикам [7]. Устойчивость к лекарствам и токсичность уменьшаются [8]. В последнее время CD [9, 10] и нанокластеры (NC) [11] широко применяются для борьбы с бактериальными инфекциями, поскольку они биосовместимы [12], активны [13] и могут быть легко очищены циркуляцией из-за сверхмалых размеров. [14, 15]. В частности, исследователи обнаружили, что компакт-диски демонстрируют превосходную способность улавливать свободные радикалы, которая может быть сильнее, чем у многих традиционных противоинфекционных препаратов [16,17,18]. Однако некоторые сверхмалые противомикробные препараты обладают плохой стабильностью из-за большей площади окислительной поверхности [19]. Крайне желательно разработать более эффективные антибактериальные средства для борьбы с бактериальными инфекциями для длительного использования.

Чтобы удовлетворить спрос на практическое применение, противомикробные препараты должны обладать следующими характеристиками:(а) отличная стабильность остается неизменной в течение определенного времени в окружающей среде; (б) Превосходная биосовместимость и низкая токсичность:(в) высокая антибактериальная активность. Более крупные наноматериалы, как правило, более стабильны, но они могут иметь относительно более слабую антибактериальную активность из-за меньшей площади активной поверхности. Принимая во внимание слабость малых и больших наноматериалов, мы сообщаем о сборке малых CD в большие CDF путем простого добавления полиэтиленимина (PEI) (рис. 1). Компакт-диски не были сплавлены, но сохранили свою морфологию как строительные блоки. Следовательно, все CDF показали больший размер, но продемонстрировали более высокую стабильность без потери активных свойств компакт-дисков. Кроме того, мы обнаружили, что CDF проявляют повышенную антибактериальную активность против грамотрицательных бактерий Escherichia coli ( E. coli ) и грамположительные Staphylococcus aureus ( S. aureus ) по сравнению с CD, что указывает на их антибактериальные свойства широкого спектра, хотя многие CD уничтожают только грамположительные бактерии [20]. Кроме того, CDF способствовали пролиферации клеток PC12 (линия клеток, полученная из феохромоцитомы мозгового вещества надпочечников крысы), показывая большой потенциал для применения в восстановлении нервов [21]. В этой работе предполагается, что сборка небольших CD в большие CDF не только повышает стабильность, но и усиливает антибактериальную активность.

Схема синтеза CD и сборки в CDF путем добавления PEI с повышенной антибактериальной активностью

Материалы и методы

Материалы и инструменты

Рентгеновские поверхностные фотоэлектронные спектры (XPS) регистрировали на приборе ESCALAB250Xi для рентгеновской поверхностной фотоэлектронной спектроскопии (XPS). Просвечивающий электронный микроскоп (ПЭМ) выполнялся с помощью микроскопа JEM-2100, работающего при 200 кВ. Флуоресценцию материалов получали с помощью флуоресцентного спектрометра F97. Окрашивание бактериальных клеток FDA / PI регистрировали в режиме постукивания с помощью микроскопа Leica DFC450C. Время жизни флуоресценции измеряли в системе коррелированного по времени однофотонного счета (TCSPC) с использованием спектрофлуориметра Nanolog (Horbia JY, Япония). Спектры ультрафиолетовой и видимой спектроскопии (УФ-видимая) получены на приборе UV-1600. Визуализацию бактерий наблюдали с помощью конфокального микроскопа (Olympus FLUOVIEW FV1000 c). Все реактивы аналитической чистоты. Деионизированная вода использовалась в экспериментах. Набор для подсчета клеток 8 был получен от Beyotime Biotechnology.

Подготовка компакт-дисков и CDF

L-цистеин (1,0 г) растворяли в 10,0 мл деионизированной воды и хорошо перемешивали. Затем pH раствора доводили до 9,0 с помощью 1,0 M NaOH. Раствор переносили в гидротермальный реактор и нагревали при 160 ° C в течение 24 часов. После охлаждения раствора до комнатной температуры полученный раствор подвергали диализу с использованием диализного мешка (предел молекулярной массы 7000) в течение одного дня. Полученные компакт-диски использовали для следующих характеристик и экспериментов. Для приготовления CDF к 1 мл CD добавляли 40 мкл 1% PEI. Смесь оставляли на 1 час. Продукт очищали диализом, используя тот же метод, что и очистка компакт-дисков. Для определения характеристик HR-TEM образцы концентрировали до небольшого объема, переносили в колонку с силикагелем и элюировали метанолом и дихлорметаном для получения продуктов дополнительной очистки.

