Нанолипосомы, украшенные моноклональными антителами PD-L1, загруженные паклитакселом и ингибитором транспорта P-gp для синергической химиотерапии против рака желудка с множественной лекарственной устойчивостью

Введение

Современные химиотерапевтические методы лечения, основанные на схеме приема одного лекарства, далеки от совершенства и страдают от серьезных побочных эффектов при приеме более высоких доз и одновременно приводят к развитию лекарственной устойчивости [1]. Последнее десятилетие засвидетельствовало высокую терапевтическую эффективность комбинированного режима лечения рака [2]. Было продемонстрировано, что комбинация двух или более препаратов дает синергетическую противораковую эффективность из-за различного фармакологического действия комбинированных препаратов [3, 4]. Однако выбор правильной комбинации лекарств зависит от множества факторов, включая тип раковых клеток, гидрофильные / гидрофобные препараты, биохимическую активность и фармакокинетические характеристики лекарств. Среди всего прочего, комбинация лекарств избирательна в отношении определенных типов рака [5].

Рак желудка - это глобальное бремя для здоровья и вторая по частоте причина смерти от рака во всем мире. Распространенность рака желудка высока в Восточной Азии, например, в Японии, Корее и Китае, где в последних зарегистрирован самый высокий уровень смертности в мире [6]. В среднем в Китае ежегодно регистрируется 400 000 новых случаев, и большинство случаев диагностируется на поздних / поздних стадиях [7, 8]. Огромный прогресс был достигнут в стратегиях лечения; однако это не улучшило выживаемость и привело к неэффективности терапии. Неудача лечения в основном объясняется развитием химиорезистентности и тяжелой токсичностью дозы химиотерапии, а также рецидивом эпизода рака желудка [9]. Поэтому актуальной задачей является повышение терапевтической эффективности и преодоление метастазов и рецидивов рака желудка.

Паклитаксел (PTX) - одно из важных лекарств, показанных при лечении рака желудка [10]. PTX подавляет репликацию клеток, препятствуя деградации микротрубочек, что приводит к остановке клеточного цикла. Однако приобретение множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) является основным препятствием на пути к успеху химиотерапии [11, 12]. АТФ-зависимый отток, опосредованный трансмембранными переносчиками семейства АТФ-связывающих кассет (ABC), в которых р-гликопротеин (p-gp) считается фактором изобилия, сверхэкспрессируется при язве желудка [13]. С другой стороны, PTX служит субстратом для рецепторов p-gp, где отток лекарственного средства снижает внутриклеточную концентрацию лекарственного средства, что приводит к низкой эффективности и высокой резистентности [14]. В этом отношении тареликвидар (TQD) является мощным ингибитором p-gp третьего поколения и, как сообщается, обращает вспять сверхэкспрессию рецепторов p-gp в некоторых раковых клетках [15, 16]. Однако сообщения предполагали, что введение TQD должно быть прекращено как можно раньше, поскольку это препятствует функции p-gp нормальной физиологической системы. Экспрессия P-gp необходима для поддержания гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) и удаления токсинов из нормальных тканей [17]. Поскольку p-gp присутствует в нормальных тканях и действует как барьер против клеточных токсинов, неспецифическое ингибирование PTX или TQD может потенциально нарушить нормальные физиологические функции и привести к неблагоприятной токсичности. Кроме того, PTX и TQD являются высоколипофильными лекарствами с ограниченной растворимостью в водных растворах и системной крови, что требует наличия стабильной системы доставки лекарств, нацеленной на рак желудка в организме [18].

Система доставки лекарств (DDS) значительно увеличивала концентрацию инкапсулированных лекарств в раковых тканях и обеспечивала замедленное высвобождение лекарства в течение длительного периода времени [19]. В связи с этим липосомы являются одним из широко используемых носителей лекарств для повышения терапевтической эффективности при раке. Липосомы приобрели все большее значение из-за их биосовместимости, структурных модификаций поверхности, гидрофильной / липофильной нагрузки лекарственного средства и высокой способности загружать лекарственное средство [20]. Лекарства могут быть стабильно включены в липидный бислой липосом и легко наделены способностью к длительной циркуляции (ПЭГилирование) за счет усиленного эффекта проницаемости и удерживания (EPR) [21]. Недавно сообщалось, что липосомы обладают способностью сохранять различные соотношения лекарств после внутривенного введения [22]. Эта идея была продемонстрирована в 2017 году после одобрения FDA препарата Vyxeos® (липосомальный препарат), содержащего соотношение цитарабин:даунорубицин, для лечения лейкемии [23]. По сравнению с нецелевыми препаратами препараты, нацеленные на лиганд, были очень привлекательными и перспективными. В этом отношении PD-1 представляет собой рецептор клеточной поверхности, известный своей подавляющей регуляцией иммунной системы и подавляющей воспалительную активность Т-клеток. Экспрессия PD-L1 была обнаружена у 50% пациентов с раком желудка, использующих PD-L1 в качестве целевого рецептора для интернализации наночастиц [24, 25]. Моноклональные антитела (mAb) к PD-L1 могут специфически связываться с внеклеточным доменом белка PD-L1 и могут быть отличной терапевтической стратегией для повышения противоопухолевой эффективности [26].

