Количественная оценка клеточной интернализации полимерных наночастиц в раковых клетках гортани и иммунных клетках для улучшения доставки лекарств

Введение

Рак является одной из основных причин смертности во всем мире:в 2018 г. было зарегистрировано около 10 миллионов новых случаев смерти [1]. Карцинома гортани (раковые клетки возникают из гортани) является вторым по распространенности злокачественным новообразованием плоскоклеточного рака головы и шеи (HNSCCs), на которое в 2018 г. пришлось около 180 000 новых случаев заболевания и 95 000 случаев смерти [2]. В настоящее время таргетные препараты разрабатываются в качестве дополнительного лечения проблем, связанных с традиционными методами лечения, такими как хирургия, лучевая терапия и химиотерапия [3]. Были ускорены научные усилия по улучшению адресности и эффективности лекарственных средств и снижению нежелательных побочных эффектов путем разработки, например, новых наноносителей для лекарственных средств ( т.е. , микроиглы), персонализированные противоопухолевые препараты и системы адресной доставки терапевтических антител [4].

Наноносители широко используются для загрузки противоопухолевых препаратов, таких как цисплатин, паклитаксел и доцетаксел, для улучшения их растворимости в воде, биодоступности и стабильности для улучшения доставки и эффективности лекарств [3, 4]. В общем, доставка лекарств на основе наночастиц (NP) позволяет доставлять широкий спектр других веществ ( например , белки, антитела, вакцины и нуклеиновые кислоты) в определенные области тела как у животных, так и у пациентов [4, 5]. Однако так называемый эффект повышенной проницаемости и удерживания (EPR) привел к значительному различию эффективности нацеливания среди различных типов рака [6]. Недавние данные свидетельствуют о том, что отложение наночастиц-носителей лекарств (здесь НЧ золота) в опухоли преимущественно зависит от процесса трансцитоза [7], типа биологического трансцеллюлярного транспорта, при котором вещества / НЧ переносятся через клетки с одной стороны на другую. другой включает курсы эндоцитоза, везикулярного переноса и экзоцитоза. Однако следует отметить, что противоречивые результаты, касающиеся механизмов адресной доставки лекарств, подчеркивают критическую важность для понимания основ клеточного взаимодействия с нанолекарствами или НЧ с использованием множества экспериментальных стратегий, начиная от культуры клеток in vitro и заканчивая культурой ткани ex vivo. и исследования на животных in vivo.

Многочисленные наноносители, такие как липосомы, НЧ альбумина (НЧ), НЧ кремнезема и сополимер молочно-гликолевой кислоты (PLGA), были клинически использованы для лечения различных типов рака, включая карциному гортани [4]. НЧ на основе полимеров, такие как мицеллы и PLGA, обладают большим потенциалом в биомедицинских приложениях благодаря их универсальным составам нанолекарств за счет простого смешивания или ковалентной конъюгации, превосходной способности к самосборке, высокой способности загрузки лекарственного средства и биосовместимости [8, 9 ]. Например, покрытые полиэтиленгликолем (PEG) наноносители PLGA, загруженные доксорубицином и индоцианиновым зеленым, обеспечивают синергетическую химиофотермическую терапию рака груди [10]. Кроме того, исследования как in vitro, так и in vivo показали, что мицеллы, нагруженные цисплатином, проявляют превосходную противораковую активность против ортотопических опухолей HNSCC ( т.е. , SAS-L1 и HSC-2) [11]. Хотя несколько полимерных нанопрепаратов-носителей, таких как PLGA и мицеллы, были одобрены для клинического использования или проходят оценку в клинических испытаниях [4, 6], многие другие полимерные нанопрепараты проходят доклинические исследования на различных раковых клетках головы и шеи. линий и ксенотрансплантатов опухолевых моделей животных [11,12,13,14].

Научные данные подчеркивают важность иммунологических ответов хозяина на носители нанолекарств, потому что как только эти НЧ попадают в организм, они неизбежно распознаются иммунной системой. Макрофаги считаются первой линией защиты клетки-хозяина, специализирующейся на нейтрализации и удалении аллергенов, микроорганизмов и посторонних частиц ( например , наноносители) посредством фагоцитоза и последующего праймирования иммунных ответов. Большинство наноносителей новой конструкции не смогли обеспечить адресную доставку к конкретным пораженным участкам или опухолям in vivo из-за эффективного накопления НЧ в системе мононуклеарных фагоцитов (MPS), таких как клетки Купфера в печени и макрофаги красной пульпы в селезенке. [15]. Следовательно, понимание механизмов клеточного поглощения НЧ иммунными клетками, такими как моноциты и макрофаги, имеет решающее значение, поскольку оно определяет время жизни наноносителей в соответствующих тканях и биологических жидкостях. Таким образом, возникающая система совместного культивирования клеток in vitro постепенно привлекает все большее внимание в областях наномедицины и токсикологии из-за растущей потребности в достижении более значимых результатов, которые могут лучше отражать состояние in vivo [16]. Действительно, было доказано, что системы совместного культивирования демонстрируют реалистичную ситуацию в имитации состояния здоровых и больных тканей [17] и были надежно использованы в исследованиях клеточного поглощения NP и абсорбции лекарств [18,19,20,21]. Использование совместных культур раковых клеток и моделей иммунных клеток обычно предлагает подходящую платформу для исследования путей и механизмов поглощения этих наноматериалов клетками, что может облегчить создание наноносителей, которые лучше нацелены на раковые клетки, одновременно снижая фагоцитоз NP. Следовательно, очень важно определить эффективность захвата и судьбу НЧ в раковых клетках в присутствии иммунных клеток. Большинство наноносителей были разработаны с диаметром 50–200 нм для использования эффекта ЭПР и продления кровообращения, в то время как более крупные НЧ (> 500 нм), как сообщается, эффективно очищаются с помощью МПС [6]. PLGA, одобренный FDA наноноситель различных размеров (100, 500 и 1000 нм), был выбран, таким образом, для исследования способности поглощения UM-SCC-17A (классической клеточной линии плоскоклеточной карциномы гортани) [22] и THP- 1 (линия острой моноцитарной клетки человека). В нескольких исследованиях in vitro наноносители PLGA применялись для доставки лекарств, убивающих раковые клетки HNSCC в монокультурах [12, 13, 23], это первое исследование, в котором исследуется эффективность захвата и механизм захвата NP иммунными клетками и клетками рака гортани синхронно в модель совместного культивирования с использованием PLGA разных размеров, которая может обеспечить фундаментальную основу для разработки новой безопасной по своей конструкции наномедицины для терапии HNSCC.