Оценка токсичности

Клетки PC12 высевали в 96-луночные планшеты в течение 12 ч, а затем инкубировали с CD и CDF с различными концентрациями. Число жизнеспособных клеток исследовали с использованием набора для подсчета клеток-8 (CCK-8). 3- (4,5-Диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолийбромид (МТТ) (5 мг / мл в PBS) добавляли в 1/10 объема культуры, и клетки возвращали в инкубатор. После этого супернатанты удаляли и в каждую лунку добавляли 200 мкл диметилсульфоксида (ДМСО). Кристаллы растворяли встряхиванием пластин в течение 10 мин. Поглощение при 490 нм измеряли с помощью Microreader (Varioskan LUX Multimode Reader). Для всех измерений оптической плотности были включены пустые контрольные лунки.

Антибактериальный эксперимент

Э. coli и С. золотистый инкубировали в отсутствие и в присутствии CD и CDF при 37 ° C со встряхиванием 250 об / мин. Рост бактериальных клеток в культуре бульона Lysogeny (LB) измеряли с помощью Microreader при длине волны 600 нм (OD600). Среду LB использовали в качестве холостого контроля. OD600 обозначает плотность клеток, и относительная жизнеспособность клеток рассчитывалась на основании сравнения культивируемых бактериальных клеток в присутствии материалов с контрольной группой (OD600 бактериальных клеток в отсутствие CD или CDF). Живые / мертвые бактерии оцениваются по протоколу окрашивания FDA / PI [22].

Обнаружение активных форм кислорода (ROS)

Продукцию внутриклеточных ROS измеряли в бактериальных клетках до и после обработки CD и CDF в течение 12 часов с помощью зонда 2 ', 7'-дихлорфлуоресцина диацетата (DCFH-DA), следуя инструкциям. Флуоресценцию регистрировали при длине волны излучения 525 нм с возбуждением на 488 нм.

Результаты и обсуждения

Характеристика материалов

Исследование размера

На рис. 2 показана СЭМ порошка для CDF с относительно меньшим (рис. 2a0) и большим увеличением (рис. 2b0) после выдержки на воздухе в течение нескольких часов. Можно видеть, что CDF были хорошо распределены и показали средний размер ок. 25 нм. Предполагалось, что компакт-диски будут демонстрировать монодисперсные небольшие размеры на основе исследования ПЭМ и АСМ (дополнительный файл 1:рисунок S1), но эти маленькие частицы демонстрировали агрегацию, наблюдаемую с помощью SEM после воздействия воздуха в течение определенного времени (дополнительный файл 1:рисунок S2 ). С другой стороны, CDF сохранили свою морфологию, хотя подвергались воздействию окружающей среды. Это указывает на то, что полученные CDF более перспективны для практического применения. CDF были дополнительно охарактеризованы с помощью ПЭМ (рис. 2b1). Можно видеть, что CDF демонстрируют сборочные конструкции с небольшими компакт-дисками в качестве строительных блоков. Анализ просвечивающей электронной микроскопии высокого разрешения (HR-TEM) (рис. 2b2) показал, что строительный блок CDFs демонстрирует полосы решетки с интервалом d 0,21 нм, соответствующие плоской решетке графита (100), которая была аналогично классическим компакт-дискам [23,24,25]. Таким образом, сборочные CDF не теряют свойства компакт-дисков, которые могут сочетать в себе преимущества как целых больших каркасов, так и внутренних небольших строительных блоков.

SEM для CDF с относительно низким ( a0 ) и большее увеличение ( b0 ); ТЕА ( b1 ) HR-TEM ( b2 ) CDF

Дзета-потенциал

Исследования дзета-потенциала использовались для измерения степени электростатического отталкивания CD и CDF между соседними заряженными частицами в дисперсной системе (рис. 3). Можно видеть, что пик дзета-потенциала компакт-дисков не был хорошо представлен, поскольку они подвергались воздействию окружающей среды. Кроме того, были получены множественные пики дзета-потенциала с большими отклонениями дзета (таблица 1), что указывает на то, что CD были довольно нестабильными и неповторяемыми. С другой стороны, пик дзета-потенциала для CDF сфокусирован на относительно стабильном диапазоне. У нас также были гораздо меньшие дзета-отклонения, основанные на трехкратных измерениях, что показало, что CDF были более стабильными, а в дисперсных системах были образцы с более высокой чистотой.

