Одноэтапный, быстрый и экологичный синтез многофункциональных наночастиц золота для визуализации и лечения опухолей

Введение

Доксорубицин (DOX) является широко используемым противоопухолевым препаратом, который широко используется в различных химиотерапевтических средствах против рака, таких как злокачественные опухоли крови [1], различные аденокарциномы [2,3,4,5], саркомы мягких тканей [6 ], и так далее. Однако длительные и высокие дозы DOX могут вызвать лекарственную устойчивость [7], тошноту [8], выпадение волос [9], а также острую и хроническую токсичность [10], что может привести к застойной сердечной недостаточности [11]. Следовательно, очень необходимо разработать носитель лекарственного средства с хорошей биосовместимостью и высокой способностью загружать лекарство. В последние годы появилось много наноматериалов, таких как квантовые точки [12, 13], хитозан [14, 15], кремниевые наноматериалы [16, 17], полимерные наноматериалы [18,19,20], флуоресцентные наночастицы [21,22, 23,24], а металлические наноматериалы [25,26,27,28,29,30] были разработаны в качестве переносчиков DOX для диагностики и лечения опухолей. Золотые наноматериалы широко используются из-за их уникальных химических и оптических свойств, низкой токсичности, хорошей биосовместимости и модификации поверхности контролирующих свойств [31, 32] среди этих наноматериалов. На данный момент существует три подхода к конъюгации DOX на ВНП. Первый заключается в конъюгировании DOX на поверхности ЗНЧ с помощью гидразина [25], гидрохлорида 1-этил-3- [3-диметиламинопропил] карбодиимида (EDC) [26], pH-чувствительного агента [27], DCC / Система NHS [28]. Второй - инкубировать ЗНЧ с DOX не менее 24 часов [29]. Третий - замена цитрата, конъюгированного на поверхности наночастиц золота (ЗНЧ), на DOX [30]. Хотя эти DOX-конъюгированные ЗНЧ использовались в терапии опухолей, их применение все еще ограничено из-за отсутствия достаточной специфичности. Недавно группа Эль-Сайеда [27] функционализировала ЗНЧ с помощью DOX, пептидов RGD и пептидов ядерной локализации (NLS). Изюминкой их работы является то, что ЗНЧ проникают в опухолевые клетки через рецептор-опосредованный эндоцитоз пептидов RGD, а затем входят в ядро ​​с помощью пептидов NLS, что заставляет DOX эффективно препятствовать синтезу ДНК. К сожалению, для связывания пептидов или лекарств слой за слоем на ЗНЧ требовалось не менее 120 часов, а на каждый процесс требовалось не менее 24 часов. Точно так же все упомянутые выше методы сталкивались с некоторыми общими проблемами, такими как множественность шагов, высокая стоимость, сложная подготовка и постобработка. Поэтому необходимо разработать простой и быстрый метод синтеза многофункциональных наноматериалов золота.

В этой статье мы впервые представили одноэтапную стратегию подготовки конъюгированных с DOX ВНП на основе химического состава DOX. Кроме того, мы представили удобный синтетический метод приготовления многофункционального транспортного вектора DOX для улучшения работы DOX, который можно использовать в диагностике и терапии опухолей. Ключевое отличие нашей работы от других заключается в том, что мы используем DOX, RGD-пептиды и NLS-пептиды в качестве восстанавливающих и стабилизирующих реагентов для изготовления ЗНЧ и конъюгирования всех этих трех веществ на поверхности ЗНЧ с образованием DRN-ЗНЧ. в это время. Наши предыдущие работы [33,34,35] доказали, что RGD и другие пептиды могут быть использованы для восстановления ионов золота для изготовления золотых наноматериалов. N-конец NLS можно модифицировать, используя последовательность цистеин-цистеин-тирозин (CCY) для построения CCYNLS, который может снижать ионы золота, сохраняя при этом нацеливающий эффект NLS [36]. Мы также обнаружили, что DOX обладает двумя фенольными гидроксильными группами с сильной восстанавливаемостью в основных условиях [37, 38], поэтому он также может восстанавливать ионы золота с образованием ЗНЧ. Более того, на противоопухолевый эффект DOX может не повлиять, потому что он внедряется в ДНК с помощью аминогруппы углерода 7 и гидроксильной группы углерода 9 [39]. Между тем, сера, кислород и азот в пептидах и DOX могут быть объединены с ЗНЧ для сохранения стабильности коллоидов [33]. Результаты показывают, что DRN-GNPs были успешно изготовлены и хорошо зарекомендовали себя при визуализации опухолей, диагностике и терапии (Схема 1). Насколько нам известно, это первый отчет по синтезу многофункциональных ЗНЧ, конъюгированных с DOX, RGD и NLS-пептидами, с использованием одноэтапного метода и их применению в диагностике и терапии опухолей.