Материалы и методы

Материалы

В этом исследовании использовались три коммерчески доступных частицы PLGA (Sigma-Aldrich) с разными размерами, включая 100 нм, 500 нм и 1000 нм. Все частицы были загружены зелеными флуорофорами с длинами волн оптического возбуждения и испускания (ex / em) 460 нм и 500 нм. Все частицы получали в виде порошка и суспендировали в дистиллированной воде с конечной концентрацией 10 мг / мл для дальнейшего использования. Гидродинамические диаметры и дзета-потенциалы трех частиц определяли с помощью динамического рассеяния света (DLS), проводимого с помощью прибора Malvern Zeta Sizer Nano (Malvern Instruments Ltd., Малверн, Великобритания). Исходные суспензии каждой частицы разбавляли 1:100 в 80 мкл дистиллированной воды для измерения DLS. Следуя указаниям производителя, было проведено 3 повторных измерения для каждой частицы.

Культуры клеток UM-SCC-17A и THP-1 и воздействие частиц

Линия клеток карциномы гортани человека UM-SCC-17A и линия клеток моноцитов / макрофагов человека THP-1, приобретенная у Sigma-Aldrich, США и Shanghai Hengya Biotechnology Company (Шанхай, Китай), соответственно, были использованы для создания модели in vitro в эта учеба. Клетки UM-SCC-17A и THP-1 культивировали либо в среде DMEM [22], либо в среде для культивирования клеток RPMI-1640 с добавлением 10% FBS (Gibco, Германия) и 1% раствора пенициллина-стрептомицина (Gibco, Германия) при 37 ° C. ° C с 5% CO2. Клетки THP-1 подвергали воздействию 100 нМ растворов форбол 12-миристат 13-ацетата (PMA) (Sigma, США) в течение 72 часов перед посевом клеток для дифференцировки в макрофаги. Обе клетки пассировали с использованием 0,5% трипсина-ЭДТА каждые 3 дня, и морфологию клеток проверяли каждый день, чтобы убедиться в их здоровье.

Клетки высевали в 24-луночные планшеты плотностью 0,1 × 10 ⁶ . клеток на лунку для монокультурных клеток для анализа WST-1 и LDH или на стерильном покровном стекле в 24-луночных планшетах для флуоресцентной микроскопии. Для модели совместного культивирования клетки UM-SCC-17A сначала высевали в 24-луночные планшеты с плотностью 50 000 на лунку в течение ночи, а затем добавляли 50 000 клеток THP-1 на лунку. Частицы суспендировали в 500 мкл либо соответствующей среды для культивирования клеток для монокультурных клеток UM-SCC-17A и THP-1, либо в смешанной среде для культивирования клеток 1:1 для совместно культивируемых клеток и подвергали воздействию клеточных образцов в течение 24 ч с конечной концентрации 5, 10 и 20 мкг / мл для анализа WST-1 и LDH или 10 мкг / мл для флуоресцентной микроскопии.

Для измерения FACS клетки высевали в 12-луночные планшеты таким же образом, как описано ранее, при плотности 250 000 клеток / лунку или 125 000 клеток / лунку для каждой модели совместного культивирования. Клетки выращивали в 1 мл среды для культивирования клеток в течение ночи и подвергали воздействию частиц PLGA при конечной концентрации 10 мкг / мл в течение 24 часов.

Анализ жизнеспособности клеток

Жизнеспособность клеток определяли с помощью набора реагентов для пролиферации клеток WST-1 (Roche, Германия) согласно инструкциям производителя. Вкратце, раствор WST-1 был разбавлен 1:10 либо соответствующей средой для культивирования клеток для монокультуры UM-SCC-17A или THP-1, либо смешанной средой для культивирования клеток 1:1 для совместно культивируемых клеток. Супернатант сливали после экспонирования, и клетки инкубировали с 500 мкл рабочего раствора анализа WST-1 при 37 ° C в течение 30 мин. Образцы собирали и центрифугировали при 14000 об / мин в течение 10 минут для удаления частиц. Оптическую плотность (ОП) растворов измеряли при длине волны 450 нм с помощью Infinite ^® . F200 (Tecan, США). Значения оптической плотности были скорректированы путем вычитания значения холостого образца, содержащего только рабочий раствор WST-1, и относительная жизнеспособность клеток сравнивалась с необработанным контрольным образцом.