Основная цель настоящего исследования заключалась в улучшении доставки комбинационных препаратов, PTX и TQD для повышения противоопухолевой эффективности против рака желудка. Для этой цели был составлен состав PD-L1 / нанолипосомы, нагруженный PTX и TQD, и была проведена оценка их противоопухолевой эффективности в условиях in vitro и in vivo. Эффективность in vivo оценивалась на модели ксенотрансплантата на основе клеток рака желудка и проводилась иммуногистохимия (ИГХ).

Заключение

В заключение, наша работа реализовала комбинированную терапию против опухоли МЛУ по стратегии запрограммированной доставки. Мы продемонстрировали потенциал комбинации PTX и ингибитора p-gp (TQD) в подавлении опухолевой нагрузки ксенотрансплантатов SGC7901 / ADR с множественной лекарственной устойчивостью. Совместная доставка PTX и TQD в многофункциональном наноносителе позволила рационально контролировать совместно загруженные противоопухолевые препараты, подавила отток p-gp и продемонстрировала синергетическую противораковую эффективность. Мы считаем, что комбинация противоопухолевого препарата с ингибитором p-gp может обеспечить потенциальное направление к лечению лекарственно-устойчивых опухолей.

Материалы и методы

Состав нанолипосом, конъюгированных с PD-L1 mAb, PTX / TQD

Яичный фосфатидилхолин (EPC), 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE), 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N- [метокси (полиэтиленгликоль) -2000] ( DSPE-PEG) и DSPE-PEG2000-малеимид (DSPE-PEG2000-Mal), смешанные в растворе хлороформа в молярном соотношении 3/2 / 0,5 / 0,25 вместе с PTX и TQD, а затем органический растворитель выпаривали с использованием роторного испарителя. с последующей сушкой вымораживанием в течение 3 часов. Липидную пленку гидратировали 250 мМ раствором сульфата аммония, поддерживаемым при pH 7,0. Большие многослойные липосомы обрабатывали ультразвуком в течение 30 минут в ультразвуковом устройстве типа ванны (Branson ultrasonicbath, США), поддерживаемом при температуре 65 ° C. Липосомы диализовали против большого объема дистиллированной воды строго в течение 1 ч для обмена свободного лекарственного средства и исходных компонентов. Липосомы повторно диспергировали в фосфатно-солевом буфере (PBS, pH 7,4). MAb PD-L1 конъюгировали с липосомами путем смешивания в соотношении 8:1 (липосомы:mAb) и инкубировали при 4 ° C в течение 4 часов. MAb к PD-L1 будет конъюгировано с DSPE-PEG2000-Mal путем взаимодействия между сульфгидрильными остатками на антителах к С-концевым малеимидным группам липосом. Липосомы, конъюгированные с PD-L1, центрифугировали при 10000 об / мин в течение 10 мин, супернатант удаляли, повторно диспергировали в буфере PBS и хранили при 4 ° C до дальнейшего анализа. Количество PTX и TQD, инкапсулированных в липосомах, оценивали методом ВЭЖХ. В исследовании использовалась система ВЭЖХ Agilent Technologies 1260 Infinity, оснащенная автоматическим пробоотборником Agilent Technologies и диодно-матричным детектором G1315D. Подвижная фаза состоит из смеси ацетонитрил / вода (70:30 об. / Об.), Поддерживаемой при скорости потока 1 мл / мин. Колонку C18 (5 мкм, 150 × 60 мм, ODS-3) использовали для элюирования образцов и детектирования при 227 нм. Перед этим липосомы, нагруженные PTX / TQD, растворяли в ацетонитриле и встряхивали в течение 15 минут, фильтровали через фильтр 0,45 мкм и 10 мкл аликвоты вводили в колонку для ВЭЖХ.

Анализ распределения размеров и морфологии частиц

Распределение по размерам и дзета-потенциал составов, содержащих лекарственное средство, определяли с помощью Malvern zetasizer (Великобритания) при 25 ° C. Перед фактическим экспериментом дисперсии наночастиц разбавляли в 10 раз дистиллированной водой, и эксперимент проводился при угле обнаружения 90 ° в трех повторностях. Морфологию наночастиц оценивали с помощью просвечивающего электронного микроскопа (ПЭМ). Дисперсии наночастиц разбавляли в 10 раз дистиллированной водой и помещали в покрытую углеродом медную сетку и сушили с использованием ИК-лампы, а затем образец оценивали с помощью ПЭМ (CM 30, Philips (Эйндховен, Нидерланды)) после окрашивания уранилацетатом. (1% масс. / Об.)