Схематическое изображение синтеза DRN-GNPs, захвата клетками Hela и диагностики опухолей DRN-GNPs

Материалы и методы

Материалы

HAuCl ₄ 4H ₂ O был приобретен у Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, циклические пептиды RGD (аминокислотная последовательность аргинин-глицин-аспартат-тирозин-глутаминовая кислота (c (RGDyE))) и гидроксид натрия были такими же, как в ссылке. [35]. Доксорубицин был приобретен у Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. Пептиды CCYNLS (аминокислотная последовательность цистеин-цистеин-тирозин-пролин-пролин-лизин-лизин-лизин-аргинин-лизин-валин, CCYPPKKKRKV) поставлялись China Peptides Co., Ltd (Шанхай, Китай). Линия клеток Hela и линия клеток MCF-7 были предоставлены Guangzhou Youdi Biological Technology Co. Ltd. Фетальная бычья сыворотка (FBS) и среда Игла, модифицированная Дульбекко (DMEM), были приобретены у GibcoBRL Life Technologies. Набор для анализа пролиферации и цитотоксичности (MTT) был приобретен у Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co. Ltd.

Синтез DOX-GNP, NLS-GNP, DR-GNP, DN-GNP, DRN-GNP

Для приготовления DOX-GNPs раствор DOX (0,2 мг / мл, 1,0 мл) добавляли к раствору золотохлористоводородной кислоты (0,86 мМ, 1,0 мл) при перемешивании магнитной мешалкой, затем к раствору добавляли NaOH (2 M, 5 мкл). отрегулируйте pH. Для приготовления NLS-GNPs раствор пептидов CCYNLS (0,5 мМ, 1,0 мл) добавляли в раствор хлористоводородной кислоты (3,44 мМ, 1,0 мл) при перемешивании магнитной мешалкой, затем добавляли NaOH (2 M, 20 мкл) для регулирования pH. . Для приготовления DR-GNPs раствор DOX (0,2 мг / мл, 1,0 мл) и раствор пептидов RGD (1,0 мМ, 1,0 мл) добавляли в раствор хлористоводородной кислоты (1,72 мМ, 2,0 мл) при перемешивании магнитной мешалкой, затем NaOH. (2 M, 15 мкл) добавляли для регулирования pH. Для приготовления DN-GNPs раствор DOX (0,2 мг / мл, 1,0 мл) и раствор пептидов CCYNLS (0,5 мМ, 1,0 мл) добавляли в раствор хлористоводородной кислоты (1,72 мМ, 2,0 мл) при перемешивании магнитной мешалкой, затем NaOH. (2 M, 20 мкл) добавляли для регулирования pH. Для приготовления DRN-GNPs растворы DOX (0,2 мг / мл, 1,0 мл), пептидов CCYNLS (0,5 мМ, 1,0 мл) и пептидов RGD (1,0 мМ, 1,0 мл) добавляли в раствор хлористоводородной кислоты (1,72 мМ, 3,0 мл) при перемешивании на магнитной мешалке, затем добавляли NaOH (2 M, 35 мкл) для регулирования pH. Все реакции продолжались 30 мин при 100 ° C в системе дефлегмации и значении pH 10–12. Все ЗНЧ очищали центрифугированием при 55000 об / мин в течение 30 мин (Optima MAX-TL, Beckman Coulter). После удаления супернатанта ЗНЧ повторно диспергировали в сверхчистой воде.

Характеристика

Характеристики спектров ЗНЧ были выполнены с использованием спектрофотометра UV 3150 (Shimadzu, Япония), спектрометра Nicolet Avatar FTIR model 330 (Thermo, Америка) и рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии (XPS) ESCALab250 с теми же аналитическими условиями. как исх. [35]. Изображения ЗНЧ, полученные с помощью просвечивающего электронного микроскопа (ПЭМ), были получены с помощью ПЭМ (JEM-2100F, JEOL, Япония), работающего при ускоряющем напряжении 200 кВ.

Измерения динамического рассеяния света и дзета-потенциала

Анализатор дзета-потенциала Zeta PALS (Brookhaven Instrument Corporation) использовался для измерения динамического рассеяния света (DLS) DOX-GNP, NLS-GNP, DR-GNP, DN-GNP и DRN-GNP, которые работали под углом 90 °. угол с твердотельным лазером (λ =670 нм) при комнатной температуре. При оснащении электродом AQ-827 анализатор использовался для измерения дзета-потенциалов ВНЧ.

Анализ ICP

Количественный анализ Au в ВНП был таким же, как в исх. [35].

Стабильность DR-GNP, DN-GNP и DRN-GNP, диспергированных в PBS, HCl, NaOH, растворе NaCl

Мы смешали 100 мкл осажденных ЗНЧ и 500 мкл высокой концентрации 0,2 М PBS, 0,5 М HCl, 0,5 М NaOH и 1,0 М раствор NaCl соответственно. Двенадцать часов спустя мы сделали их фотографии и проверили их УФ-спектры поглощения.

Культура клеток

Клетки Hela и MCF-7 культивировали в инкубаторе (увлажненном 5% CO ₂ уравновешенный воздух) при 37 ° C в течение 24 часов. Культуральная среда представляла собой среду DMEM с 10% FBS. Количество живых клеток подсчитывается с помощью доски для подсчета клеток.