Анализ утечки через клеточную мембрану

Высвобождение лактатдегидрогеназы (LDH) измеряли с использованием коммерческого набора для определения цитотоксичности (LDH) (Roche, Германия) для определения цитотоксичности по частицам PLGA. Супернатант клеток собирали через 24 часа после воздействия, центрифугировали при 14000 об / мин в течение 10 минут и разбавляли 1:10 в 200 мкл полной среды для культивирования клеток. Положительный контроль определяли как общее высвобождение ЛДГ при инкубации клеток с 0,2% Triton X-100 при 37 ° C в течение 15 минут и разведении 1:50 в 200 мкл полной среды для культивирования клеток. Образцы инкубировали со 100 рабочими растворами теста LDH в течение 30 мин при комнатной температуре, и реакцию останавливали, используя 50 мкл 1% HCl. Поглощение на длине волны 492 нм измеряли с помощью Infinite®F200 (Tecan, США), а относительные концентрации ЛДГ рассчитывали согласно следующему уравнению

Флуоресцентная микроскопия

Клетки визуализировали окрашиванием Hoechst для определения местонахождения частиц под флуоресцентным микроскопом. Клетки промывали 3 раза PBS после 24-часовой выдержки частиц и инкубировали с 4% формальдегидом в течение 10 мин при комнатной температуре. После фиксации формальдегидом клетки затем инкубировали с 200 мкл окрашивающего раствора, содержащего разбавленный 1:1000 Hoechst и 1% BSA в PBS в течение 30 мин. Затем покровные стекла перемещали на предметное стекло в перевернутом виде и поддерживали с добавлением капли средства против выцветания флуоресценции DAKO для визуализации. Четыре оптических канала были установлены с помощью флуоресцентного микроскопа, включая яркое поле для морфологии клеток, DAPI для ядер клеток и GFP для частиц. Время экспозиции канала частицы для каждого флуоресцентного изображения регистрировалось и использовалось для гомогенизации интенсивности флуоресценции для разных частиц, а внутриклеточные частицы рассчитывались по интенсивности флуоресценции с использованием случайно выбранных областей с помощью ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij /). Индекс поглощения различными частицами сравнивали между монокультурными или совместно культивированными клетками UM-SCC-17A. Вкратце, средняя интенсивность флуоресценции (MFI) интернализованных частиц была рассчитана, например, в 50 клетках для каждого типа клеток, что было определено как значение вычитания между общей интенсивностью флуоресценции ( I _всего ) определенной области и автофлуоресценции ( I _авто ) области такого же размера в уравнении безчастичной области [24, 25]. Индекс поглощения раковых клеток определяли с помощью MFI UM-SCC-17A, нормализованного к таковому у клеток THP-1 в модели монокультивирования или совместного культивирования. Расчет производился по приведенному ниже уравнению:

Сортировка клеток с активацией флуоресценции (FACS)

Сортировку клеток, активируемых флуоресценцией (FACS), проводили для измерения способности захвата трех частиц. Клетки трижды промывали PBS для удаления клеточной среды и диссоциативных частиц через 24 ч после воздействия и инкубировали с 200 мкл 0,5% трипсина-ЭДТА (Gibco, Германия) при 37 ° C в течение 4 минут для удаления клеток с планшета. . Затем реакцию останавливали добавлением 2 мл полной среды для культивирования клеток, суспензию клеток переносили в стеклянную пробирку для измерения FACS и центрифугировали в течение 5 мин при 300 × G, 4 ° C. Надосадочную жидкость осторожно сливали, клетки суспендировали в 200 мкл PBS и хранили на льду. Сначала живые клетки отделяли от дебриса и мертвых клеток с использованием прямого (FSC-A) -стороннего (SSC-A) рассеяния. Затем совместно культивируемые клетки анализировали с использованием канала APC по сравнению с FSC-A для отделения клеток UM-SCC-17A от макрофагов в зависимости от размера клеток. Для каждого образца было проанализировано всего 30 000 клеток, рассчитана средняя интенсивность флуоресценции для каждой клетки и нормализована по разным частицам. Между тем, после 24 ч инкубации частиц с клетками, супернатант клеточной культуры, промывочный буфер (трехкратная промывка для удаления остаточных частиц, прикрепленных к поверхности клетки) и клетки (трипсинизированное расщепление) были собраны для измерения интенсивности флуоресценции с использованием микропланшета. считыватель (Infinite®F200, Tecan). При таком подходе процент частиц, попавших в клетки, может быть определен для каждой группы, например, около 30 000 частиц, подвергшихся воздействию одной клетки в 12 лунках / планшете (всего 250 000 клеток) при дозировке 5 мкг на 100 нм. Частицы PLGA, в результате чего в среднем 13000 частиц усваиваются отдельными клетками, что составляет около 43% от применяемой дозы, доставленной в клетки. Этот доставленный процент можно в дальнейшем использовать для расчета количества частиц в системе совместного культивирования для каждого типа клеток в FACS.

