Новая химио-фототермальная терапия рака груди с использованием конъюгированных с фолиевой кислотой, содержащих метотрексат наночастиц Au @ SiO2

Введение

Рак молочной железы (РМЖ), как наиболее часто встречающееся у женщин заболевание раком, недавно зарегистрировал 1,7 миллиона новых случаев во всем мире [1]. Из-за сложной этиологии и плохой реакции на лечение, часто известно, что он является основной причиной смерти женщин, связанных с раком [2,3,4,5]. В 2014 г. предсказуемо, что около 40 000 женщин в США умрут от Британской Колумбии [2, 6, 7] «(www.cancer.org)». При общем количестве смертей 522 000, это пятая причина смерти от рака:около 800 000 случаев в менее развитых регионах и примерно такая же частота в развитых регионах [1]. В азиатских странах самый высокий возраст начала у взрослых от 40 до 50 лет по сравнению с западными странами, который часто встречается среди 60-70 лет [8]. Основными факторами риска РМЖ являются женский пол, семейный анамнез, возраст и различные генеративные склонности, такие как первые роды в возрасте более 30 лет, ранняя менархе и более поздняя менопауза, а также нерожание [9].

Основная цель борьбы с раком - разработка эффективных терапевтических планов с низкой токсичностью и высокой специфичностью для устранения опухолей, в основном их метастазов, и дальнейшего предотвращения их рецидивов. Но используемые в настоящее время подходы к лечению рака, такие как хирургия, химиотерапия и лучевая терапия, показали различные побочные эффекты [10,11,12], и все они не достигают этой цели [13, 14]

За последние несколько десятилетий в лечении рака наблюдались серьезные проблемы [15, 16]. Среди современных популярных терапевтических подходов термотерапия стала перспективным методом лечения [17]. В последнее время большое внимание привлекла фототермическая терапия (ФТТ) как потенциально эффективная и неинвазивная терапия рака [18, 19]. ФПТ на основе фотопоглощающих наноструктур стал отличным от общих методов [20, 21]. В типичном PTT, в котором используются агенты PTT для разрушения опухоли путем получения достаточного количества гипертермии (42 ° C) под действием лазерного излучения (ближний инфракрасный (NIR) свет в диапазоне 700–1100 нм), был изучен как очень точный и точный. малоинвазивный метод лечения рака [22,23,24,25,26,27,28].

Ряд наночастиц широко изучался в качестве контрастных агентов для визуализации, носителя для доставки лекарств и преобразователя энергетических модальностей, таких как лазер, радиоволны и ультразвук, в тепловые явления, ответственные за терапевтические эффекты [29,30,31,32,33 , 34,35,36,37,38,39].

Наночастицы золота привлекли большое внимание в последнее десятилетие из-за их высокого локализованного поверхностного плазмонного резонанса (LSPR) и легкого поверхностного сопряжения с биомолекулами [40]. Они выявили высокую способность фототермического преобразования в ближней инфракрасной области [41,42,43] без вредных побочных эффектов в биологических системах [44].

Хотя наночастицы золота были признаны многообещающим фотосинтезатором, но из-за их плохой фототермической стабильности при повторяющемся БИК-облучении наночастицы золота постепенно теряют способность к фототермическому преобразованию, что ограничивает их использование в клинической практике. Кроме того, наночастицы золота не являются хорошими переносчиками лекарств из-за их плохой способности загружать лекарственные средства и профиля контролируемого высвобождения лекарств [45, 46]. В качестве альтернативы, мезопористые наночастицы диоксида кремния (MSN) были известны как подходящие лекарственные средства, носители ДНК и белка из-за их более высокой способности загружать лекарственные средства и отсутствия токсичного содержимого, возникающего в результате их разложения. Они также обладают большой площадью поверхности, контролируемым размером, высокодоступным объемом пор и желаемыми характеристиками поверхности, требующими модификации [47].

Наночастицы после конъюгирования с химиотерапевтическим агентом и лигандом, направленным на рак, могут подавлять недостатки рутинной химиотерапии, такие как неспецифическая доставка, плохая растворимость в воде и низкие терапевтические индексы [48, 49].

Агенты, проявляющие химиотерапевтические свойства, такие как доксорубицин, циклофосфамид, метотрексат, фторурацил и доцетаксел, используются индивидуально или в комбинации в качестве основных лечебных средств, или им помогают другие методы лечения, такие как PTT. Большинство онкологических больных испытывают побочные эффекты химиотерапевтических препаратов из-за их неточного распределения в организме пациента, которое влияет на все органы. Эти препараты повреждают некоторые из быстрорастущих нормальных клеток, например клетки крови, клетки слизистой оболочки, покрывающие внутренние органы, и волосяные фолликулы [50,51,52,53].