Дзета-потенциал компакт-дисков ( a ) и CDF ( b )

Свойства флуоресценции

Спектры флуоресцентного излучения использовались для мониторинга процесса сборки CD в CDF (рис. 4). По мере титрования ПЭИ флуоресценция на длине волны 350 нм постепенно гаснет (рис. 4а). Но не наблюдалось значительного сдвига спектров флуоресценции, свидетельствующего об отсутствии агрегации. Структура сборки CDF изменяет весь размер CD, что влияет на флуоресценцию. Между тем соседние компакт-диски отмечали флуоресценцию друг друга. Кроме того, химия поверхности играет важную роль в свойствах флуоресценции. Атомы азота и атомы серы на поверхности компакт-дисков могут создавать энергетические ловушки. Яркая флуоресценция компакт-дисков связана с дефектной поверхностью с большим количеством карбонильных и аминогрупп. После функционализации PEI на поверхности CDF преобладали аминогруппы, которые гасили флуоресценцию вместе с растущими размерами. Сравнение флуоресцентного поведения CD и CDF было дополнительно исследовано TCSPC, чтобы понять пути рекомбинации фотогенерируемых зарядов материалов (рис. 4b). Эмиссию контролировали на длине волны 430 нм. Затухание флуоресценции требовало двухкомпонентной экспоненциальной аппроксимации. Постоянные времени и относительные амплитуды подобраны и суммированы в Таблице S1. Видно, что время жизни доминирующего компонента для КД составляло 2,45 нс, а время жизни другого компонента - 7,47 нс. С другой стороны, время жизни доминирующего компонента для компакт-дисков составляло 1,98 нс, в то время как время жизни другого компонента составляло 7,30 нс. Не наблюдалось значительного изменения срока службы между CD и CDF, что также указывает на то, что свойства CD существенно не изменились при сборке в CDF [26].

Спектры излучения флуоресценции а компакт-дисков, как титрование PEI, и срок службы b для компакт-дисков и CDF

Токсичность

Для оценки безопасности материалов исследуется токсичность CD и CDF по отношению к клеткам PC12. Анализы MTT были проведены для изучения влияния материалов на жизнеспособность клеток (рис. 5). После инкубации PC12 с CD и CDF жизнеспособность клеток не сильно изменилась в течение 24 часов. Интересно, что оба углеродных материала способствуют пролиферации PC12, который играет важную роль в терапии повреждения нервов. Эти результаты указывают на низкую токсичность материалов, и материалы являются многообещающими для защиты нервов с вовлечением клеток PC12 [27].

Жизнеспособность клеток PC12 в присутствии CD ( a ) и CDF ( b ). Жизнеспособность клеток (%) =(поглощение экспериментальной группы - поглощение пустой группы) / (поглощение контрольной группы - поглощение пустой группы) × 100%

Антибактериальные исследования

Антибактериальную активность CD и CDF первоначально оценивали путем измерения плотности бактерий в присутствии этих агентов при 600 нм [28]. На фиг.6 показан значительный антибактериальный эффект как CD, так и CDF против обоих S. золотистый и Э. coli клетки. В частности, жизнеспособность S. золотистый клеток было почти 0 при использовании более 30 мкг / мл CDF. Точно так же E. coli клетки дезинфицировали как CD, так и CDF. Компакт-диски показали несколько зарядов (рис. 3а). С другой стороны, CDF были с незначительными зарядами (рис. 3b), которые могли подавлять бактериальную адгезию при слабом отталкивании, таким образом, более легко взаимодействуя с бактериальной поверхностью. Для сравнения, CDF демонстрируют более высокую антибактериальную активность, основанную на том явлении, что относительно большая часть клеток погибает при использовании более 6 мкг / мл материалов. Повышенная антибактериальная активность CDF, возможно, объясняется синергическим эффектом CD как строительных блоков, а также более стабильными поверхностными зарядами. Чтобы глубже понять антибактериальный механизм, были измерены АФК, которые могут окислять нефлуоресцентный DCFH до флуоресцентного DFC (рис. 6C). Оба углеродных материала не вызывали значительного образования АФК после обработки E. coli . Однако CDF заметно усиливали внутриклеточные ROS при взаимодействии с S. золотистый . Поскольку АФК могут повреждать бактериальную ДНК, РНК и белки, повышенная ценность облегчает дезинфекцию бактерий. Кроме того, ROS стимулировали H ₂ O ₂ Стоит отметить, что продукция ROS была значительно продвинута по сравнению с H ₂ О ₂ только лечение, в то время как CDF показали наибольшее улучшение. Это указывает на комбинацию H ₂ О ₂ с этими двумя углеродными материалами может еще больше усилить антибактериальную активность, особенно для CDF.