Количественная оценка слияния ячеек

Слияние макрофагов с многоядерными гигантскими клетками (MGC) было определено как гигантская клетка, морфологически содержащая два или более ядра в пределах нормальной цитоплазмы, которые могут быть четко и синхронно идентифицированы на яркопольных изображениях и флуоресцентных изображениях после окрашивания, как указано в литературе [26] . % P>

Статистический анализ

Программное обеспечение GraphPad V8.0 (GraphPad Software Inc., Сан-Диего, Калифорния, США) использовалось для статистического анализа и визуализации результатов. После одностороннего ANONA применялся метод Холма-Сидака или t-критерий для сравнения результатов для нескольких групп или результатов для двух групп, соответственно. Все эксперименты были выполнены с независимыми троекратными повторениями, и данные были представлены как среднее ± стандартное отклонение (STD). Результаты с p значение <0,05 (*) и p <0,01 (**) считались значимыми.

Результаты и обсуждение

Характеристика частиц сополимера молочной и гликолевой кислоты

Микрофотографии флуоресценции частиц PLGA (рис. 1a, b, c) продемонстрировали устойчивую интенсивность флуоресценции и отсутствие значительного уменьшения сигналов флуоресценции в течение 14 дней после приготовления (дополнительный файл 1:S1), что свидетельствует об относительно однородном распределении по размерам и высокой флуоресценции. стабильность. Как указано поставщиком, частицы PLGA размером 100, 500 и 1000 нм имели размеры примерно 80,6 ± 19,3 нм, 542,6 ± 128,3 нм и 951,9 ± 237,5 нм (рис. 1d, e, f) соответственно. Согласно измерениям дзета-потенциала, средние поверхностные заряды на частицах составили -20,6 ± 5,3, -17 ± 4,6 и -16,5 ± 3,5 с индексом полидисперсности 0,057, 0,056 и 0,062 для 100, 500 и 1000. нм, соответственно, что указывает на их высокую монодисперсность в качестве стандартов. Все частицы встряхивали, а затем обрабатывали ультразвуком на водяной бане в течение 5 минут для значительного устранения агрегации частиц. Однако небольшие пики, соответствующие частицам 100 и 1000 нм, наблюдались при диаметрах около 4–6 мкм из-за неизбежной агрегации частиц в очень малых количествах (около 3–4%).

Характеристика частиц PLGA. Микрофотографии флуоресценции показывают разные размеры ( a 100 нм, b 500 нм и c 1 мкм) частиц PLGA. Эти частицы могут быть обнаружены с помощью оптической микроскопии Olympus, демонстрирующей относительно однородное распределение частиц по размерам в водной суспензии. Измерения динамического рассеяния света (DLS) отображают распределение размеров, взвешенное по объему, для 100 нм ( d ), 500 ( e ), 1 мкм ( f ) Частицы PLGA. Несмотря на небольшую часть агрегации частиц (меньшие пики:3–4%) в суспензиях PLGA размером 100 нм и 1 мкм, общее распределение частиц по размерам довольно однородно из-за узкого основного пика

Оценка жизнеспособности клеток и цитотоксичности

Благодаря своей превосходной биосовместимости и биоразлагаемости частицы PLGA были одобрены FDA и Европейским медицинским агентством для биомедицинских применений [27, 28]. Таким образом, частицы PLGA в настоящее время используются в клинике и широко применяются в доклинических исследованиях в качестве наноносителей, доставляющих лекарства в определенные пораженные области или опухоли. Однако эффективность нацеливания и терапевтическая эффективность частиц PLGA ограничены, по крайней мере частично, иммунной системой. Например, высокий фагоцитоз частиц купферовскими клетками в печени сильно ограничивает проникновение наноносителей лекарств в место опухоли [15]. Следовательно, жизненно важно создать передовые модели in vitro для изучения взаимодействия между раковыми клетками, иммунными клетками и частицами, чтобы лучше имитировать ситуацию доставки лекарств in vivo. UM-SCC-17A - уникальная линия клеток плоскоклеточного рака гортани, выделенная из образца первичного рака гортани [29]. Однако информация об эффективности его клеточного поглощения in vitro в системах совместного культивирования ( например , совместная инкубация макрофагов и раковых клеток) по-прежнему недостаточна, и эту проблему необходимо решить, чтобы улучшить способность прогнозирования ответов in vivo. Более того, было доказано, что размер частиц и покрытие поверхности играют важную роль в способности доставки к солидным опухолям, пораженным участкам и раковым клеткам на животных моделях и культурах клеток [30,31,32,33]. Таким образом, здесь мы применили три размера PLGA к клеткам карциномы UM-SCC-17A, чтобы исследовать влияние размера частиц на клеточное поглощение и внутриклеточное распределение в системах монокультуры и совместного культивирования.

В этом исследовании определялась жизнеспособность клеток с использованием метода WST-1 (4- [3- (4-йодфенил) -2- (4-нитрофенил) -2H-5-тетразолио] -1,3-бензолдисульфоната) для монокультуры THP-1. и клетки UM-SCC-17A, а также совместное культивирование обоих типов клеток. Несмотря на отсутствие очевидной гибели клеток в группах, получавших 100 и 500 нм PLGA при всех тестируемых концентрациях, частицы PLGA размером 500 и 1 мкм в наивысшей концентрации (20 мкг / мл) значительно снижали жизнеспособность клеток в монокультуре UM-SCC-17A. клетки (рис. 2а). Как и ожидалось, жизнеспособность клеток THP-1 существенно не пострадала после 24 ч инкубации со всеми тремя типами PLGA в концентрациях 5–20 мкг / мл (≥ 95% жизнеспособности по сравнению с необработанными клетками, чья жизнеспособность считается 100%). , Рис. 2б). Идентично результатам монокультуры клеток UM-SCC-17A, жизнеспособность клеток в системе совместного культивирования не изменилась из-за присутствия 100 и 500 нм частиц PLGA в трех использованных здесь дозировках, в то время как она значительно снизилась в группе, получавшей 20 мкг / мл 1 мкм PLGA (рис. 2c).