Анализ цитотоксичности свободных DOX и DRN-GNP

Клетки Hela и MCF-7 в экспоненциальной фазе добавляли в лунки 96-луночных планшетов (примерно 5 × 10 ³ клеток / лунку) и инкубировали в течение 24 ч соответственно. Затем DRN-GNP с концентрациями 0, 20, 40, 60, 80 и 100 мкг / мл (соответствующая концентрация DOX составляла 0,0, 7,8, 15,6, 23,4, 31,2 и 39,0 мкг / мл) инкубировали с каждой лункой и инкубируют 24 ч при 37 ° C соответственно. Контрольную группу устанавливали путем добавления только буферного раствора PBS, а ее жизнеспособность устанавливали за 100%. МТТ (20 мкл, 5 мг / мл) добавляли в каждую лунку и инкубировали при 37 ° C в течение примерно 4 часов. Затем культуральную среду осторожно отсасывали и добавляли 150 мкл двухдиметилсульфоксида в каждую лунку на 10 мин до полного растворения кристаллов. Считывающее устройство для микропланшетов (Thermo Multiskan Mk3) использовали для измерения значения OD в каждой лунке при 490 нм. Были подготовлены три лунки для каждой группы, и рассчитанные значения были выражены как среднее ± стандартное отклонение

Эксперимент по проточной цитометрии

Клетки Hela и MCF-7 в экспоненциальной фазе добавляли в каждую лунку двух 12-луночных планшетов (примерно 5 × 10 ⁴ клеток / лунку) и инкубировали в течение 24 ч соответственно. Затем раствор DRN-GNPs добавляли в каждую из лунок (конечные концентрации 0, 20, 40, 60, 80 и 100 мкг / мл) и инкубировали при 37 ° C в течение 24 часов соответственно. Удаление культуральной среды и добавление раствора трипсина (содержащего ЭДТА) в лунки для переваривания клеток. Затем удаляют раствор трипсина из лунок, добавляют культуральную среду в лунки и переносят клетки в центрифужные пробирки. После центрифугирования при 1000 g в течение 5 минут супернатант удаляли, клетки в каждой пробирке собирали и подсчитывали в растворе PBS. Примерно 5–10 × 10 ⁴ клеток переносили в другие пробирки для центрифугирования и снова центрифугировали при 1000 g в течение 5 мин. Удаление супернатанта и добавление в пробирки 100 мкл буферного раствора AnnexinV. Добавление 5 мкл AnnexinV-FITC и 5 мкл йодида пропидия в пробирки и осторожное перемешивание их с клетками. Пробирки инкубировали при комнатной температуре (20–25 ° C) в течение 15 минут в темноте, а затем тестировали с помощью проточного цитометра (BD Accuri C6).

Исследования клеточной культуры с помощью оптического рассеяния темного поля и просвечивающей электронной микроскопии

Клетки Hela и MCF-7 были имплантированы на предметное стекло с 8 лунками примерно 7 × 10 ³ ячейки для каждой лунки соответственно. DRN-GNPs добавляли в каждую лунку с конечной концентрацией 35 мкг / мл. После инкубации в течение 24 часов мы удалили физически и свободно абсорбированные ЗНЧ, промывая эти клетки раствором PBS три раза. Затем мы зафиксировали их 4% параформальдегидом в течение 20 минут, покрыли несколькими каплями глицерина и закрыли эти 8-луночные предметные стекла для культур клеток другими покровными стеклами. Для оценки клеток использовали темнопольный микроскоп (Zeiss Imager Z1) при увеличении × 200 и в отражательном режиме. Время экспозиции для светлых и темнопольных изображений при напряжении 5 В составляло 1 мс и 400 мс соответственно.

Для исследований ТЕА клетки Hela и MCF-7 инкубировали с DRN-GNP (35 мкг / мл) в течение 24 часов в колбе для культивирования клеток, соответственно. После инкубации и отсасывания смешанного раствора среды и DRN-GNP мы трижды промыли клетки раствором PBS, а затем переварили их трипсином. Клетки переносили в центрифужную пробирку с небольшим объемом среды DMEM. Клетки центрифугировали (1500 об / мин) в течение 10 минут, среду DMEM осторожно отсасывали и 3% раствор глутаральдегида (обычно в 40 раз больше объема материалов) осторожно добавляли в пробирку для фиксации клеток на дне емкости. тюбик более 1 ч. Далее клетки фиксировали добавлением 1% тетроксида осмия в течение 1 ч, обезвоживали этанолом, а затем заливали в Spurr (Sigma-Aldrich Co., США). Клетки извлекали из пробирки, разрезали на срезы, окрашивали водным уранилацетатом и цитратом свинца, а затем помещали на медную сетку (300 меш). Образцы были измерены с помощью просвечивающего электронного микроскопа FEI TECNAI-12 (рабочее напряжение 120 кВ).

Эксперименты на животных

Животные

Атимические самки голых мышей были приобретены в экспериментальном центре животных Южного медицинского университета (Гуанчжоу, Китай) для r in vivo тест противоопухолевой терапии. Все эксперименты на животных проводились в соответствии с Правилами содержания животных Министерства здравоохранения Китайской Народной Республики (Документ № 55, 2001) и Руководством по уходу и использованию лабораторных животных Китайского фармацевтического университета.