Метотрексат (МТ) был наиболее часто используемым лекарством при ревматоидном артрите и нескольких типах опухолей, таких как кожа, легкие, голова и шея, а также груди [54, 55]. Он ингибирует дигидрофолатредуктазу (DHFR), фермент, способствующий производству тетрагидрофолата и его побочных продуктов, которые необходимы для синтеза тимидилата и пурина, и оба они жизненно важны для роста и пролиферации клеток. Следовательно, блокирование метотрексата DHFR предотвращает синтез 4 основных макромолекул - ДНК, РНК, тимидилатов и белков [56].

К сожалению, как и в случае с большинством обычных агентов PTT, основная проблема заключается в достижении избирательного накопления ЗНЧ в ткани-мишени после системной инъекции [57,58,59]. Таргетная терапия рака позволяет доставлять химиотерапевтическое лекарство к конкретным раковым клеткам, уменьшая при этом воздействие на нормальные здоровые клетки. Это привело к тому, что мы стали доставлять более высокие дозы лекарства к раковым клеткам с более низкой системной токсичностью. Наночастицы, нацеленные на лиганд, представляют собой точно идентифицированные маркеры раковых клеток, которые высоко экспрессируются на поверхности раковых клеток [40].

Фолиевая кислота (фолиевая кислота или витамин B9) является ключевым материалом для роста клеток и обмена веществ. Из-за большого сродства фолиевой кислоты к белкам рецептора фолиевой кислоты он используется в качестве элемента для нацеливания на рак. Рецептор фолиевой кислоты, как биомаркер опухоли, сверхэкспрессируется в определенных злокачественных клетках, таких как рак груди, яичников, легких, почек, мозга и толстой кишки [60]. Системы доставки лекарств, конъюгированные с фолиевой кислотой, увеличивают клеточное поглощение лекарства посредством эндоцитоза [61].

Материалы и методы

Реагенты и материалы

Мы использовали бидистиллированную воду (компания Ghazi, Тебриз, Иран) и химические реактивы аналитической чистоты для наших экспериментов. Ряд реагентов был приобретен у Sigma-Aldrich Company, включая:тетраэтилортосиликат (TEOS, 98%), (3-меркаптопропил) триметоксисилан (MPTES, чистота 95%), фолиевая кислота и родамин B. Группа материалов была приобретена у Merck. Co:соляная кислота (HCl, 37%), раствор аммиака (25%), толуол, гидроксид натрия (NaOH, 98%) и другие растворители. MTX был куплен в компании Zahravi Farma, Тебриз, Иран.

Инструменты

В этом исследовании для анализа размера и морфологии частиц использовалась просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) (LEO 906, Германия). Мы приготовили около 100 мкл наших наночастиц, суспендированных в водном растворе при комнатной температуре. Раствор переносили на углеродную пленку, покрытую медной сеткой ПЭМ, с последующей сушкой вымораживанием и наблюдали при 80 кВ. Определение размера частиц выполняли с помощью измерения DLS (динамического светорассеяния) при 25 ° C с использованием Zetasizer Nano ZS90, Malvern Instruments, Malvern, UK. Измерения дзета-потенциала приготовленных наночастиц проводили с помощью фотонной корреляционной спектроскопии (Zetasizer-ZS, Malvern Instrument, UK). Двухлучевой УФ-видимый спектрофотометр (UV-1601 PC модель SHIMADZU, Киото, Япония) использовали для измерения оптической плотности кварцевой кюветой емкостью 700 мкл с длиной пути 10 мм. Для выполнения метода таблеток с KBr использовалась инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье (FTIR) на спектрометре Bruker Tensor 27, Германия. Измерения pH проводили с помощью pH-метра Metrohm 713 (Herisau, Швейцария). Для перемешивания использовали механическую мешалку Heidolph RZR 2102 Control Overhead Stirrer (Schwabach, Германия). Эффективность инкапсуляции FA и MTX рассчитывалась с использованием системы ВЭЖХ, состоящей из модуля разделения Waters 2690, оснащенного УФ-видимым детектором Детекторы Waters 2500 Pump 1000 (Waters, Milford, MA). Хроматографическое разделение осуществляли при температуре окружающей среды с использованием хроматографических колонок Bondapak C18 м (250 мм, 4,6 мм, 10 мм, 125 A Waters, Ирландия).

Приготовление Au @ SiO ₂ Наночастицы

SiO ₂ НЧ были синтезированы на основе ранее описанного золь-гель метода [62, 63]. На следующем этапе были приготовлены наночастицы, покрытые тиолами, покрытые диоксидом кремния (TFSNP), в соответствии с методом, упомянутым в нашем предыдущем исследовании [64]. Наночастицы Au были получены методом цитратного восстановления (метод Туркевича) [65]. Наконец, поверхность TFSNP была покрыта AuNP. Сначала TFSNP диспергировали в воде с помощью ультразвукового устройства для ванны в течение не менее одного часа, добавляли к раствору AuNP и обрабатывали ультразвуком в течение дополнительных 30 мин. Реакцию проводили в темноте в течение двух дней при динамическом перемешивании при 25 ° C. Au @ SiO ₂ наночастицы пурпурного цвета собирали центрифугированием (10000 об / мин, 10 мин) и сушили в вакуумной печи.

