Приготовление и фармакокинетическое исследование липосом с длительной циркуляцией даидзеина

Фон

Даидзеин - это природное соединение, которое содержится исключительно в соевых бобах и других бобовых культурах, и по структуре относится к классу соединений, известных как изофлавоны. Сообщалось о фармакологической активности даидзеина в профилактике и терапии сердечно-сосудистых заболеваний [1], облегчении менопаузы [2], остеопорозе [3], снижении риска некоторых гормональных раковых заболеваний [4] и противовоспалительном эффекте [ 5]. Из-за химической структуры даидзеин имеет очень плохую растворимость в воде и липидах и в основном абсорбируется в кишечном тракте после перорального приема и легко метаболизируется с образованием конъюгата глюкуроновой кислоты или конъюгата серной кислоты [6,7,8,9,10]. Чтобы улучшить его низкую биодоступность, недавние исследования были сосредоточены на его новой системе доставки лекарств, такой как фосфолипидный комплекс даидзеина [11], самоорганизующаяся мицелла даидзеина [12] и наночастицы полимолочной кислоты [13].

Липосома - это эффективная система-носитель лекарственного средства, которая может инкапсулировать гидрофобные лекарственные средства, гидрофильные лекарственные средства и лекарственные средства, взаимодействующие с фосфолипидами [14, 15]. Благодаря очень хорошей биосовместимости липосомы могут увеличивать кишечную проницаемость, уменьшать химическое и биологическое разложение и уменьшать неспецифические побочные эффекты лекарств [16]. Однако использование обычных липосом не может полностью преодолеть их связывание с компонентами сыворотки и захват системой мононуклеарных фагоцитов (MPS) [17]. Чтобы преодолеть такие проблемы, в последние несколько лет были разработаны липосомы с длительной циркуляцией, модифицированные гидрофильным или гликолипидом, таким как (полиэтиленгликоль) (PEG) или моносиалоганглиозид (GM1). Было показано, что присутствие ПЭГ на поверхности долго циркулирующего липосомального носителя формирует слой гидрофильной защитной пленки, которая может препятствовать взаимодействию липосом с различными компонентами сыворотки и их поглощению путем распознавания фагоцитами [18]. Следовательно, липосомы с длительной циркуляцией могут увеличивать время кровообращения за счет снижения поглощения MPS и тем самым улучшать биодоступность лекарств [19, 20]. В этой статье был исследован способ приготовления липосом с длинной циркуляцией даидзеина (DLCL), а также его высвобождение in vitro и фармакокинетические характеристики у крыс. Результаты представляют собой экспериментальную основу для клинического применения DLCL.

Методы

Материалы

Фосфатидилхолин сои (SPC) был приобретен в Lipoid GmbH (Германия). Холестерин и DSPE-mPEG2000 были приобретены у AVT Pharmaceutical Co., Ltd. (Шанхай, Китай). Метанол и ацетонитрил для ВЭЖХ были закуплены у TEDIA Company (США). Хлороформ и метанол (аналитическая чистота) были получены от Sinopharm Chemistry Reagent Co., Ltd. (Шанхай, Китай). Воду очищали с помощью системы очистки воды Milli-Q® ((Millipore, США). Daidzein (чистота ≥ 98%) был приобретен у Yuanye Biotechnology Co., Ltd. (Шанхай, Китай). Апигенин (внутренний стандарт, IS, ≥ 98% чистоты) был приобретен у Delge Pharmaceutical Technology Co., Ltd. (Нанкин, Китай). Гидрат фосфорновольфрамовой кислоты (аналитическая чистота) был приобретен у Macklin Co., Ltd. (Шанхай, Китай). Твин-80 и этил ацетат получали от Sigma (штат Миссури, США). Муравьиная кислота (MS-grade) была приобретена у Fischer (США).

Животные

Десять крыс-самцов Sprague-Dawley (200–210 г) были приобретены в центре профилактики и контроля заболеваний провинции Хубэй с номером лицензии SCXK (E) 2017–0012. Эксперимент на животных был одобрен этическим комитетом Университета Хубэй и соответствовал руководству по уходу и использованию лабораторных животных.