Терапевтическая эффективность свободного DOX и его конъюгатов у мышей с опухолями

Вкратце, 36 голых мышей (возраст 5–6 недель, вес 16–18 г) были случайным образом разделены на шесть групп. Им подкожно вводили клетки Hela (5 × 10 ⁶ клетки в PBS) в правую подмышечную ямку. Через пять дней мышам контрольной группы вводили через хвостовую вену физиологический раствор (0,154 моль / л, 0,2 мл). Мышам групп свободных DOX, DR-GNP, DN-GNP и DRN-GNP также вводили в хвостовую вену. Чтобы сравнить противоопухолевую эффективность DRN-GNPs между внутривенной инъекцией и инъекцией опухоли, мы установили группу, которой вводили равное количество DRN-GNPs на участке опухоли. Эти пять групп поддерживали дозу 0,3 мг / кг эквивалента свободного или конъюгированного DOX для каждой мыши. Каждой мыши делали инъекцию в хвостовую вену или опухоль один раз в день. Вес тела и объем опухоли каждой мыши контролировали каждый день в течение 14 дней. Для дальнейшего изучения терапевтических эффектов DOX, DR-GNP, DN-GNP и DRN-GNPs опухоли шести групп были вырезаны для патологического анализа через 14 дней лечения. Опухоли и внутренние органы сердца, печени, селезенки, легких и почек мышей выделяли от мышей, фиксировали 10% формалином с нейтральным буфером и заливали парафином. Срезы опухолевых тканей окрашивали гематоксилином и эозином (H&E) и исследовали с помощью оптического микроскопа Olympus.

Результаты и обсуждение

Синтез и характеристика DOX-GNP, NLS-GNP, DN-GNP, DR-GNP, DRN-GNP

При синтезе DOX-GNPs, когда раствор NaOH был добавлен к смешанному раствору DOX и раствору хлорзавр, цвет раствора сразу же менялся с оранжевого на мелко-пурпурный, затем он становился винно-красным при 100 ° C в система флегмы при магнитном перемешивании в течение одной минуты, что указывает на образование DOX-GNPs. Результат показал, что способность DOX к восстановлению очень сильна, поскольку DOX обладает двумя фенольными гидроксильными группами (углерод № 6 и № 11) с высокой восстанавливаемостью в основных условиях. Реакция продолжалась 30 мин, пока цвет не изменился.

Во избежание путаницы оранжево-красного цвета DOX и винно-красного цвета ВНЧ мы представили дополнительные доказательства, охарактеризовав их спектры УФ-поглощения (как показано на рис. 1а). DOX имеет характерный пик поглощения около 485 нм и пик при 530 нм; однако пик при 480 нм исчез в спектре раствора продукта и возник характеристический пик при 520 нм, характерный для пика поглощения ЗНЧ при поверхностном плазмонном резонансе (ППР). Даже в этом случае формирование ЗНЧ еще не полностью определено между 520 нм ЗНЧ и 530 нм пика DOX. Принимая во внимание, что ЗНЧ будут осаждаться при высокоскоростном центрифугировании, а молекулы DOX - нет, мы можем видеть фиолетовый осадок в продукте дна центрифужной пробирки (вставка на рис. 1a (3-4)) и DOX do. нет ни того, ни другого (вставка к рис. 1а (1-2)).

а Спектры поглощения DOX в УФ-видимой области и исходных DOX – ЗНЧ, вставка ( a ) - изображения ДОКС (1, 2) и ДОКС-ЗНЧ (3, 4) до (1, 3) и после центрифугирования (2, 4). б ПЭМ-изображение DOX – ЗНЧ. c FTIR-спектры DOX и свежеприготовленных DOX – ЗНЧ. г XPS спектр DOX – ЗНЧ

DOX имеет красную флуоресценцию при облучении ультрафиолетовым светом 365 нм; однако флуоресценция DOX исчезла после синтеза ЗНЧ. Есть две возможные причины; Во-первых, коэффициент экстинкции ЗНЧ очень высок, они имеют тенденцию гасить флуоресценцию молекул, когда они расположены близко к поверхности ЗНЧ (<5 нм) [40]. Если расстояние увеличивается до 20 нм или более, плазмонное поле наночастиц находится слишком далеко, чтобы погасить сигнал их флуоресценции [41]. Другая причина заключается в том, что флуоресцентная группа DOX была разрушена после того, как сыграла роль восстановителя. Как показано на рис. 1c, хотя количество пиков инфракрасного поглощения DOX-GNP значительно меньше, чем у DOX, многие характеристики DOX все еще сохраняются, например, характерные пики поглощения в инфракрасном диапазоне на 2910 см ^-1 (C-H, растягивающая вибрация) [42], 1631 см ⁻¹ (колебание при растяжении карбонила) [43], 1114 см ⁻¹ (Колебание при растяжении C-O, C-N) [44] и 867 см ⁻¹ (N-H, C-H, изгибающая вибрация вне плоскости) [45] соответственно. Эти репрезентативные пики DOX также отображались в спектрах DOX-GNP, что указывало на то, что DOX успешно связывается с DOX-GNP. Интересно, что пик на 1214 см ⁻¹ В спектрах DOX-ЗНЧ исчез характерный пик валентного колебания С-О фенольной гидроксильной группы [46]. Фенольная группа может восстанавливать ионы Au до ЗНЧ, а затем переносится на карбонильную группу. Мы предполагаем, что на эффект DOX это не влияет, потому что он внедряется в ДНК за счет аминогруппы углерода 7 и гидроксильной группы углерода 9 [39].