Загрузка MTX и FA

MTX и FA были загружены в Au @ SiO ₂ наноноситель следующим образом:МТХ (10 мг) добавляли к 10 мл хорошо диспергированной суспензии наноносителя в PBS (5 мг / мл, pH 7,4) и умеренно перемешивали при комнатной температуре в течение одного дня в темноте. MTX загружен Au @ SiO ₂ наноноситель собирали центрифугированием. Супернатант собирали для измерения ненагруженного МТХ. Затем MTX загрузил Au @ SiO ₂ наноноситель диспергировали в PBS (5 мг / мл, pH 7,4), и к раствору добавляли FA (10 мг) и умеренно перемешивали при комнатной температуре в течение еще одного дня в темноте. В FA-MTX загружено Au @ SiO ₂ наноноситель собирали центрифугированием, а супернатант отделяли для расчета несвязанного FA на заключительном этапе. В FA-MTX загружено Au @ SiO ₂ наноноситель сушили вымораживанием и хранили для следующих экспериментов. Количество несвязанного метотрексата и ЖК рассчитывали с использованием метода ВЭЖХ согласно протоколу, описанному ранее [66]. Фолиевую кислоту растворяли в гидроксиде аммония (10 мас.%) И разбавляли подвижной фазой. Время удерживания для метотрексата и фолиевой кислоты составляло 10,5 и 5,95 мин соответственно. Были применены образцы в трех экземплярах. Эффективность загрузки лекарственного средства (DLE) рассчитывалась по следующим формулам:

Выбор клеточных линий и культура

Две представляющие интерес линии клеток рака молочной железы с сообщенными уровнями экспрессии фолатного рецептора (FR) [67], включая MCF-7 и MDA-MB-231, были отобраны и приобретены в банке клеток Пастера (Тегеран, Иран) для исследований цитотоксичности. Отобранные клеточные линии выращивали в полной среде, содержащей RPMI1640 (Thermoscientific), 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% Penstrep (Thermoscientific), в температурных и атмосферных условиях 37 ° C, 5% CO ₂ и влажностью 95%

Анализ цитотоксичности клеток

Анализы жизнеспособности клеток проводили для измерения пролиферации клеток после различных обработок НЧ без лазерного облучения. Вкратце:клетки MCF-7 или MDA-MB-231 помещали в 96 микропланшетов с плотностью клеток 1,5 × 10 ⁴ . в течение 24 ч, затем клетки обрабатывали МТХ, Au @ SiO ₂ и FA-MTX загружены Au @ SiO ₂ НП. Клетки без обработки считали контролем. На следующем этапе к клеткам добавляли тетразолиевый краситель МТТ (Sigma) в конечных концентрациях 5 мкг / мл и инкубировали при 37 ° C в течение 4 часов. Затем раствор МТТ удаляли и осевшие кристаллы фурмазана растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) (BioIdea, Иран) при осторожном встряхивании в течение 10 мин. Наконец, оптическую плотность измеряли при длине волны 570 нм с помощью считывающего устройства для ELISA. Жизнеспособность клеток нормализовали к контрольным клеткам, а фон удаляли вычитанием холостых измерений.

Лазерная терапия in vitro

Для низкоуровневой лазерной терапии (LLLT) для разрушения раковых клеток использовался NIR-лазер с длиной волны 810 нм (диодный лазер Mustang 2000, Россия) с выходной мощностью 185 мВт. Сначала клетки MCF-7 и MDA-MB 231 с плотностью клеток 1,5 × 10 ⁴ обработанный Au @ SiO ₂ и FA-MTX загружены Au @ SiO ₂ Затем НЧ подвергались лазерному облучению с различными дозами лазера (30, 60, 75, 90 и 105 Дж / см ² ) и фиксированное время выдержки (139 сек). Клетки, подвергшиеся только лазерному облучению (без НЧ), и клетки без каких-либо НЧ и лазерной обработки рассматривались как положительный и отрицательный контроль соответственно. После 24 часов лазерного облучения жизнеспособность клеток измеряли методом МТТ [64].

Анализ клеточного поглощения наночастиц

Подробная проверка интернализации клеток НЧ необходима для подтверждения специфического эффекта поверхностно-модифицированного наноносителя для каждой клеточной линии. В настоящей работе мы использовали как проточную цитометрию в качестве количественной, так и флуоресцентную микроскопию для качественной проверки поглощения НЧ клеточными линиями MCF-7 и MDA-MB-231.