Анализ профиля выпуска

Профиль высвобождения PTX и TQD из нанолипосом оценивали методом диализа. Для этого 15 мг лиофилизированного порошка PTX, конъюгированного с PD-L1 mAb, и нанолипосом, нагруженных TQD (PD-PTLP), растворяли в 1 мл дистиллированной воды и герметично закрывали диализной мембраной (MWCO 3,5 кДа) и погружали в 30 мл соответствующего буфера для высвобождения, поддерживаемого при 37 ° C. В заранее установленное время отбирали аликвоты образцов и заменяли их равным количеством буфера для высвобождения. Продолжительность исследования 72 часа. Образцы фильтровали через шприцевой фильтр 0,22 мкм и вводили в колонку для ВЭЖХ и оценивали с помощью метода, упомянутого выше.

Исследования клеточной активности

Клетки SGC7901 / ADR культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% FBS, 100 МЕ / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина в условиях 5% CO ₂ атмосфера при 37 ° C. Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп (BX61WI; Olympus, Токио, Япония) использовали для оценки клеточного распределения и клеточного поглощения PTLP и PD-PTLP в клетках SGC7901 / ADR. Для достижения этой цели 1 × 10 ⁵ клетки высевали в каждую лунку 12-луночного планшета и инкубировали в течение 18 часов. Затем клетки подвергали воздействию PTLP и PD-PTLP и инкубировали в течение 3 часов. Клетки трижды промывали холодным PBS и фиксировали 4% параформальдегидом (PFA) в течение 10 мин. Клетки снова промывали PBS и окрашивали 4,6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) в течение 10 мин. Наконец, клетки тщательно промывали и наблюдали под CLSM. Конкурентный эксперимент по поглощению PD-PTLP проводили путем предварительной обработки клеток свободными mAb против PD-L1 в течение 30 мин и промыванием. Клетки были разделены на две группы:одну обрабатывали свободным mAb PD-L1, а другую не обрабатывали свободным mAb PD-L1. Клетки инкубировали с PD-PTLP и инкубировали в течение 3 часов, и тот же метод использовался для оценки анализа клеточного поглощения.

Экспрессия белка с помощью Вестерн-блоттинга

Клетки SGC7901 / ADR высевали в 6-луночный планшет с плотностью посева 3 × 10 ⁵ . клеток / лунку и инкубируют 18 ч. Клетки обрабатывали различными препаратами (PTX, TQD, PTLP, PD-PTLP) и инкубировали в течение 24 часов. Клетки промывали и экстрагировали буфером для очистки и лизировали с использованием стандартного буфера для лизиса (Santa Cruz Biotechnology, Санта-Крус, Калифорния, США). Клетки центрифугировали при скорости 12000 об / мин в течение 15 минут, супернатант собирали и количественное определение белка проводили с использованием анализа белка BCA (Beyotime). Равное количество белков загружали в 8% гель SDS-PAGE и затем переносили на нитроцеллюлозную мембрану (EMD Millipore, Billerica, MA, USA). Мембрану блокировали 5% обезжиренным молоком в течение 1 ч для ингибирования неспецифических сайтов связывания. Мембрану инкубировали с первичными антителами (p-gp и GAPDH, 1:1000, Abcam, MA, USA) при 4 ° C в течение ночи. Мембрану промывали TBST и снова инкубировали со вторичными антителами козьих антител против кроличьих или мышиных антител, меченных пероксидазой хрена (кроличьи или мышиные, 1:10 000, Abcam, Массачусетс, США) при комнатной температуре. Мембраны снова промывали TBST. Блоты визуализировали методом усиленной хемилюминесценции (EMD Millipore).

Анализ цитотоксичности in vitro

Цитотоксический эффект отдельных лекарств и составов оценивали с помощью МТТ-анализа. Вкратце, раковые клетки были наслоены с плотностью 1 × 10 ⁴ клеток / лунку в 96-луночном планшете и инкубируют в течение 18 часов. Затем клетки обрабатывали свободным PTX, TQD, PTLP и PD-PTLP, соответственно, в течение 24 часов. Затем клетки тщательно промывали и добавляли 15 мкл раствора МТТ с концентрацией 5 мг / мл и подвергали дополнительной инкубации в течение 3 часов, а затем добавляли 100 мкл ДМСО для экстракции кристаллов формазана. Результирующее поглощение измеряли при 570 нм с использованием автоматического считывающего устройства для микропланшетов. Жизнеспособность клеток рассчитывают как OD тестовой группы / OD контроля × 100%. Комбинированный индекс был оценен Calcusyn ^TM программное обеспечение. Все эксперименты были выполнены в трех экземплярах.

Анализ апоптоза и активных форм кислорода in vitro

Для анализа апоптоза раковые клетки наслаивали с плотностью 2 × 10 ⁵ клеток / лунку в 12-луночном планшете и инкубируют в течение 18 часов. Затем клетки обрабатывали свободным PTX, TQD, PTLP и PD-PTLP, соответственно, в течение 24 часов. Клетки экстрагировали стриппингом и центрифугировали, а осадки повторно диспергировали в 100 мкл связывающего буфера. Клетки совместно окрашивали комбинацией 5 мкл аннексина-V / FITC и 2,5 мкл рабочего раствора PI и инкубировали в течение 15 мин. Окрашенные клетки анализировали проточным цитометром с использованием BD FACS Calibur (BD Biosciences, Калифорния, США). Аннексин-V и ИП представляют собой индикатор раннего и позднего апоптоза, основанный на структурных компонентах живых и мертвых клеток, соответственно.