Мы можем наблюдать, что размер частиц DOX-GNPs составляет около 6 нм из результатов ПЭМ (рис. 1b). Расчетное соотношение Au (I) составило 31,93% от XPS-спектра DOX-GNP (рис. 1d), что достаточно высоко для поддержания стабильности коллоида. Однако, когда осадок DOX-GNPs диспергировали в 0,2 M буферном растворе PBS при высокоскоростном центрифугировании после удаления супернатанта, цвет этого раствора становился пурпурно-черным, и были видимые нерастворимые хлопья. Это указывало на то, что стабильность DOX-GNP была не очень хорошей в среде с высокой концентрацией соли. Это можно объяснить тем, что DOX имеет только одну аминогруппу, но не имеет сульфгидрильной группы, которой недостаточно для DOX, чтобы соединить поверхность ЗНЧ через связь Au-S и Au-N. Поэтому необходимы дополнительные усилия, если DOX-GNP используются в качестве контрастного вещества и противоопухолевого материала для визуализации опухолей и терапии.

Мы синтезировали DRN-GNP с DOX, пептидами RGD и пептидами NLS в качестве восстанавливающих и стабилизирующих агентов. Пептиды RGD могут специфически нацеливаться на некоторые опухолевые клетки, сверхэкспрессирующие α _v β ₃ интеграин, а пептиды NLS могут специфически нацеливаться на ядро. На рис. 2а показаны УФ-видимые спектры изготовленных DOX-GNP, NLS-GNP, DRN-GNPs; Пик поглощения их поверхностных плазмонов составлял 520–530 нм [33]. На врезке также видно, что ВНП имели ярко-красный винный цвет. Изображения ПЭМ (дополнительный файл 1:Рисунок S1) показывают, что размер частиц NLS-GNPs и DRN-GNPs составлял примерно 10 нм и 5 нм, а GNPs распределены равномерно, явной коагуляции не обнаружено.

а Спектры поглощения в УФ-видимой области и фотоизображения DOX – ЗНЧ ( a ), NLS-GNP ( b ) и ДРН-ВНП ( c ). б УФ-видимые спектры поглощения основного DOX, пептидов RGD, пептидов NLS и супернатанта DRN-GNP. c FTIR-спектры пептидов NLS, NLS-GNP и DRN-GNP. Расстояние между спектром ЗНЧ и спектром пептидов NLS увеличено для отчетливого контраста

Чтобы подтвердить синтез NLS-GNPs и DRN-GNPs, мы охарактеризовали FTIR-спектры NLS-пептидов и GNPs на рис. 2c. Некоторые пики FTIR NLS-пептидов были обнаружены в спектрах NLS-GNP и DRN-GNP, например, пик поглощения валентных колебаний C-H (2840–2972 см ^-1 ) [47], C =O пик поглощения валентных колебаний (1630–1700 см ⁻¹ ) [48], и =пик изгибных колебаний в плоскости C-H (1300–1475 см ⁻¹ ) [49]; это указывает на то, что пептиды CCYNLS успешно конъюгированы на поверхности ЗНЧ. Мы также обнаружили, что пик колебаний бензольного скелета тирозинового конца в пептиде NLS при 1529 см ^-1 и пик валентного колебания C-O фенольного гидроксила при 1193 см ^-1 [49] исчез в инфракрасных спектрах NLS-GNPs и DRN-GNPs, это означает, что бензольный скелет тирозинового конца был перенесен в структуру хинона после того, как сыграл свою роль восстановительного агента.

Мы центрифугировали DRN-GNPs с высокой скоростью, собрали надосадочную жидкость, которая была почти бесцветной, а затем проверили, остались ли реагенты, с помощью спектров УФ-видимой области на рис. 2b. Пики УФ-поглощения пептидов RGD и NLS происходят от остатков тирозина, пик поглощения находится при 275 нм. Однако фенольная гидроксильная группа превратилась в отрицательные ионы кислорода в щелочных условиях, что увеличивает электронную плотность бензольного кольца, пик смещается в красный цвет до 292 нм. Мы не видели характерного пика в УФ-видимом спектре супернатанта DRN-GNPs, что означает, что оба пептида принимали участие в реакции. DOX имеет три пика поглощения в диапазоне 450-600 нм, но супернатант DRN-GNP не имеет этих пиков. Кроме того, DOX не был обнаружен в супернатанте DRN-GNP, потому что его цвет был светло-коричневым, но цвет DOX в основных условиях был прозрачным светло-фиолетовым. Можно сделать вывод, что три материала практически полностью реагируют. Аналогичным образом, DR-GNP и DN-GNP также объясняются таким же образом, см. Дополнительный файл 1:Рисунок S2.

Мы использовали XPS-спектроскопию для изучения валентности Au для NLS-GNPs и DRN-GNPs. Как показано на рис. 3a, b, два пика с энергиями связи около 83,6 и 87,0 эВ соответствуют излучению фотоэлектронов Au 4f7 / 2 и 4f 5/2 [33]. Их энергетическое положение связи Au 4f7 / 2 обоих ЗНЧ составляет около 84,0 эВ. Для NLS-GNPs его можно деконволютировать на Au (0) (83,5 эВ) и Au (I) (84,1 эВ), их соотношение площадей пиков составляет 57% и 43% соответственно. Аналогичным образом, для DRN-GNPs его можно деконволюционировать на Au (0) (83,6 эВ) и Au (I) (84,4 эВ), отношения площадей пиков составляют 62% и 38% соответственно, таким образом, они имеют более высокую долю Au (I). Заряд может образовывать комплексы Au (I) -S, которые помогают поддерживать коллоидную стабильность ЗНЧ. Интересно, что мы идентифицировали три типа S в XPS-спектрах NLS-GNP, DN-GNP и DRN-GNPs в дополнительном файле 1:Рисунок S3. Синяя и черная кривые представляют степени окисления серы, фиолетовые кривые представляют связь S-H, а зеленая кривая представляет связь Au-S. Образование связи Au-S показало, что пептиды NLS были успешно конъюгированы на поверхности этих трех ЗНЧ.