Для суспендирования НЧ раствор родамина B (RhoD) в PBS добавляли при перемешивании в течение 24 ч при температуре окружающей среды и темной комнате (предотвращая обесцвечивание). Затем наночастицы, нагруженные RhoD, разделяли с помощью фильтра Amicon с номинальным пределом молекулярной массы (NMWL) 30 кДа, центрифугировали в течение 15 мин при 5000 об / мин и промывали буфером PBS для удаления неограниченного RhoD. Клетки высевали в чашки плотностью 5 × 10 ⁵ . за колодец и пусть дойдет до слияния. Клетки обрабатывали НЧ, нагруженными родамином B, в течение 30, 90 и 180 минут, необработанные клетки использовали в качестве контроля. После этого клетки трипсинизировали и промывали PBS, а затем количественно определяли флуоресценцию с помощью проточного цитометрического анализа (проточный цитометр BD Biosciences FCASCalibur; BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния, США). Внутриклеточное поглощение NP или NPD, меченных родамином B, было дополнительно подтверждено флуоресцентной микроскопией. Клетки MCF-7 и MDA-MB-231 выращивали на покровных стеклах и через 24 часа обрабатывали свободным Au @ SiO ₂ НЧ и MTX-FA загружены Au @ SiO ₂ НП. После инкубации в течение 30, 90 и 180 минут клетки промывали PBS, и поглощение меченных родамином В наноносителей наблюдали с помощью флуоресцентного микроскопа (микроскоп Olympus Bh2-FCA, Япония).

Исследование апоптоза с помощью флуоресцентной микроскопии

Одним из методов ядерного качественного исследования апоптоза является флуоресцентный краситель DAPI, который связывается с ДНК и обнаруживается с помощью соответствующей микроскопии. Вкратце мы использовали протокол, описанный ранее для окрашивания DAPI [68]:клетки MCF-7 или MDA-MB-231 помещали в 6-луночные сосуды с плотностью 5 × 10 ⁵ и позвольте им прикрепиться и расти в течение 24 часов. После лечения метотрексатом Au @ SiO ₂ НЧ и MTX-FA загружены Au @ SiO ₂ НЧ с и без лазерной обработки клетки промывали PBS (Sigma), а затем подвергали фиксации 10% формальдегидом (Merck), далее:клетки проницались с помощью Triton X-100 (Sigma) в течение 15 минут. После надлежащих промывок клетки окрашивали DAPI (сигма) в течение 5 мин. Наконец, апоптотические ядра (фрагментированные или морщинистые) визуализировали с помощью флуоресцентного микроскопа (Olympus). Клетки без какой-либо обработки считались отрицательным контролем, а клетки получали только лазерное облучение в качестве положительного контроля.

Исследования нарушений клеточного цикла

Распределение клеточного цикла MCF-7 и MDA-MB-231 определяли анализом проточной цитометрии. Таким образом, клетки были засеяны стартовыми популяциями 5 × 10 ⁵ и позволил достичь 80% слияния. Впоследствии клетки, обработанные MTX, Au @ SiO ₂ НЧ и MTX-FA загружены Au @ SiO ₂ Проведены НЧ с лазерным облучением и без него. Клетки без какой-либо обработки считали отрицательным контролем, а клетки получали только лазерное облучение в качестве положительного контроля. Затем клетки собирали трипсинизацией с последующей промывкой PBS. Затем клетки фиксировали этанолом (Merck) в течение 48 часов. На следующем этапе фиксированные клетки промывали, затем обрабатывали рибонуклеазой А (цинаклон) с последующим добавлением йодида пропидия (PI) (Sigma) в темноте. Сигналы флуоресценции регистрировались набором FACS от Beckton Dicinson Company.

Статистика исследования

Эксперименты для каждого шага были выполнены в трех повторах, и результаты были представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение. ANOVA использовался для сравнения значимости между группами. Различия были отражены в значимости, где значение вероятности было рассчитано <0,05 с помощью программного обеспечения SPSS.

Результаты и обсуждение

Характеристика синтезированных НЧ

Au @ SiO ₂ НЧ были получены в четыре этапа:1-синтез SiO ₂ наночастиц, 2-присоединение тиолсодержащего линкера к SiO2 НЧ, 3-синтез наночастиц золота и 4-присоединение наночастиц золота к поверхности комплексов SiO2-линкер (рис. 1). Успешный синтез Au @ SiO ₂ было подтверждено с помощью FTIR (рис. 2а). Пик Si – O – Si появился в районе 1088 см ^-1 . . Широкий пик на 3000–3700 и 803 см ^–1 объясняется растяжением и изгибом вне плоскости свободных силанольных O – H групп, соответственно. Валентное колебание алифатических C – H проявляется в виде сильного пика при 2950 см ^–1 . . C – O трех метоксисилановых групп показан пиком при 1191 см ^–1 . .