2,7-дихлорфлуоресцина диацетат (DCFH-DA) использовали в качестве зонда для анализа активных форм кислорода (ROS). Для количественного анализа 1 × 10 ⁴ клеток на лунку высевали в 96-луночный планшет с черным дном и инкубировали в течение 18 часов. Затем клетки обрабатывали свободным PTX, TQD, PTLP и PD-PTLP, соответственно, в течение 24 часов. Клетки промывали буфером PBS, а затем инкубировали с 1 мл раствора DCFH-DA в соответствии с рекомендациями производителя в течение 30 минут. Затем клетки лизируют и центрифугируют при 10000 об / мин в течение 15 мин. Полученный супернатант переносили в новый 96-луночный планшет и измеряли флуоресценцию при 485 нм, используя автоматический ридер для микропланшетов. Одновременно отдельный набор клеток обрабатывали аналогичным образом, и изображения наблюдали с помощью флуоресцентного микроскопа (Nikon A1, Япония).

Противоопухолевая эффективность PD-PTLP в модели ксенотрансплантата

Исследование противоопухолевой эффективности проводили на голых мышах BALB / c и получали из Центра лабораторных животных Четвертой дочерней больницы Харбинского медицинского университета, Харбин. Все эксперименты на животных проводились в соответствии с национальными стандартами качества лабораторных животных. Эксперименты проводились в строгом соответствии с правилами Комитета по экспериментальным животным Четвертой дочерней больницы Харбинского медицинского университета, Харбин. Животным подкожно вводили 1 × 10 ⁶ Клетки SGC7901 / ADR в 150 мкл культуральной среды на правом боку мышей. Опухолям давали возможность вырасти до 100 мм ³ перед фактическим экспериментом. Мыши были равномерно разделены на пять групп по восемь мышей в каждой группе. Индивидуальная доза PTX и TQD была фиксированной на уровне 5 мг / кг, тогда как в комбинации использовалась общая доза 5 мг / кг. Инъекции в хвостовую вену производились каждые 3 дня, всего было выполнено три инъекции. В заранее определенные дни измеряли объем опухоли и массу тела. Объем опухоли рассчитывали путем измерения наибольшего и наименьшего диаметров опухолей с помощью цифрового штангенциркуля. Объем опухоли ( V ) =½ × длина × ширина (мм) ² . В конце исследования мышей умерщвляли, опухоль извлекали и взвешивали. Опухоль подвергали иммуногистохимическому (ИГХ) анализу. Опухоли были извлечены, нарезаны тонкими кусочками и зафиксированы в 10% растворе формалина. Опухоли заливали парафином, а затем проводили анализ TUNEL в соответствии с инструкциями производителя.

Биохимический анализ сыворотки

Мышам вводили соответствующие препараты; Спустя 24 часа мышей умерщвляли и собирали образцы крови как у контрольных, так и у опытных групп животных. Сыворотка отделяется от цельной крови и хранится при -80 ° C до дальнейшего анализа. Биохимический анализ сыворотки был проведен для оценки работы печени. Аспартаттрансаминаза (AST) и аланинтрансаминаза (ALT) были измерены для оценки функции печени. Все измерения были выполнены в соответствии с процедурами анализа биохимического набора.

Результаты и обсуждение

Получение и характеристика нанолипосом, конъюгированных с PD-L1, нагруженных PTX / TQD