XPS-спектр Au 4f из ( a ) NLS-GNPs, ( b ) ДРН-ВНП. Энергия связи Au 4f7 / 2 исходных спектров (черный) и аппроксимированных результатов (красный) может быть разложена на две составляющие:Au (0) -синяя кривая и Au (I) -пурпурная кривая. Спектры поглощения в УФ-видимой области и изображения DRN-GNP, диспергированных в PBS, NaCl, NaOH и HCl, соответственно ( c ).

Более того, пики N 1, C 1 и O 1 в спектрах XPS продемонстрировали, что пептиды и DOX были присоединены к ЗНЧ (дополнительный файл 1:Рисунок S4).

Спектры XRD (дополнительный файл 1:Рисунок S5) показали, что кристаллическая структура этих ЗНЧ представляет собой гранецентрированную кубическую кристаллическую структуру, поскольку все их спектры XRD содержат четыре пика при 38,2 °, 44,5 °, 64,7 ° и 77,8 °. соответствующие плоскостям (111), (200), (220) и (311) [33].

Стабильность DRN-GNP

Данные динамического рассеяния света (DLS) и дзета-потенциала этих пяти ЗНЧ отображены в таблице 1; их гидродинамический размер больше, чем у ПЭМ, что может быть связано с определенным количеством гидратированных молекул вокруг ядра водорастворимых ЗНЧ. Их дзета-потенциалы были отрицательными из-за карбоксильной группы, сопряженной на поверхности ЗНЧ. Раствор ЗНЧ показывает хорошую коллоидную стабильность, когда абсолютное значение дзета-потенциала превышает 30 мВ; чем больше абсолютное значение, тем лучше стабильность. Из таблицы 1 видно, что все они обладают хорошей коллоидной стабильностью. Для сравнения, значение дзета-потенциала NLS-GNPs было самым высоким, что может быть связано с тем, что их поверхность заполнена пептидами NLS, которые могут образовывать прочную связь Au-S через тиоловая группа. Абсолютное значение дзета-потенциала DOX-GNP было близко к 30 мВ; это согласуется с ранее упомянутым, что DOX-GNP не были очень стабильными, когда они были диспергированы в буферном растворе PBS. Данные спектров отображались в дополнительном файле 1:Рисунок S6.

Изменения характеристических полос поверхностного плазмонного резонанса (ППР) ЗНЧ можно использовать для определения агрегации ЗНЧ с помощью спектрометрии УФ-видимой области [49]. Мы измерили их УФ-видимые спектры и сделали фотографии DRN-GNPs (рис. 3c), когда они были диспергированы в высокой концентрации соли (1 M NaCl и 0,2 M PBS), сильной кислоте (0,5 M HCl) и сильном основании ( 0,5 М NaOH) растворов. Ни изменения цвета раствора, ни сдвига УФ-видимого спектра не наблюдалось в различных суровых условиях, за исключением раствора HCl, в котором их цвет изменился на слегка пурпурный, а пик ультрафиолетового поглощения сдвинулся в красную сторону примерно на 20 нм, что означает, что ЗНЧ слегка коагулируют в условиях сильной кислоты. . Причина может заключаться в том, что коллоидная стабильность отрицательно заряженных ЗНЧ нарушалась в сильнокислой среде, но не влияла в нейтральном буфере PBS и щелочной среде. Мы можем сделать вывод, что DRN-GNPs очень стабильны в условиях с высоким содержанием соли и щелочей, что указывает на то, что наши синтезированные DRN-GNPs, как ожидается, будут использоваться для визуализации клеток in vitro и противоопухолевой терапии in vivo.

Визуализация опухолевых клеток с плазмонным рассеянием темного поля и микроскопия клеток с помощью ТЕМ

Для специфической целевой визуализации опухолевых клеток с DRN-GNPs мы выбрали клетки Hela в качестве тестовой группы и клетки MCF-7 в качестве контрольной группы. Причина в том, что клетки Hela сверхэкспрессируют интегрин α _v β ₃ [50] но клетки MCF-7 этого не делают, поэтому он не имеет специфического связывания с RGD; это хорошая контрольная группа [51]. Поглощение DRN-GNP этими двумя клеточными линиями после инкубации в течение 24 часов с конечной концентрацией 35 мкг / мл оценивали с помощью вертикальной флуоресцентной микроскопии в модели темного поля. Клетки, обработанные без ЗНЧ, не показывают плазмонного светорассеяния (фиг. 4 клетки A-Hela, клетки 5C-MCF-7). Изображения клеток Hela, обработанных DRN-GNPs, показывают, что сигналы рассеяния от GNPs сильно локализованы в ядре (рис. 4b и 5e). Однако мы с трудом могли видеть рассеянный свет от клеток MCF-7 после их инкубации с DRN-GNPs, даже несмотря на то, что небольшое количество GNPs могло проникнуть в опухолевые клетки благодаря пассивному усиленному эффекту проницаемости и удерживания опухолевых клеток (EPR effect) (Figs. 4d and 5f), the enhanced permeability and retention (EPR) effect is a unique phenomenon of solid tumors related to their anatomical and pathophysiological differences from normal tissues. For example, angiogenesis leads to high vascular density in solid tumors, large gaps exist between endothelial cells in tumor blood vessels, and tumor tissues show selective extravasation and retention of macromolecular drugs [52]. So they might not be clearly detected under the same experimental condition. The results demonstrated that the endocytosis of Hela cells via receptor-mediated endocytosis was facilitated by the RGD peptides on the GNPs’ surface. The NLS peptides could also maintain their activity to specifically targeted nucleus. So our synthesized DRN-GNPs could be a very potential contrast agent for tumor targeted imaging.