Определение жизнеспособности клеток в монокультуре и совместном культивировании клеток с использованием анализа WST. UM-SCC-17A ( а ) и ячейки THP-1 ( b ) и совместно культивируемых клеток UM-SCC-17A и THP-1 ( c ) обрабатывали различными концентрациями (5–20 мкг / мл) частиц PLGA трех размеров

Оценка цитотоксичности частиц с использованием анализа ЛДГ заключается в определении утечки через клеточную мембрану путем измерения количества внеклеточной ЛДГ [9]. Высвобождение этого цитоплазматического фермента в супернатант клеточной культуры характерно для повреждения клеточной мембраны, что приводит к необратимой гибели клеток. Несмотря на небольшое повышение уровней ЛДГ с более высокими дозировками в монокультурах клеток UM-SCC-17A, обработанных различными дозами 1 мкм PLGA, явной цитотоксичности по отношению к клеткам не наблюдалось даже при самой высокой концентрации 20 мкг / мл (рис. 3a). . Неудивительно, что все три размера PLGA, используемые здесь в различных дозировках, были неспособны вызвать существенное высвобождение ЛДГ в супернатант, что указывает на незначительные токсические эффекты для монокультуры клеток THP-1, что также хорошо согласуется с результатами определения жизнеспособности клеток, описанными выше (рис. . 3b). В экспериментах по совместному культивированию все частицы с разными концентрациями показали превосходную биосовместимость с обеими клетками с точки зрения высвобожденных уровней ЛДГ (рис. 3c). В целом, использованный здесь широкий диапазон размеров частиц от 100 нм до 1 мкм охватывает типичные размеры наноносителей (50–200 нм), таких как липосомы, мицеллы, дендримеры, полимеры и мини-клетки. Этот диапазон также охватывает частицы субмикронного размера (частицы размером 500 нм все еще могут рассматриваться как НЧ, например, частицы размером около 500 нм имеют те же пути клиренса в легких, что и частицы НЧ размером 10–100 нм [34] и размером в микрон 1 мкм. Ни одна из этих частиц PLGA не проявляла очевидной цитотоксичности по отношению к клеткам THP-1 и / или UM-SCC-17A в системах монокультуры и совместного культивирования, за исключением частиц PLGA размером 500 нм и 1 мкм в наивысшей концентрации против UM-SCC- 17A и клетки совместного культивирования (но выживает более 85% клеток), что указывает на то, что они подходят для применения в системах доставки лекарств.

Определение цитотоксичности для клеток монокультуры и совместного культивирования с использованием анализа LDH. UM-SCC-17A ( а ) и ячейки THP-1 ( b ) и совместно культивируемых клеток ( c ) обрабатывали частицами PLGA. Никакой значительной гибели клеток не наблюдалось после 24 часов инкубации частиц (с разными размерами и концентрациями, используемых здесь) и клеток как в системах монокультуры, так и в системах совместного культивирования

Возможности клеточного поглощения PLGA в системах монокультуры и совместного культивирования