PTX широко используется в клиниках и в первую очередь показан при лечении рака желудка. Однако большинство пациентов, по-видимому, страдают от плохого терапевтического ответа из-за множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) рака желудка. Увеличение дозы PTX привело к увеличению системной токсичности, в результате чего МЛУ стал основным препятствием на пути успешного лечения рака. Считается, что среди множества механизмов MDR опосредованный p-gp отток лекарств является в первую очередь ответственным за лекарственную устойчивость раковых клеток [27]. Поэтому в этом исследовании мы использовали второй препарат (TQD) в качестве ингибитора p-gp для преодоления феномена MDR в раковых клетках и повышения противоопухолевой эффективности PTX. Мы тщательно изучили массовые доли двух препаратов, в которых они проявляют синергетический эффект. Чтобы максимизировать противораковый эффект, важно совместно доставлять несколько лекарств в одной системе наночастиц. Доставка двух лекарств (PTX и ингибитор p-gp) одновременно позволит эффективно подавить механизм оттока лекарств и увеличить вероятность повышения внутриклеточных концентраций в раковых клетках [28]. С этой целью в этом исследовании мы загрузили два препарата в липидный бислой нанолипосом, которые считаются чрезвычайно стабильными в системном кровообращении (рис. 1). Для достижения повышенного опухолеспецифического нацеливания нанолипосомы конъюгировали на поверхности с mAb PD-L1. Малеимидная группа, присутствующая в нанолипосоме, будет связываться с тиольной группой PD-L1 mAb и образовывать стабильную ковалентную связь. Но возможное ограничение конъюгации малеимида состоит в том, что реакция обратима:продукт может вступать в реакции присоединения ретро-Михаэля с биологическими тиолами в плазме, что может приводить к высвобождению малеимида. Однако мы преодолели такую ​​реакцию за счет максимальной поверхностной конъюгации антитела на липосоме малеимид. Сообщалось, что нацеленный на опухоль лиганд будет специфически доставлять терапевтическую нагрузку в опухолевые ткани и избегать ненужных побочных эффектов в нормальных тканях. Ранее Patel et al. сообщили, что включение ингибитора p-gp с PTX может преодолеть MDR в клетках рака яичников в условиях in vitro [11]. Аналогичным образом Zou et al. и Zhang et al. сообщили, что цитотоксичность PTX в отношении клеток с множественной лекарственной устойчивостью SKOV-3TR и A2780-Adr значительно увеличивалась в присутствии Таривикара. Однако в этих исследованиях использовалась либо физическая комбинация PTX + TQD, либо был разработан нецелевой носитель [29, 30]. Важно отметить, что все эти исследования проводились только в условиях in vitro. Настоящее исследование сосредоточено на разработке нацеленного наноносителя с использованием относительно нового класса нацеливающего агента, антитела PDL1. Кроме того, настоящее исследование продемонстрировало эффективность PTX + TQD на модели опухоли ксенотрансплантата, а также оценило параметры крови, связанные с системной токсичностью.

Схематические иллюстрации загрузки паклитаксела и тариквитара в нанолипосомы, конъюгированные с поверхностью моноклональных антител (mAb) PD-L1. Липосомы были приготовлены путем гидратации тонкой липидной пленки и обработаны ультразвуком для образования нанолипосом, содержащих лекарство

Средний размер частиц PTLP составлял 135,6 ± 1,26 нм, тогда как он увеличивался до 168,59 ± 1,34 нм после конъюгации с PD-L1 mAb (PD-PTLP). Размер частиц увеличился из-за большой молекулярной массы mAb PD-L1; Тем не менее, следует отметить общий размер менее 200 нм и сферическую форму (рис. 2а). Размер наночастиц менее 200 нм будет способствовать большему накоплению в опухолевых тканях благодаря усиленному эффекту проницаемости и удерживания (EPR). Кроме того, присутствие ПЭГ позволит продлить время циркуляции крови в большом круге кровообращения. Дзета-потенциал PD-PTLP составлял 22,1 ± 1,21 мВ, что не допускает неспецифического связывания с компонентами крови. PD-PTLP показал высокую эффективность захвата ~ 95% для обоих препаратов (PTX и TQD). PD-PTLP также продемонстрировал высокую лекарственную нагрузку, составляющую 12–14% мас. / Мас. Для PTX и TQD, соответственно (рис. 2b).

Физико-химическая характеристика нанолипосом, конъюгированных с PD-L1, нагруженных PTX / TQD. а Анализ морфологии PD-PTLP с использованием просвечивающего электронного микроскопа (ТЕМ). б Лекарственная нагрузка ПД-ПТЛП. c Высвобождение PTX и TQD из PD-PTLP in vitro в буферных условиях pH 7,4 и буферных условиях pH 5,0 при 37 ° C. ** p <0,01 - статистическая разница в высвобождении лекарственного средства между буферами с pH 7,4 и pH 5,0

Высвобождение лекарства in vitro

Поведение высвобождения PTX и TQD из PD-PTLP изучали в условиях pH 7,4 и pH 5,0 при 37 ° C. Как показано на фиг. 2c, контролируемое высвобождение лекарств (PTX и TQD) наблюдалось из PD-PTLP на протяжении всего периода исследования (72 часа). Высвобождение лекарства из толстого бислоя нанолипосомы может быть ответственным за медленное и продолжительное высвобождение двух лекарств из PD-PTLP. Следует отметить, что не наблюдалось значительной разницы в характере высвобождения PTX и TQD при pH 7,4 и pH 5,0. В более длительный момент времени значительная разница в высвобождении наблюдалась при различных условиях pH. Стоит отметить, что в нанолипосомы не были добавлены элементы, чувствительные к pH, и более высокое высвобождение лекарства в кислых условиях может быть связано с более высокой диффузией при более низком pH. Например, ~ 85% PTX высвобождается в условиях pH 5,0 по сравнению с ~ 55% высвобождения лекарства при физиологическом pH окружающей среды. Аналогичная картина быстрого высвобождения небольших молекул в кислых условиях и более медленного высвобождения в условиях щелочного pH была продемонстрирована другими исследователями. Тем не менее, относительно низкое высвобождение лекарства в условиях pH 7,4 может уменьшить ненужные системные побочные эффекты и продлить системное кровообращение, в то время как более высокое высвобождение лекарства при pH 5,0 может способствовать более высокой терапевтической эффективности в опухолевых тканях.