The contents of the rows are listed as follows:“PBS buffer” represents the cells incubate with PBS buffer, “DRN-GNPs” represents the cells incubate with DRN-GNPs. The subscript of “1” represents the bright field images of cells, “2” represents the dark field images of cells, and “3” represents the overlapping images (bright-field and dark-field) of cells. All of the scale bars are 20 μm. The picture of E is a small region chosen from B₃ in Fig. 4, the picture of F is a small region chosen from D₃ in Fig. 4, the scale bars are 10 μm

TEM images of DRN-GNPs incubated in Hela and MCF-7 cells for 24 h. A₁ , A₂ , and A₃ are corresponding to HeLa cells while B₁ and B₂ are to MCF-7 cells

Table 2 shows the ratio values between the cells’ densitometric mean grey and the background in the same image, which has a positive correlation with the taken up amounts of DRN-GNPs by these two cell lines. The ratios of the cells incubated with PBS buffer and the MCF-7 cells were nearly 1.0, the brightness of cells was nearly close to the background. The ratio of Hela cells incubated with DRN-GNPs was 4.80, that means the synthesized DRN-GNPs could be specifically targeted and entered the tumor cells overexpressed the integrin α_v β ₃ .

To confirm receptor-specific internalization of the DRN-GNPs, we investigated the cellular uptake of the DRN-GNPs by Hela and MCF-7 cells utilizing the TEM technique (see Fig. 5). There was a large amount of DRN-GNPs localized in the nucleus and cytoplasm regions of α_v β ₃ -positive Hela cells (Fig. 5(A₁ - A₃ )). On the other hand, only a negligible amount of particles was found inside the cytoplasm regions of α_v β ₃ -negative MCF-7 cells (Fig. 5(B₁ -B₂ )), they might be accumulated in the MCF-7 cells by means of the passive targeting EPR effect. We found that there were high contrast black continuous regions in the MCF-7 cells’ nucleus; they were uranyl acetate, which stained the nucleus, and they were different from the granular particles in the nucleus of Hela cells. The TEM images are consistent with the dark-field imaging results, indicating that the RGD and NLS peptides on the surface of GNPs facilitated the DRN-GNPs targeting Hela cells’ nucleus. So our synthesized DRN-GNPs could be used as a perfect contrast agent for tumor targeted imaging and diagnosis.

Cellular Therapeutic Efficacy Evaluation

To evaluate the therapeutic efficacy of DOX and DRN-GNPs at cell level, MTT assay was firstly carried out to study cell viability of Hela and MCF-7 cells under the treatment of these two samples for 24 h. DRN-GNPs demonstrated almost the same inhibition effect by killing nearly 70% of cells at the same DOX’s concentration (39.0 μg/mL, Fig. 6(A, B)). In line with the MTT results, when the concentration of DRN-GNPs was 40 μg/mL, the number and state of the Hela and MCF-7 cells were relatively good, so the concentration of 35 μg/mL was the suitable concentration for imaging. We observed that when the DRN-GNPs’ concentration was high to 60 μg/mL (Fig. 6(C₃ )), the Hela cells became necrosis obviously. When the concentration of DRN-GNPs goes high to 100 μg/mL, salient reduction of the number cells can be observed and clear cellular morphological change as the characteristic of necrosis was observed. The same concentration of conjugated DOX still exhibited nearly the same anti-tumor efficacy compared with the free DOX. These results indicated that our synthesized DRN-GNPs could be used not only as a contrast agent but also as a good drug delivery system.

MTT assay was used to qualitatively display in vitro anti-tumor activity of DOX and DRN-GNPs on Hela (a ) and MCF-7 cells (b ) for 24 h (100%). The concentrations of C₀ -C₅ are 0, 20, 40, 60, 80, 100 μg/mL for DRN-GNPs; the corresponding DOX’s concentrations are 0, 7.8, 15.6, 23.4, 31.2, 39.0 μg/mL. Data are represented as means ± standard deviations of triplicate samples (n =3). Images of Hela cells incubated with different concentration of DRN-GNPs (c )

The result detected by the flow cytometry in Fig. 7 also demonstrates the anti-tumor efficacy of DRN-GNPs. Viability of Hela cells when exposed to DRN-GNPs of different concentrations was measured by flow cytometry based assays. Two modes of cell death, apoptosis and necrosis, were measured using Annexinv-FITC and propidium iodide (PI) dyes, respectively (Fig. 7). Similar to the results of MTT assay, the data showed that DRN-GNPs induced cell necrosis was dose-dependent. The proportion of necrotic cells was 8% without incubating with DRN-GNPs; when the concentration was high to 100 μg/mL, the proportion of necrotic cells was 23.84%; that means our synthesized DRN-GNPs could kill Hela cells efficiently. The difference between the results of MTT and flow cytometry can be explained that the difference of cell number and the methods.