На рис. 4 показана морфология клеток (рис. 4a, d, g), ядра клеток и 100 нм НЧ (рис. 4b, e, h), а также объединенные увеличенные изображения (рис. 4c, f, i) в монокультуре и совместной культуре. системы культивирования. В необработанных клетках контрольной группы частиц не наблюдалось (дополнительный файл 1:S2). Массивные крупные агломераты 100 нм PLGA NPs наблюдались в цитоплазме клеток монокультуры макрофагов (рис. 4c). Между тем, монокультура UM-SCC-17A продемонстрировала превосходную способность поглощения 100 нм PLGA, что подтверждается яркими зелеными сигналами флуоресценции, наблюдаемыми внутри клеточной мембраны (фиг. 4f). Чтобы лучше проиллюстрировать внутриклеточное накопление частиц PLGA в клетках THP-1 или UM-SCC-17A и внеклеточных частиц в совместных культурах, были применены наложения изображений яркого поля с изображениями флуоресценции, как в Дополнительном файле 1:S3). В системе совместного культивирования оба типа клеток дифференцируются по морфологии и размеру клеток на изображениях в ярком поле, на которых макрофаги имеют округлую форму и небольшой размер, тогда как раковые клетки имеют большой размер и удлиненную форму. Однако раковые клетки показали недостаточное поглощение клетками из-за высокого поглощения 100 нм PLGA макрофагами в системе совместного культивирования. Это ожидается, потому что макрофаги считаются эффективным и специфическим типом иммунных клеток, выполняющих функцию фагоцитоза для очистки от чужеродных микроорганизмов, аллергенов и частиц. Аналогичным образом, фиг. 5 и фиг. 6 показывают качественный анализ клеточной поглощающей способности частиц PLGA размером 500 нм и 1 мкм в одноклеточных или смешанных культурах клеток, соответственно. Примечательно, что морфология обеих клеток не изменилась после обработки разными размерами частиц PLGA в концентрации 10 мг / мл, использованной здесь (рис. 4a, d, g, рис. 5a, d, g и рис. 6a, г, ж). Частицы PLGA размером 500 нм и 1 мкм демонстрировали более высокую интенсивность флуоресценции в отдельных клетках UM-SCC-17A (рис. 5e, f и рис. 6e, f), чем в отдельных клетках THP-1 (рис. 5b, c и рис. 6б, в). При совместном культивировании (рис. 5h, i и рис. 6h, i) наблюдается явное снижение сигнала в раковых клетках, в которых интенсивность флуоресценции частиц оказалась ниже, чем у макрофагов. Макрофаги фагоцитируют все типы частиц быстро и эффективно, так что раковые клетки не могут проглотить достаточное количество частиц в системе совместного культивирования. Для количественной оценки влияния фагоцитоза на способность раковых клеток к поглощению различных размеров частиц PLGA был проведен полуколичественный оптический анализ. Вкратце, интенсивности флуоресценции частиц рассчитывали на основе, например, 50 отдельных клеток, нагруженных частицами, чтобы получить среднее значение для обоих типов клеток, а индекс поглощения раковых клеток определяли путем усреднения интенсивности внутриклеточной флуоресценции частиц для каждого рака. клетка нормализована к макрофагам (рис. 7). В монокультуре индекс поглощения раковыми клетками для 100 нм PLGA оказался примерно 1,34 ± 0,19, что свидетельствует о том, что раковые клетки поглотили больше частиц, чем те, которые были поглощены макрофагами в одноклеточной культуре (рис. 7). Это неудивительно из-за высокого уровня вязкости частиц PLGA и большего размера раковых клеток гортани. Точно так же PLGA размером 500 нм и 1 мкм также в значительной степени интернализовались раковыми клетками с индексами поглощения приблизительно 1,5 ± 0,25 и 1,4 ± 0,31, соответственно, в монокультуре. Индексы поглощения для крупных частиц существенно снижались (0,59 ± 0,12 и 0,47 ± 0,1) в присутствии макрофагов в системах совместного культивирования. Между тем, идентичные возможности клеточной интернализации для обоих типов клеток после 24 ч инкубации 100 нм частиц PLGA в смешанной культуре клеток. Overall, the results accumulated here suggested that the ingestion of particles by cancer cells and macrophages might depend on different routes of uptake pathway in single-cell culture and co-culture environment. Moreover, the presence of macrophages reduced the cellular internalization of PLGA particles by cancer cells particularly for large ones, a biological event that has been observed in in vivo nanomedicine drug delivery studies [3, 15].

Microscopic examination of cellular internalization of 100 nm PLGA nanoparticles in monoculture and co-culture cells. Single type of cells or mixed cells was treated with 100 nm PLGA nanoparticles for 24 h at 37 °C at a concentration of 10 µg/mL. Cells were observed under bright-field (a , d , г ) and fluorescent channels (b, e, and h) with particles observed at the green channel and cell nuclei in the blue channel after stained with Hoechst. Massive cellular uptake of 100 nm PLGA nanoparticles can be visualized in magnified images (c , f , i ) for monoculture THP-1 macrophages (yellow arrows) and laryngeal cancer cells UM-SCC-17A (red arrows). In the co-culture system, 100 nm PLGA nanoparticles were still highly ingested by macrophages but less efficient for cancer cells compared to single cultured cells

Microscopic examination of cellular internalization of 500 nm PLGA nanoparticles in monoculture and co-cultured cells. Single type of cells or mixed cells was treated with 500 nm PLGA nanoparticles for 24 h at 37 °C at a concentration of 10 µg/mL. Cells were observed under bright-field (a , d , г ) and fluorescent channels (b , e , ч ) with particles observed at the green channel and cell nuclei in the blue channel after stained with Hoechst. Massive cellular ingestion of 500 nm PLGA nanoparticles can be visualized in magnified images (c , f , i ) for monoculture THP-1 macrophages (yellow arrows) and laryngeal cancer cells UM-SCC-17A cells (red arrows). In the co-culture system, 500 nm PLGA nanoparticles were still highly uptake by macrophages, while cancer cells had inadequate particle internalization

Microscopic examination of cellular internalization of 1 µm PLGA particles in monoculture and co-culture cells. Single type of cells or mixed cells was treated with 1 µm PLGA particles for 24 h at a concentration of 10 µg/mL. Cells were observed under bright-field (a , d , г ) and fluorescent channels (b , e , ч ) with particles observed at the green channel and cell nuclei in the blue channel after stained with Hoechst. A large amount of particle uptake and tremendous accumulation of 1 µm PLGA particles can be visualized in magnified images (c , f , i ) for monoculture THP-1 (yellow arrows) and UM-SCC-17A laryngeal cancer cells (red arrows). In the co-culture system, 1 µm PLGA particles were still efficiently uptake by macrophages, while cancer cells had insufficient particle ingestion

Quantitative analysis of PLGA particle internalization in UM-SCC-17A cells in monoculture and co-culture systems. The percentage of particle fluorescent intensity in UM-SCC-17A cells normalized to that in THP-1 cells for solely and mixed cultured cells