Анализ клеточного поглощения in vitro

Эффективность доставки нацеленных (PD-PTLP) и нецелевых (PTLP) нанолипосом была протестирована в SGC7901 / ADR. Поглощение клетками оценивали с использованием родамина-B в качестве трекера флуоресценции. Родамин-B - это широко используемый флуорофор, не взаимодействующий с биологическими клетками. Ядро окрашивали DAPI синего цвета, а красный цвет происходил от наночастиц. Данные CLSM ясно показывают, что PD-PTLP проявляет сильную красную флуоресценцию в раковых клетках по сравнению с флуоресценцией нецелевого PTLP. Более высокая красная флуоресценция в раковых клетках, обработанных PD-PTLP, приписывается более высокой интернализации наночастиц (рис. 3a). Результат данных CLSM показывает, что рецептор PD-L1, экспрессируемый на клеточной мембране, распознавался mAb PD-L1, конъюгированным на поверхности нанолипосом. Неспецифический или пассивный механизм захвата был очевиден в обработанных PTLP раковых клетках. Целевая специфичность PD-L1 была дополнительно подтверждена экспериментом по предварительной обработке mAb PD-L1. Клетки SGC7901 / ADR предварительно обрабатывали mAb PD-L1 и инкубировали в течение 30 мин. Затем клетки подвергали воздействию PD-PTLP и PTLP и инкубировали в течение 3 часов. Как показано (фиг. 3b), клетки, предварительно обработанные mAb PD-L1, показали значительно меньшую красную флуоресценцию по сравнению с флуоресценцией необработанных клеток, что указывает на то, что mAb PD-L1 потреблялось рецепторами, экспрессируемыми на поверхности, и никаких дополнительных рецепторов для связывания не было. и интернализация, приводящая к меньшему поглощению наночастиц и меньшей интернализации. Эти CLSM четко выявили специфичность нацеливания PD-PTLP на раковые клетки SGC7901 / ADR.

а Изображения, полученные с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM) клеток SGC7901 / ADR после инкубации с PTLP и PD-PTLP в течение 3 часов; Изображения CLSM клеток SGC7901 / ADR, предварительно обработанных с / без PD-L1 mAb, после инкубации с PD-PTLP в течение 3 часов. Родамин B использовался в качестве флуоресцентного трекера, а DAPI использовался для окрашивания ядра раковых клеток

Двойные нанолипосомы с лекарственными препаратами усиливают антипролиферативный эффект

Для комбинированной терапии использовали разные соотношения двух препаратов (PTX и TQD), чтобы установить степень синергетического или аддитивного действия на устойчивые клетки рака желудка. Для расчета изоболограммы и индекса комбинации (CI) использовалась программа CalcuSyn (Biosoft, версия 2.1). Построение изоболограммы можно объяснить на основе уравнения Чоу-Талалая. Значения ДИ характеризуются синергическим (ДИ <0,9), аддитивным (ДИ =1) и антагонистическим (ДИ> 1). Как показано, все соотношения комбинаций PTX и TQD выявили значение CI <1, что указывает на синергетический механизм действия (фиг. 4a). Чтобы быть конкретным, наивысший синергизм наблюдался при массовой доле 1 / 0,5 (P / T), в то время как уровень синергизма снижался с увеличением массовой доли TQD, что указывает на важность присутствия двух лекарственных средств во фракции с удельным весом. Слишком низкая и слишком высокая концентрация TQD в комбинированном режиме не давали наилучшего синергетического эффекта. Для всех экспериментов in vitro мы использовали соотношение P / T =1 / 0,5.

а Комбинированный индекс (CI) различных весовых фракций PTX и TQD в клетках SGC7901 / ADR. Комбинированный индекс был оценен Calcusyn ^TM программное обеспечение. б Жизнеспособность клеток SGC7901 / ADR in vitro после обработки различными концентрациями свободного PTX, TQD, PTLP и PD-PTLP в течение 24-часового инкубационного периода. c Вестерн-блот-анализ экспрессии p-gp в клетках SGC7901 / ADR после обработки соответствующими препаратами. ** p <0,01 и *** p <0,001 - статистическая разница между группой, получавшей свободный PTX и PD-PTLP