Приготовление нанолипосом с длинной циркуляцией даидзеина (DLCL)

Принимая размер частиц и эффективность инкапсуляции (EE) в качестве показателей оценки, был проведен ортогональный дизайн четырех факторов и трех уровней (таблица 3) для оптимизации наилучшего соответствия молярного отношения SPC к холестерину (A), массового отношения препарата (даидзеина) к общему липиду (SPC и холестерин) (мас. / мас.) (B), температуре гидратации (C) и времени ультразвуковой обработки (D) при условии 5% содержания DSPE-mPEG2000 [21, 22] .

DLCL получали методом тонкопленочного испарения-ультразвуковой обработки, кратко описанного следующим образом [21]:фосфатидилхолин сои, холестерин, DSPE-mPEG2000 и даидзеин растворяли в круглодонной колбе с 10 мл хлороформ-метанола (1:4, об. / v) смесь. В условиях вакуума и 40 ° C (водяная баня) смесь сушили до образования тонкой пленки в роторном испарителе (RE-2000A, Shanghai Yi-Rong Biochemical Instrument Factory, Китай), а затем гидратировали 20 мл. ультрачистая вода обработкой ультразвуком (80 Вт) в течение 24 мин на ледяной бане. Суспензию липосом трижды экструдировали путем фильтрации поочередно через микропористую мембрану 0,45 мкм и 0,22 мкм. Приготовленный раствор DLCL хранили при 4 ° C. Для длительного хранения требуется добавление 3% сахарозы (используемой в качестве лиопротектора) к суспензии DLCL и сохранение сублимационной сушки при -20 ° C.

Определение даидзеина в DLCL с помощью ВЭЖХ

Колонка представляла собой аналитическую колонку Phenomenex ODS (150 мм × 4,6 мм, 5 мкм), соединенную с защитной колонкой (30 мм × 10 мм, 3 мкм) с температурой колонки 40 ° C. Подвижная фаза состояла из 10 мМ водного раствора ацетата аммония (A) и метанола (B) со следующим градиентным элюированием:0–3,0 мин, от 45% B до 80% B; 3,0–4,0 мин, 80% B; 4,0–6,0 мин, от 80% B до 45% B. Скорость потока составляла 1 мл / мин. Длина волны обнаружения составляла 240 нм. Объем инъекции составлял 10 мкл. Линейный диапазон даиазеина составлял 0,313–50 мкг / мл, а уравнение регрессии было y =35 461 x + 1802,4, R ² =0,9999. Время удерживания даидзеина составляет 4,30 мин, и не было обнаружено никакого влияния препарата DLCL на определение даидзеина (рис. 1). Прецизионность, воспроизводимость, стабильность и извлечение образцов этого метода анализа были строго исследованы и соответствовали требованиям количественного анализа (таблица 1).

Типичные хроматограммы холостых липосом ( a ), эталонное вещество даидзеин ( b ) и образец DLCL ( c )

Скрининг по рецепту с помощью ортогонального теста

Принимая размер частиц и эффективность инкапсуляции (EE) в качестве показателей оценки, был выполнен ортогональный дизайн четырех факторов и трех уровней для оптимизации наилучшего соответствия молярного отношения SPC к холестерину (A), массового отношения лекарственного средства (даидзеина) к общему количеству липидов (SPC и холестерин) (мас. / мас.) (B), температуре гидратации (C) и времени ультразвука (D) при условии 5% содержания DSPE-mPEG2000 [21, 22].

Диаметр и морфология DLCL

Размер частиц и дзета-потенциал приготовленного раствора DLCL измеряли с помощью лазерного анализатора размера частиц (Zetasizer Nano90, Malven Instruments Limited, Вустершир, Великобритания) при комнатной температуре, 230 В и 50 Гц. Приготовленный раствор DLCL разбавляли в 10 раз чистой водой и затем извлекали с края медной сетки пинцетом. После сушки при комнатной температуре и встречного окрашивания водным раствором фосфорновольфрамовой кислоты (2%, мас. / Об.) Морфологию полностью высушенного DLCL наблюдали с помощью автоэмиссионного просвечивающего электронного микроскопа (JEM-2100 (HR), JEOL Ltd. , Токио, Япония) при разгоне 200 кВ и передатчиком LaB6.