Representative two-dimensional contour density plots to determine fractions of live, apoptotic, and necrotic cells, when exposed to DRN-GNPs at different concentrations (0–100 μg/mL) for 24 h, respectively. Cell necrosis and apoptosis were measured by using PI and Annexinv-FITC dyes

Therapy Evaluation of DRN-GNPs in Tumor-Bearing Mice

To further determine whether DRN-GNPs induced a combined therapeutic effect on tumor cells in vivo, we evaluated the anti-tumor effect of DRN-GNPs in tumor-bearing mice for long-term intravenously injection of drugs. The saline group and the drugs of free DOX, DR-GNPs, and DN-GNPs intravenously injected groups were set as the control groups, in which the concentration of conjugated DOX was the same as that of the free DOX. We observed that the tumor sizes of DRN-GNPs-treated groups were obviously smaller than that of the saline, DOX, DN-GNPs, and DR-GNPs-treated groups (Fig. 8a). The tumor volume and body weight of the mice were monitored every 2 days. Significant variation of tumor volume and tumor weight among all of the treated groups is shown in Fig. 8d, f; the tumor volumes and tumor weight of DN-GNPs and DR-GNPs-treated groups were smaller than that of the free DOX-treated group, but still larger than that of the DRN-GNPs-treated groups because of the less targeted activity. That might be because DOX molecules are small, lack targeting, and they have a short half-life in vivo; therefore, they might be cleared out quickly. However, DRN-GNPs possess of strong stability in the blood system, long half-life, and highly targeted ability, so they can be targeted to the tumor site, and then play the anti-tumor effect of DOX. Between the DRN-GNPs intravenously injected and tumor-injected groups, the anti-tumor efficacy of the latter group is better than that of the former group because the drugs do not need a complex system of blood circulation into the focus. The tumor inhibition rate of DOX is less than 50%, and the rates of all of the DOX-conjugated GNPs are larger than 50%; they can be high to 66.7% and 57.7%, respectively. The HE stain results showed that there was a certain degree of damage for liver organs in the intravenous injected DRN-GNPs group (Fig. 9). Furthermore, the bio-toxicity of DOX, DR-GNPs, and DN-GNPs on tumor-bearing mice were also assessed by histological analysis. As shown in Fig. 8b, tumor cell volume of saline group is comparatively larger than that of treatment groups, and tumor cells demonstrate with more mitotic figures. All the results showed that the tumor inhibition effect of DRN-GNPs was the best among the GNPs. Thus, our synthesized DRN-GNPs could be used as a perfect DOX delivery system for tumor therapy.

а Tumor images isolated from tumor-bearing mice after treatment of saline, free DOX, DN-GNPs, DR-GNPs, and DRN-GNPs (tumor injection and intravenous injection). б The histological images of tumors of the mice after treated with saline, free DOX, DN-GNPs, DR-GNPs, and DRN-GNPs (tumor injection and intravenous injection). c Body weight, tumor volume (d ), tumor inhabitation rate (e ), and tumor’s weight (f ) of tumor-bearing mice during 14 days treatment; data are represented as means ± standard deviations (n =6)

The histological images of the main organs (heart, liver, spleen, lung, and kidney) of the mice after treated with saline, free DOX, DR-GNPs, DN-GNPs, and DRN-GNPs (tumor injection and intravenous injection)

Заключение

In this study, we have successfully developed a one-step method to prepare the multifunctional DRN-GNPs in about half an hour. The GNPs have also been successfully applied to the tumor targeted imaging and tumor therapy both in vitro and in vivo. The success shows that it is possible to make a fully use of the reducing and stabilizing ability of the DOX, RGD peptides, and CCYNLS peptides, which will make the GNPs’ synthesis process simple and efficient. More importantly, the one-step synthesized DRN-GNPs still possess good colloidal stability in the physiological system, and the peptides conjugated on the surface remained the targeted ability and DOX still possesses its anti-tumor ability. To our knowledge, this is the first report for synthesis of DOX, RGD and CCYNLS peptides conjugated multifunctional GNPs with a one-step method, and their application in tumor imaging, diagnosis, and therapy. This strategy is in line with the development direction of green chemistry, and it would lay the foundation for large-scale applications within the near future. We expect that our report will provide a new way for the one-step synthesis of multifunctional nanomaterials used for tumor imaging and therapy.

Доступность данных и материалов

All datasets are presented in the main paper or in the additional supporting files.

Сокращения

CCYNLS peptides:

The sequence of amino acid is cysteine-cysteine-tyrosine-proline-proline-lysine-lysine-lysine-arginine-lysine-valine

Cyclic RGD peptides:

The sequence of amino acid is arginine-glycine-aspartate-tyrosine-glutamic acid

DOX:

Доксорубицин

DR-GNPs:

DOX-RGD-GNPs, DN-GNPs:DOX-NLS-GNPs, DRN-GNPs:DOX-RGD-NLS GNPs

GNPs:

Наночастицы золота