Quantification of cellular uptake by flow cytometry

Flow cytometry is widely used to determine of particle-cell interplay in a quantitative manner, for example, the size-dependent uptake of polystyrene particles with sizes ranging from 20 to 1000 nm by dendritic cells in vivo [35]. FACS was thus utilized for analysis of the percentage of NP-positive cells and particle number in those NP-positive cells in monoculture and co-culture systems. Then, average NP counts in a single cell were calculated by determining the total fluorescence intensity in particle-laden cells normalized to the fluorescence of total applied dose. For example, about 70% of 500 nm PLGA was deposited in the cancer cells, whereas the residual was kept in the supernatant of cell cultures (Additional file 1:S4). This fluorescence intensity measured by a Tecan reader was then compared to the average/total FACS signals (FITC signal values of P5 and P6 in Fig. 8,) to estimate the particle number in the co-culture system. As seeded in the co-cultured cells, about half of the cells were recognized as macrophages and the rest were considered as cancer cells. It was observed that approximately 13,000 of single 100 nm PLGA particles accumulated in cancer cells and 9700 particles in macrophages (Fig. 8i) in the monoculture, consistent with the above microscopic examinations. A much lower particle number (164 ± 30 and 45 ± 15) was ingested by monocultured cancer cells for 500 nm and 1 µm PLGA, with a slightly lower particle count in the respective macrophages (Fig. 8i). The number of particles ingested by single cells is in great agreement with the literature records [24]; for instance, an average 2500 of gold NPs coated with cetyltrimethylammonium bromide were deposited in epithelial cells, while PEG-modified gold NPs only had a few tens per cell [36]. In co-culture systems, unexpectedly, there is a slight increase of 100 nm particle number in cancer cells, despite a higher enhancement of NP internalization by macrophage. Comparing to the uptake index in the single-cell to mixed cell culture, it also reduces about 25% for 100 nm PLGA particles. The uptake indices were found to significantly decline with around 2.5 and 3 folds reduction in co-cultured system for 500 nm and 1 µm PLGA, respectively (Fig. 8i). Generally, it was found that the existence of macrophages largely affects the uptake ability of cancer cells especially for large particles, which is also in excellent agreement with the above observations.

Particle uptake quantification in monoculture UM-SCC-17A cells and co-culture with THP-1 cells by flow cytometry. Grating strategy to identify respective cell populations in mixed cell culture (a –h ). Gating is showing one representative experiment of cells exposure to 500 nm PLGA particles. With initial live gating in the y-axis with a side scatter (SSC-A) and x-axis with a forward scattering (FSC-A), P2 a were further gated with FSC-A versus APC-A to differentiate the THP-1 cells in P4 c from UM-SCC-17A cell population in P3 (monoculture cells (b ) and mixed cells (c )). The cell population of P3 further displayed as counts versus FITC plots (P5) in non-exposed cells (d ), monoculture cells (e ), and co-cultured cells (h ). Also, P6 is the counts versus FITC-A plot originated from P4 population in non-exposed cells (g ) and co-cultured cells (f ). Both types of cells efficiently ingested the 500 nm PLGA indicated by the solid histogram completed shifted to the right side of the x -axis, indicating particles are taken up by all exposed cells. Quantification of particle-laden numbers (i ) in both types of cells for mono-culture and co-culture systems

Currently, different uptake pathways by cancer cells in ingesting particles with different sizes and surface modifications like clathrin-mediated endocytosis, caveolae-mediated endocytosis, clathrin- and caveolae-independent endocytosis, micropinocytosis, and macropinocytosis have been claimed in the literature [37]. For instance, it has been proved that iron oxide aggregates with a size of < 200 nm are taken up by MCF-7 cells through the clathrin-mediated endocytosis, whereas larger aggregates tend to be ingested via macropinocytosis [38]. Another study has demonstrated that 100 nm plain polystyrene particles tended to be taken up mainly through macropinocytosis, whereas the internalization of carboxylated polystyrene particles prefer to occur via the clathrin-mediated endocytic route [25]. Phagocytosis is a classical uptake pathway for immune cells such as neutrophils, dendritic cells, and most importantly monocytes/macrophages. The uptake pathways tightly depend on various parameters of drug delivery vesicles, e.g. , the particle size, chemical composition, surface modification, proteins in the culture environment, as well as cell type. Usually, multiple uptake pathways can be involved in particle ingestion such as the caveolae-mediated endocytosis, clathrin-mediated endocytosis, and macropinocytosis, which has been found to participate in cellular internalization of 300–400 nm chitosan NPs in human HeLa cells [39]. It has also been observed that 63 nm cholesterol-modified pullulan NPs enter into the human hepatocellular carcinoma (HepG2) cells via macropinocytosis and clathrin-mediated endocytosis [40]. Several previous studies showed that PLGA particle cell uptake involves different endocytic pathways, in which clathrin-independent endocytosis is the main route responsible for the internalization of PLGA in in vitro models [23, 24, 37]. Nevertheless, once they entered into the cells, PLGA particles applied here were highly potentially entrapped by the endo-lysosomal system consisting of early endosomes, recycling endosomes, late endosomes, and lysosomes [41]. It should be noted, however, that there is a lack of studies showing the cellular uptake mechanisms in co- or tri-cultured systems in vitro, a notion that has to be probe in the future.