Поэтапная синтетическая схема для получения биосовместимого Au @ SiO ₂ , нагруженного фолатом и метотрексатом Наночастицы НЧ

а ) ИК-Фурье спектры Au @ SiO ₂ наночастицы, b ) распределение по размерам конъюгированного FA-MTX Au @ SiO ₂ НЧ, измеренные методом динамического рассеяния света (ДРС) c ) Дзета-потенциал Au @ SiO ₂ и FA-MTX, конъюгированный Au @ SiO ₂ НЧ, измеренные методом динамического рассеяния света (DLS) при pH =7,4 и T =25 ° C, d ) Хроматограмма незагруженного MTX и FA, отделенных от FA-MTX, конъюгированного Au @ SiO ₂ NP измеряется одновременно методом ВЭЖХ

Измерения динамического рассеяния света (DLS) показали, что FA-MTX конъюгированный Au @ SiO ₂ Размер наночастиц находился в нанометровом диапазоне (105 ± 2,3 нм) с узким распределением по размерам (рис. 2b).

Дзета-потенциал - важный физико-химический параметр, влияющий на стабильность наносуспензий. Чрезвычайно положительные или отрицательные значения дзета-потенциала вызывают большие силы отталкивания. С другой стороны, высокий заряд частиц, положительный или отрицательный, заставляет НЧ абсорбироваться фагоцитами печени и выводиться из организма. В случае комбинированной электростатической и стерической стабилизации желателен минимальный дзета-потенциал ± 20 мВ [69,70,71]. Данные дзета-потенциала НЧ сравнивали до и после нагрузки MTX-FA при pH =7,4 и T =25 ° C (рис. 2c). Полученные дзета-потенциалы Au @ SiO ₂ НЧ были +13,3 мВ, которые после двойной нагрузки лекарственным средством снизились до -19,7 мВ, что было в желаемом диапазоне. MTX и FA имели отрицательный суммарный заряд при pH (7,4) выше его pka (3,8 и 4,8, 3,5 и 4,3) из-за депротонирования двух групп карбоновых кислот в его структуре ([72], https:// pubchem.ncbi.nlm.nih.gov.). Следовательно, после одновременной загрузки MTX и FA на Au @ SiO ₂ NPs, чистый заряд стал отрицательным.

ПЭМ-анализ позволяет определить индивидуальный размер частиц. Наночастица Au была видна в виде темных сфер, диспергированных на наночастицах SiO2 в виде серого слоя слоя. Изображения ПЭМ подтвердили, что синтезированные наночастицы Au @ SiO2 имеют однородную сферическую форму, средний размер частиц которой составляет около 25 нм (рис. 3).

ПЭМ изображение Au @ SiO ₂ наночастицы

Загрузка лекарств

Здесь фолат опосредует повышенное поглощение ЗНЧ определенными типами раковых клеток, которые сверхэкспрессируют рецептор фолиевой кислоты через рецептор-опосредованный эндоцитоз, чтобы подавить низкую эффективность интернализации ЗНЧ, поэтому рецептор фолиевой кислоты, известный как маркер опухоли, и фолиевая кислота все чаще используются для лечения опухолей. нацеливание [67, 73].

После конъюгации молекул MTX и FA в Au @ SiO ₂ НЧ дзета-потенциал изменился с +13,3 до -19,7 мВ. Расчетные значения pKa двух фрагментов карбоновой кислоты MTX составляют 3,8, 4,8, а FA - 3,5 и 4,3 [72], https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov. Следовательно, из-за депротонирования двух групп карбоновых кислот MTX и FA при pH 7,4, который выше их pka, суммарный заряд стал отрицательным, что указывает на успешную конъюгацию MTX и FA на Au @ SiO ₂ НП. Де Ин Тиан и др. Показали, что нагрузка метотрексатом на наночастицы Au диаметром 18 и 30 мм составляет 15 ± 0,4% и 10 ± 1,0% соответственно [74]. В этом исследовании FA и MTX были загружены в наночастицы Au @ SiO2 с эффективностью инкапсуляции 22,6 и 77,5% соответственно. Хроматограмма пика одновременной оценки MTX и FA показана на рис. 2d.