Антибактериальная активность CD и CDF против S. золотистый ( а ) и кишечная палочка ( б ), c интенсивность флуоресценции DCF при 525 нм, которая показывает линейную зависимость от уровня ROS, с обработкой CD и CDF в отсутствие и в присутствии H ₂ О ₂ (100 мкМ)

Ранее сообщалось, что некоторые компакт-диски дезинфицируют S. золотистый , который приведен в таблице 2 для сравнения. Текущие CDF показали конкурентоспособный MIC. Кроме того, CDF не только снижают жизнеспособность исследуемых клеток, но и способствуют пролиферации клеток PC12, что указывает на их универсальность при лечении бактериальных инфекций.

Целостность бактериальной мембраны после обработки CD и CDF исследовали в эксперименте по окрашиванию живых / мертвых клеток (фиг. 7). Зеленое флуоресцентное окрашивание FDA может показать только живые клетки, в то время как красный флуоресцентный ИП специфически окрашивает мертвые бактерии с поврежденными мембранами, а живые бактерии с неповрежденными бактериальными мембранами не окрашиваются [30, 31]. Как показано на флуоресцентных изображениях, очевидная красная флуоресценция наблюдалась в образцах, обработанных CD, и гораздо более высокая плотность мертвых клеток наблюдалась в образцах, обработанных CDF.

Окрашивание FDA / PI S. золотистый и Э. coli в отсутствие и в присутствии CD и CDF при 30 мкг / мл. Масштабная линейка, 200 мкм

Основываясь на приведенных выше сравнениях, мы заключаем, что CDF являются многообещающими для уничтожения как грамположительных, так и грамотрицательных бактериальных клеток. Следовательно, Э. coli и С. золотистый до и после обработки 30 мкг / мл CDF были охарактеризованы с помощью SEM (рис. 8). Как показано на фиг. 8a, c, бактерии до обработки CDF имеют регулярную поверхность. Однако после инкубации с CDF морфология бактериальных клеток, включая S. золотистый (Рис. 8b) и d E. coli (Рис. 8г) резко изменились. Более того, мембраны многих бактериальных клеток развалились. На поверхности бактерий наблюдались небольшие материалы, происходящие из прикрепленных CDF. Это указывает на то, что CDF могут дезинфицировать бактериальные клетки, повреждая мембраны [32].

SEM для S. золотистый ( а , b ) и кишечная палочка до ( a , c ) и после ( b , d ) обработка 30 мкг / мл CDF. Шкала шкалы:2 мкм

Поскольку как CD, так и CDF являются флуоресцентными, во время дезинфекции было исследовано 6 мкг / мл агентов для визуализации бактерий. Изображение С. золотистый был исследован и показан на рис. 9. Интересно, что было обнаружено, что как CD, так и CDF могут быть использованы для визуализации S. золотистый . Однако CDF демонстрируют более высокую эффективность поглощения, поскольку бактериальные клетки, наблюдаемые из яркого и темного полей, почти перекрываются. С другой стороны, только часть S. золотистый клетки окрашивали компакт-дисками. Кроме того, плотности бактериальных клеток были меньше при обработке CDF, представляющих CDF, продезинфицированные S. золотистый более эффективно по сравнению с компакт-дисками при тех же дозировках. Эти результаты также показывают, что CDF могут использоваться в качестве альтернативных красителей для визуализации различных бактериальных клеток.

Изображение S. золотистый за счет поглощения CD и CDF через 12 ч

Выводы

Сборка CD в CDF приводит к более устойчивой антибактериальной активности. Сделан вывод, что сборочная структура обеспечивает более стабильные свойства, но увеличивает антибактериальную активность CD. Эта работа также открывает новые возможности для сборки небольших наноматериалов в каркасы для более практических приложений.

Доступность данных и материалов

Все данные, подтверждающие выводы этой статьи, включены в статью.

Сокращения

компакт-диски:

Углеродные точки

файлы CDF:

Каркасы на основе углеродных точек

PEI:

Полиэтиленимин

E. coli :

кишечная палочка

S. золотистый :

Золотистый стафилококк

ТЕМ:

Просвечивающий электронный микроскоп

HR-TEM:

ТЕМ высокого разрешения

XPS:

Рентгеновские поверхностные фотоэлектронные спектры

MIC:

Минимальная ингибирующая концентрация

NC:

Нанокластеры

TCSPC:

Коррелированный по времени счет одиночных фотонов

CCK-8:

Набор для подсчета клеток-8

ROS:

Активные формы кислорода Ros

SEM:

Сканирующий электронный микроскоп

ZP:

Дзета-потенциал