Цитотоксический эффект in vitro как отдельных, так и комбинированных препаратов определяли по протоколу МТТ после 24-часовой инкубации. Как показано на фиг. 4b, пустой NP не оказал никакого влияния на жизнеспособность соты, что исключает возможность любого вмешательства в конечные результаты. Однако монотерапия PTX и TQD показала зависящий от концентрации цитотоксический эффект на резистентные клетки рака желудка; оно не имело заметной эффективности в лечении. Антипролиферативный эффект одного агента был значительно улучшен при сочетании со вторым лекарством, инкапсулированным в нанолипосомы. Комбинация PTX и TQD приводила к очевидному синергетическому эффекту по сравнению с эффектом отдельных препаратов. Moreover, PD-L1 mAb-conjugated nanoliposome (PD-PTLP) exhibited the strongest anti-proliferative effect indicating the influence of the targeting ligand on the nanoparticle surface. This enhanced cell killing in the PD-L1-targeted treatment group might be attributed to the high cellular internalization of PD-L1-targeted nanoliposomes by SGC7901/ADR cells consistent with the cellular uptake analysis. The IC50 value of PD-PTLP was 0.76 μg/ml compared to 6.58 μg/ml and 7.64 μg/ml for PTX and TQD, respectively. A ten-fold decrease in IC50 value of PD-PTLP clearly indicates that resistance to PTX in p-gp overexpressing SGC7901/ADR was reversed by TQD. Our in vitro results showed that TQD was effective in reversing the multidrug resistance in SGC7901/ADR cells. Results also showed that nanoliposomes retained the pharmacological actions of encapsulated drugs and released the drug in a controlled manner in the cancer cells. The combination therapy with PTX and TQD enhanced the anticancer efficacy with increased synergistic activity, outperforming the minimal advantages of monotherapy and possible associated side effects. Overall, combination treatment of PTX with an effective p-gp inhibitor in nanoliposome could be a promising strategy to overcome MDR and treat gastric cancers.

In order to evaluate the molecular mechanism, Western blot analysis was performed on SGC7901/ADR. As shown (Fig. 4c), PTX did not have any effect on the p-gp protein expression while on the contrary, TQD significantly downregulated the p-gp expression confirming its pharmacological role as a p-gp inhibitor. Interestingly, combination drug-based PTLP and PD-PTLP showed insignificant difference in protein expression compared to that of TQD-treated cancer cells. The result demonstrated the advantage of loading PTX and TQD (P-gp inhibitor) together in a single nanocarrier system. The Western blot result could be corroborated with the cell viability results where combination of PTX + TQD reversed the MDR and exhibited higher anticancer efficacy in gastric cancer cells.

Apoptosis analysis by flow cytometer

Apoptosis analysis of individual formulation was evaluated by Annexin V-FITC/PI staining method using flow cytometer. Results of apoptosis are presented in Fig. 5a. A shown, control cells did not show any sign of apoptosis, whereas free PTX and TQD exhibited obvious increase in the apoptosis cells. Combination drug-based PTLP showed two-fold higher apoptosis compared to that of individual drugs indicating the synergistic anticancer effect of the formulations. More importantly, PD-PTLP showed the highest apoptosis of cancer cells with around 60% under apoptosis region. Enhanced apoptosis effect of PD-PTLP was attributed to higher internalization of dual-drug-loaded nanocarriers and synergistic potential of PTX and TQD in a ratiometric manner. The p-gp silencing effect of TQD in combinational regimen enhanced the anticancer effect of PTX in the cancer cells. The apoptosis rate of individual drug was in the range between 20 and 25% while around 60% of apoptosis cells were observed for PD-PTLP-treated cells. The PD-PTLP induced more apoptosis than free drugs and non-targeted liposomes, suggesting that the PD-L1 could deliver PTX/TQD more efficiently to induce apoptosis of the SGC7901/ADR cells.

а Apoptosis assay of SGC7901/ADR cells after staining with Annexin V/PI combo using flow cytometer. The cells were treated with a fixed concentration of 2 μg/ml. б Reactive oxygen species (ROS) analysis of SGC7901/ADR cells using 2,7-dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA) as a probe. *** p <0.001 is the statistical difference between free PTX and PD-PTLP-treated group

Intracellular ROS level determination

We have explored the ability of individual drug and dual drug to affect the redox state of the cancer cells cell by evaluating the level of reactive oxygen species (ROS) in gastric cancer cells. ROS levels in cancer cell were evaluated by DCFH-DA (green fluorescence). Quantitative ROS data are presented in Fig. 5b. As shown, non-treated cells did not have any sign of ROS; however, PTX or TQD did induce appreciable levels of ROS generation. Importantly, TPLP and PD-TPLP triggered a significantly higher levels of ROS compared to that of free PTX or TQD or non-treated control cells. A remarkably higher ROS indicates the potential of PD-TPLP to promote higher apoptosis. Microscopic images corroborate with the quantitative results with brightest and higher intensity green fluorescence compared to untreated or free PTX or TQD treated cancer cells. The higher intensity of green fluorescence is an indication of higher ROS production. Oxidative stress such as ROS is considered to be an important indicator of cellular cytotoxicity. Studies have shown that induction of ROS induce a scores of physiological events including DNA damage, inflammation, and cell apoptosis.