Поглощение клеток

Поскольку внутриклеточные фототермические агенты могут повысить эффективность фототермической терапии рака [75], считалось, что клеточная интернализация фототермальных материалов необходима. In vitro Тест клеточного поглощения был проведен с использованием клеток рака молочной железы человека MDA-MB-231, которые, как известно, обладают высокой сверхэкспрессией рецептора фолиевой кислоты [40]. Изучить роль FA в качестве целевого агента и эффективность поверхностного покрытия в отношении поглощения Au @ SiO ₂ НЧ клеток-мишеней, клетки MCF-7 и MDA-MB-231 обрабатывали НЧ Au @ SiO2 и НЧ Au @ SiO2, нагруженные MTX-FA. Результаты средней интенсивности флуоресценции поглощения клетками показаны на рис. 4. Результаты показали, что поглощение НЧ Au @ SiO2 как MCF-7, так и MDA-MB-231 увеличивалось с течением времени культивирования клеток для всех образцов (рис. 4 и 5). ). Кроме того, после декорирования поверхности НЧ Au @ SiO2 с помощью MTX и FA, поглощение клетками значительно увеличивалось как на MCF-7, так и на MDA-MB-231 в качестве клеток, экспрессирующих рецептор фолиевой кислоты. Поглощение НЧ Au @ SiO2, нагруженных MTX-FA, клетками MDA-MB-231 было больше, чем MCF-7. Поскольку клетки MDA-MB-231 экспрессируют более высокие уровни поверхностных рецепторов фолиевой кислоты, поэтому большая часть НП, нацеленных на рецептор фолиевой кислоты, была введена через опосредованный рецептором механизм эндоцитоза, что привело к более высокому поглощению клетками. В другом исследовании повышенная интернализация клеток NPs, конъюгированных с фолатом, происходит только в раковых клетках, которые сверхэкспрессируют aHFR, а не в здоровых клетках, которые имеют меньшую экспрессию aHFR на клеточной поверхности [40]. Конъюгация НЧ Au @ SiO2 с ЖК может способствовать поглощению клетками НЧ и метотрексата, что приводит к усилению токсичности по отношению к клеткам MDA-MB-231 [76].

Количественный анализ клеточного поглощения Au @ SiO ₂ , меченного родамином B наночастицы (NP) или MTX-FA, меченные родамином B, загруженные Au @ SiO ₂ наночастицы (NPD) в MCF-7 ( a ) и MDA-MB-231 ( b ) клеточные линии для продолжительности воздействия 0,5 ч, 1,5 ч и 3 ч, полученные с помощью проточной цитометрии. Необработанные клетки обеих клеточных линий использовали в качестве отрицательного контроля. c Сравнение средней интенсивности флуоресценции Au @ SiO ₂ , меченного родамином B наночастицы (NP) или MTX-FA, меченные родамином B, загруженные Au @ SiO ₂ наночастицы (NPD) для продолжительности воздействия 0,5 ч, 1,5 ч и 3 ч, полученные методом проточной цитометрии

А Качественный анализ клеточного поглощения с использованием Au @ SiO ₂ , меченного родамином B наночастицы (НЧ) в MCF7 с продолжительностью воздействия 30 ( a ), 90 ( b ) и 180 ( c ) min или меченный родамином B MTX-FA, загруженный Au @ SiO ₂ наночастицы (NPD) с продолжительностью воздействия 30 ( d ), 90 ( e ) и 180 ( f ) мин и ( B ) Качественный анализ клеточного поглощения с использованием Au @ SiO ₂ , меченного родамином B наночастицы (НЧ) в MDA-MB-231 с продолжительностью воздействия 30 ( a ), 90 ( b ) и 180 ( c ) min или меченный родамином B MTX-FA, загруженный Au @ SiO ₂ наночастицы (NPD) с продолжительностью воздействия 30 ( d ), 90 ( e ) и 180 ( f ) мин зафиксировано флуоресцентной микроскопией

Анализ цитотоксичности

Исследования клеточной цитотоксичности in vitro свободного MTX, холостого Au @ SiO ₂ НЧ и MTX-FA, конъюгированные Au @ SiO ₂ НЧ оценивали методом МТТ в течение 24, 48 и 72 ч (рис. 6). Результаты анализа МТТ показали, что Au @ SiO ₂ НЧ не оказывали цитотоксического действия на линии клеток MCF-7 и MDA-MB-231. Кроме того, чтобы сравнить эффекты цитотоксичности как свободного MTX, так и конъюгированного с MTX-FA Au @ SiO ₂ НЧ, одинаковая концентрация метотрексата (25, 50, 100 и 200 мкг / мл) использовалась для всех времен лечения. Результаты клеточной цитотоксичности показывают, что свободный MTX или конъюгированный MTX-FA Au @ SiO ₂ После 24 часов лечения НЧ показали около 10-25% смертности в обеих клеточных линиях. В предыдущих исследованиях сообщалось о пролиферативном эффекте наночастиц золота на различные клеточные линии, такие как клетки мышиного остеобласта MC3T3-E1 и стволовые клетки периодонтальной связки человека в условиях in vitro. Наши результаты согласуются с этими исследованиями, а на рис. 6а и б показан пролиферативный эффект свободных НЧ Au @ SiO2. Следовательно, равный цитотоксический эффект наночастиц Au @ SiO2 (NPD), нагруженных MTX и FA-MTX, может быть связан с этим явлением [77, 78].