Induction of cell fusion by PLGA NPs

Extensive scientific evidence has shown that the fusion of monocytes/macrophages into multinucleated giant cells (MGCs) occurred in a broad range of biological processes [42, 43]. Generally, implantation of biomaterials into the body causes a foreign body response characterized by the fusion of macrophages into MGCs and fibrotic encapsulation [44]. A wide type of human and murine primary cells like alveolar macrophages, splenic macrophages, microglia, bone-marrow-derived macrophages, and blood monocytes, as well as cell lines such as RAW264.7 and UG3 were also frequently observed to form MGCs in vitro [26, 45]. It is well-known that the macrophages form a fusogenic phenotype when they are unable to ingest foreign materials via phagocytosis because of the large size of particles or implants. So far, it is unclear whether in vitro macrophage cell fusion relates to the particle size in the range 100–1000 nm, which can be easily phagocytized. Here, the cell fusions were observed in all groups by microscopic examination (Fig. 9). The cellular fusion was confirmed only when multiple nuclei were found to share the same cytoplasm in both fluorescence images and bright-field images. Spontaneous formation of giant cells by THP-1 cells was occurred in the control group without particle treatment (Fig. 9a), with a fusion percentage of about 10% of the total cells (Fig. 9h), as reported in the literature [46]. Size-dependent cellular fusion was found for 100 and 500 nm PLGA particles, whereas 1 µm PLGA-induced insignificant enhancement of fusions in monoculture. This may be due to the small number of 1 µm PLGA particles exposed to cells (approximately 60 particles exposed to each cell at a concentration of 10 µg/mL). When the macrophages were co-cultured with cancer cells, the percentages of MGC formation were increased in all groups in comparison with the corresponding monoculture groups. In particular, there is a significant increment of cellular fusion for 1 µm PLGA (19%) in the mixed cell culture. The most prominent increase in fusion occurred in co-cultured 500 nm PLGA particles, which might be attributed to the large size of particles and sufficient particle numbers ingested per cell.

Visualization and quantification of THP-1 cell fusion in monoculture and co-culture systems. Cell fusion occurred in all groups including the control group without particle treatment for THP-1 cells (a ). Monocultured (b , c ) 100 nm and 500 nm NP-induced significant cell fusion compared to 1 µm PLGA group (d ), which has a slightly higher level than that of the control group. In co-cultured systems, 100 nm (g ) and 1 µm (e ) PLGA had an identical percentage of cellular fusion, which is apparently smaller than that of 500 nm group (f ). Quantification of cell fusion for all groups after 24 h incubation was displayed in h

The molecular machinery involved in macrophage fusion has been widely probed, achieving substantial progress [43]. For example, the formation of macrophage fusion receptors CD47and CD44 together allowed mediating the process of macrophage fusion, and subsequent the differentiation of giant cells [42] and miR-223 delivery by a NP vesicle permitted attenuating it [47]. Hence, further study should focus on the determination of key molecules in regulating particle-induced macrophage fusion and the dominant receptors expressed in the giant cell membrane. Another important concern is the fate of MGCs. It is believed that MGCs fused with particles or stimuli might subsequently experience the process of apoptosis or necrosis [48]. This may lead to the release of undigested particles or other giant materials to the other cells in vitro or biological tissues in vivo, further inducing the long-term inflammatory response or granulomas. On the other hand, the macrophage fusion itself may be benefit for NP drug delivery, for example, in tumorous tissues, the re-release of drugs from macrophages to the cancer cells might represent an enhanced tumor killing ability. More importantly, future nanomedicine study should address how to exploit the application of macrophage fusion for nanocarrier drug delivery to improved disease diagnosis and therapy. This is because not only macrophages an abundant type of immune cells in the body with the excellent uptake ability of nano-drugs, but also they may be used in targeted gene delivery for repair of injured tissues.

Conclusion

To the best of our knowledge, this study first reported the competitive cellular uptake of PLGA particles with sizes ranging from 100 nm to 1 µm in co-cultured UM-SCC-17A laryngeal cancer cells and THP-1 monocytes/macrophages. The data collected here proved that immune cells may alter/lower the particle internalization by cancer cells in vitro, which is similar to the previous findings in in vivo nanocarrier drug delivery studies. Size-dependent and cell culture-related macrophage cellular fusion caused by PLGA particles has also been demonstrated here. Future studies should probe the uptake mechanism in co-cultured systems and design novel approaches to achieve a higher uptake index for laryngeal cancer cells in the presence of phagocytes. Moreover, elaborate evaluation of intracellular trafficking and fate of nano-drug-carriers in co- or tri-cultured systems in 3D, which better mimic the in vivo conditions, is needed prior to the utilization of animal studies in vivo and even in clinical trials.

Доступность данных и материалов

Все данные, полученные или проанализированные в ходе этого исследования, включены в эту опубликованную статью [и файлы с дополнительной информацией к ней].

Сокращения

PLGA:

Poly(lactic-co-glycolic acid)

HNSCC:

Head and neck squamous cell carcinoma

EPR:

Enhanced permeability and retention

НП:

Наночастицы

ICG:

Indocyanine green

MPS:

Mononuclear phagocyte system

LDH:

Лактатдегидрогеназа

FACS:

Fluorescence-activated cell sorting

MGC:

Multinucleated giant cells

DLS:

Динамическое рассеяние света