Combination of PTX and TQD inhibited growth in drug-resistant tumors

Finally, therapeutic efficacy and toxicity parameters of formulations were investigated on drug-resistant SGC7901/ADR xenograft tumor model (Fig. 6a). The drugs were intravenously administered at a fixed dose of 5 mg/kg for every 3 days with a total of three injections. The PTX/TQD was administered at a fixed weight fraction of 1/0.5. On the expected line, free PTX and free TQD did not show any inhibitory effect on the growth of MDR tumors, suggesting the fact that the SGC7901/ADR cells manifest drug tolerance on the proliferation of MDR tumors. P-gp inhibitor (TQD) though efficient in inhibiting the drug efflux pumps however does not convert into improved therapeutic outcome. In comparison, combination of PTX + TQD (PTLP) displayed a significant inhibition of growth of drug-resistant tumors. The best antitumor efficacy was observed with PD-PTLP which was three-fold effective compared to control, 2.5 compared to free drugs, and approximately two-fold effective in reducing the tumor burden compared to non-targeted formulations (p <0.05; p <0,001). The final tumor volume of control, free PTX, TQD, PTLP, and PD-PTLP was ~ 2000 mm ³ , ~ 1650 mm ³ , 1625 mm ³ , ~ 1000 mm ³ , and ~ 650 mm ³ , соответственно. Free drugs were slightly effective during the initial time point; however, they grew the same as that of non-treated control group. Results clearly reveal the potential of combination of PTX + p-gp inhibitor as a unique strategy to effectively control the tumor burden. The extensive tumor suppression in PD-PTLP clearly suggests the greater antitumor efficacy of the targeted formulations group. The tumors were extracted and weighed; tumor weights were consistent with the tumor volume data (Fig. 6b). PD-PTLP-treated mice group showed the smallest tumor compared to any other formulation-treated group (p <0,001). To further verify the inhibitor effect of individual tumors, tumors were subjected to TUNEL assay (Fig. 6c). As shown, PD-PTLP showed the large swaths of apoptosis staining compared to non-treated control or free drugs. PD-PTLP showed apparent apoptosis traits with disorganized cell arrangements. The prominent tumor killing effect of PD-PTLP displays the greater cancer cell inhibition in drug-resistant tumor cells. The excellent efficacy of PD-PTLP was mainly attributed to the presence of targeted ligand (PD-L1 mAb) which binds with the respective receptors and increases the intracellular concentrations. The presence of combination regimen and release in a controlled manner for prolonged time also contributed for its enhanced efficacy. In addition, dense hydrophilic PEG surface corona might offer excellent physical stability to the particles and could potentially avoid the unnecessary protein absorption and avoid rapid clearance. The long circulation and nano-scaled size in turn benefit the higher accumulation of particles in the tumor tissues [31,32,33].

In vivo antitumor efficacy of different formulations against multidrug resistant (MDR) SGC7901/ADR tumors; а tumor volume, b tumor weight analysis, and c TUNEL assay of tumor tissues. The mice were administered with a fixed dose of 5 mg/kg with duration of three times for three administrations. Apoptotic cells wells were evaluated by TUNEL assay. * p <0.05 and **p <0.05 (PTLP vs. PD-PTLP), ***p <0.001 (PTX vs. PD-PTLP)-treated group.

Systemic toxicity analysis

The change in body weight is a good indicator of systemic toxicity. As shown (Fig. 7a), mice treated with free PTX shed ~ 20% of body weight on day 10 which gradually decreased to regain the original body weight toward the end of the study. Loss of more than 5% of body weight is considered to cause severe internal toxicity and 20% of body weight loss is considered a significant adverse effect of free drugs [31]. On the contrary, PTLP or PD-PTLP did not cause any such loss of body and the mice remain healthy throughout the study period indicating the safety index of the nanoliposomes. Delivery system with no systemic toxicity and enhanced antitumor efficacy is considered to be highly effective in tumor treatment. The safety of nanoparticles was further studied by measuring plasma levels of enzymes. Plasma levels of aminotransferases (AST and ALT) are measured following the 24-h administration of respective formulations (Fig. 7b, c). As shown, free PTX resulted in significant increase (p <0.01) in the levels of AST and ALT while PD-PTLP and PTLP were insignificantly different compared to that of non-treated control. AST is released in serum upon organ damage such as heart, kidney, or liver while ALT is specifically released in case of liver injury [34]. The levels of AST and ALT serves as a specific indicator of organ damage and in this regard PD-PTLP showed to be a safe carrier.

Systemic toxicity analysis of individual formulations in SGC7901/ADR tumors; а mice body weight analysis; б , c blood biochemical evaluation of serum levels of AST and ALT as a systemic toxicity parameters. * p <0.05 and **p <0.01 is the statistical difference between free PTX and PD-PTLP treated group

Доступность данных и материалов

Все данные, полученные или проанализированные в ходе этого исследования, включены в эту опубликованную статью и файлы с дополнительной информацией к ней.

Сокращения

EPR:

Enhanced permeation and retention effect

PD-PTLP:

PD-L1 mAb-conjugated PTX and TQD-loaded nanoliposomes

P-gp:

P-glycoprotein

PTLP:

PTX and TQD-loaded nanoliposomes

PTX:

Paclitaxel

TQD:

Tariquidar