а MCF-7 и ( b ) Показатели ингибирования роста клеток MDA-MB-231 после обработки различными концентрациями NP, MTX и FA-MTX, нагруженных Au @ SiO ₂ наночастицы (NPD) после выдержки 24, 48 и 72 часа

Лазерное облучение

В этом исследовании жизнеспособность клеток MCF-7 и MDA-MB 231, обработанных Au @ SiO ₂ НЧ и MTX-FA загружены Au @ SiO ₂ НЧ после лазерного облучения дозой 30-105 Дж / см ² был исследован методом МТТ. Уровень смертности клеток MCF-7 и MDA-MB-231, обработанных MTX-FA Au @ SiO ₂ НЧ (концентрация метотрексата 100 мкг / мл) после НИЛИ в дозе 75 Дж / см ² составили около 39 и 45,5% соответственно. В тех же условиях клетки, обработанные Au @ SiO ₂ НЧ после лазерного облучения или одного только лазера не демонстрировали явной гибели клеток. Также за счет увеличения дозы лазера до 105 Дж / см ² уровень смертности обеих клеточных линий увеличился до 60-75%, в то время как обе клеточные линии, обработанные Au @ SiO ₂ НЧ + лазер или только лазер при той же дозе облучения не показали цитотоксического эффекта. Значение IC50 для клеток MCF-7 и MDA-MB-231 после комбинированной терапии с использованием Au @ SiO ₂ , нагруженного MTX-FA НЧ (доза метотрексата 100 мкг / мл) и НИЛИ получали при дозах 90 и 75 Дж / см ² , соответственно. С другой стороны, уровень смертности от MTX и MTX-FA, загруженных Au @ SiO ₂ НЧ без лазерного облучения при дозе метотрексата 100 мкг / мл (выбранная доза для исследования лазерной терапии) составляли 15-25% в обеих клеточных линиях. Эти результаты показали, что комбинация загруженного MTX-FA Au @ SiO ₂ НЧ и лазерная терапия показали синергетический эффект в обеих клеточных линиях и значительно снизили жизнеспособность клеток ( p <0.001) compared to cells received only laser irradiation. These results indicated that NPs treatment, especially with targeting strategy can improved the efficacy of laser therapy in breast cancer cell destruction (Fig. 7).

A comparison of cell growth inhibition rates exposed to different laser powers (30, 60, 75, 90 and 105 J/cm ² ) for treatment groups of laser alone, laser + Au@SiO2 nanoparticles and laser + MTX-FA loaded Au@SiO2 nanoparticles directed for two cell line MCF-7 (a ) and MDA-MB-231(b ) with subsequent checking after 24h

Apoptosis study by DAPI

The apoptosis were studied in MCF-7 and MDA-MB-231 cells after treatment with Au@ SiO₂ НП; MTX-FA loaded Au@ SiO₂ NPs with or without laser to know if laser treatment could enhance the efficacy of chemotherapy. Our results summarized in Fig. 8 indicated that normal MCF-7 and MDA-MB-231 cells without any treatment set as control as well as cells treated with laser alone or free Au@SiO₂ NPs without laser irradiation had typical nuclei, lacking any apoptosis. However, MCF-7 and MDA-MB-231 cells treated with free MTX, Au@ SiO₂ NPs with laser irradiation and MTX and FA loaded Au@SiO₂ NPs without laser irradiation showed partial apoptotic nuclei (Fig. 8). The cells treated with MTX and FA loaded Au@SiO₂ NPs in combination with laser irradiation (810 nm, 75 J/cm ² , 139 sec) showed a major drop in MCF-7 and MDA-MB-231 cell population. Therefore, laser irradiation efficacy was enhanced after MTX/FA loaded Au@SiO₂ NPs uptake on MCF-7 and MDA-MB-231 cells. Hence, the novel developed MTX and FA loaded Au@SiO₂ NPs has the capability of augmenting the photothermal effects by highly fragmented cell nuclei, a radical rise in cell loss and complete damage of cells.

Apoptosis assay using DAPI staining for MCF-7 or MDA-MB-231 cells, images captured using an inverted microscope. The untreated cells as the negative control (a ), cells treated with laser (75 J/cm ² ) as positive control (b ) cells treated with Au@SiO₂ nanoparticles (NP (c ), cells treated with laser (75 J/cm ² ) and Au@SiO₂ nanoparticles (NP) (d ), cells treated with MTX without laser irradiation (e ), cells treated with MTX and laser irradiation (f ), cells treated with MTX-FA-loaded Au@SiO₂ nanoparticles (NPD) without laser exposure (g ), and cells treated with MTX-FA-loaded Au@SiO₂ nanoparticles (NPD) with Laser exposure (h )

Cell cycle

Cell cycle distributions after treatment with MTX, Au@SiO₂ NPs and MTX and FA loaded Au@SiO₂ NPs either in combination with LLLT (75 J/cm ² ) or without laser irradiation was studied in both MCF-7 and MDA-MB-231 cells using flowcytometry and PI staining of DNA. Our study indicated that in MDA-MB-231 or MCF-7 cells, the percentage of non-treated cells (control group) were actively in phase S (Fig. 9a, b). Using 75 J/cm ² laser treatments reduced the percentage of cells in S-phase in a non-significant manner. On the other hand the cells irradiated with LLLT without NP and drug treatment showed the significant increase in Go/G1 cell population indicated the safety of LLLT alone. Also NPs treatment did not disturb the cell cycle in both cell lines. Treatment of cells with free MTX in the absence or presence of laser irradiation showed some disturbances in cell cycles, including reduction of cells in S-phase. Using NPD alone reduced the cells in S-phase. And interestingly using MTX and FA loaded Au@SiO₂ NPs (NPD) enhanced the cell percentage in sub Go/G1 as a sign of apoptosis [72]. Also the percentage of the MDA-MB-231 cells present in sub Go/G1 (around 18%) were significantly higher than MCF-7 cells (12%) in MTX and FA loaded Au@SiO₂ NPs (NPD) treatment group due to the higher uptake of NPs in MDA-MB-231 cells.

Cell cycle distributions investigated for MCF-7 (A ) or MDA-MB-231 (B ) cells. The untreated cells as negative control (a ), cells treated with laser (75 J/cm ² ) as positive control (b ) cells treated with Au@SiO₂ nanoparticles (NP) (c ), cells treated with laser (75 J/cm ² ) and Au@SiO₂ nanoparticles (NP) (d ), cells treated with MTX without laser irradiation (e ), cells treated with MTX and laser irradiation (f ), cells treated with MTX-FA-loaded Au@SiO₂ nanoparticles (NPD) without laser exposure (g ), and cells treated with MTX-FA-loaded Au@SiO₂ nanoparticles (NPD) with Laser exposure (h ), C ) Quantitative results of cell cycle arrest and its distribution

Ramos et al , showed that in tumor cells, LLLT increases the percentage of cells in S and G2 /M phases, also they detected a reduction in proliferation and enhancing in senescence [79]. The cell cycle study after LLLT (15 J/cm2) showed a G1 arrest, which is in line with growth stopover in irradiated TK6 cells [80]. Another group reported that PTT is primarily disturbing cells in the S phase and increasing the cell population and arrest in the G2/M phase [81]. As a result, PTT can induce radio-sensitization of the cells via disturbing cell cycle [82]. Their results are in accordance with our study, which showed cell cycle disturbance and reduction of cells in S-phase. Our study also showed the increase in population of apoptotic cells (sub Go/G1) after combination chemo-photothermal therapy. Therefore, applying a combination of LLLT and MTX and FA loaded Au@SiO₂ NPs (NPD) as breast cancer targeted nanoparticles could enhance the breast cancer therapy efficacy.

Выводы

In this study MTX and FA loaded Au@SiO₂ NPs was designed for target breast cancer therapy in combination with LLLT as noninvasive, FDA approved laser therapy. MTX and FA loaded Au@SiO₂ NPs with spherical morphology and mean diameter of 25nm and surface charge of -19.7 was obtained. This size and surface charge is in a suitable range to increase the bio-distribution of NPs. The successful targeted strategy of this novel developed NPs was approved with a higher cellular uptake percentage of MDA-MB-231 compared to MCF-7 as two breast cancer cell lines with different folate receptor expression. The MTT assay, DAPI staining and cell cycle study's results indicated that the combination of chemo-photothermal therapy showed synergistic effect and the cytotoxicity and apoptosis effect on both breast cancer cell lines especially on MDA-MB-231 cells was increased significantly(p <0.001). Since the Au@SiO₂ nanoparticles or LLLT showed no cytotoxic effects, it can be concluded that our therapeutic design has synergistic effects on targeted site. The findings of this study could be useful for designing future cancer therapy programs using bio-chemotherapy combined with low level lasers.

Доступность данных и материалов

Not applicable

Сокращения

Au@SiO₂ :

Silica coated gold

BC:

Breast cancer

DHFR:

Dihydrofolate reductase

DMSO:

Dimethyl Sulfoxide

FA:

Folate

LLLT:

Low level laser therapy

LSPR:

Локализованный поверхностный плазмонный резонанс

MSN:

Мезопористые наночастицы кремнезема

MTX:

Methotrexate

NIR:

Ближний инфракрасный порт

НП:

Наночастицы

PTT:

Photothermal therapy

RhoD:

rhodamine B

TFSNPs:

Thiol-functionalized silica-coated nanoparticles