EE и загрузка DLCL лекарствами

ЭЭ и содержание лекарственного средства в подготовленном DLCL были проанализированы с помощью метода диализа, описанного следующим образом:(1) 500 мкл приготовленного раствора DLCL было добавлено в диализный мешок с отсечкой по молекулярной массе 8000–14000 (BioSharp Sai-Guo Biotechnology Co., LTD), затем плотно связали два конца диализного мешка и поместили диализный мешок в 20 мл воды (диализная среда). После вибрации с помощью шейкера в течение 12 часов отбирали 1 мл диализной среды и центрифугировали при 12000 об / мин в течение 10 минут для определения концентрации свободного лекарственного средства ( C ₁ ) в супернатанте. (2) Пятьсот микролитров приготовленного раствора DLCL и 2000 мкл метанола смешивали встряхиванием в течение 15 минут для разрушения липосом, а затем центрифугировали при 12000 об / мин в течение 10 минут для определения общей концентрации лекарственного средства ( C ₀ ) в супернатанте. (3) Десять миллилитров приготовленного раствора DLCL ( V ₀ ) лиофилизировали для взвешивания твердой порошковой массы ( W ₀ ). (4) ЭЭ и лекарственная нагрузка рассчитывались по формуле, указанной ниже:

Выпуск лекарства in vitro

Высвобождение in vitro DLCL и свободного даидзеина определяли методом диализа. Смоделированная желудочная жидкость представляла собой 0,1 моль / л HCl (pH 1,2), содержащую 0,5% Tween-80, а моделируемая кишечная жидкость представляла собой 25 мМ буфер PBS (pH 6,9), содержащий 0,5% Tween-80. 0,5 мл приготовленного раствора DLCL добавляли в диализный мешок с молекулярной массой перехвата 8000–14000 и помещали в 20 мл двух высвобождающих сред, соответственно. Среды для испытания на высвобождение непрерывно перемешивали (100 об / мин) при 37 ° C. В указанные моменты времени (0, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 96, 120 и 144 ч) аликвоты образца (1 мл ) были взяты из диализата, а затем добавлено такое же количество свежей высвобождающей среды. Один миллиграмм на миллилитр даидзеина (растворенного в ДМСО) использовали в качестве контроля и помещали соответственно в две вышеуказанные среды для высвобождения для той же обработки. Даидзеин измеряли в каждый момент времени, и совокупную скорость высвобождения рассчитывали по формуле:

В формуле V ₁ объем выборки в каждый момент времени, V ₂ объем диализной среды, C ₁ ~ C _я была концентрация даидзеина, измеренная в каждый момент времени, и V ₀ и C ₀ были объем и концентрация DLCL, добавленных в диализный мешок.

Фармакокинетика DLCL у крыс

Десять самцов крыс Sprague-Dawley были случайным образом разделены на две группы ( n =5). Одной группой была группа даидзеина (суспендированная в 0,5% натрий-карбоксиметилцеллюлозе), а другой группой была группа DLCL (растворенная в воде). Дозы даидзеина в двух группах составляли 30 мг / кг. Перед пероральным введением крыс не кормили в течение 12 ч и давали им пить воду. После внутрижелудочного введения крысам группе даидзеина брали 0,5 мл крови из венозного сплетения глазного дна каждой крысы через 3 мин, 5 мин, 10 мин, 15 мин, 30 мин, 45 мин, 60 мин, 1,5 ч, 2 ч. , 3 ч, 4 ч, 6 ч, 8 ч, 10 ч, 12 ч, 24 ч и 36 ч соответственно. Между тем, в группе DLCL брали 0,5 мл крови у каждой крысы таким же образом через 1 минуту, 3 минуты, 5 минут, 10 минут, 15 минут, 30 минут, 45 минут, 60 минут, 1,5 часа, 2 часа, 3 часа. , 4 ч, 6 ч, 8 ч, 10 ч, 12 ч, 24 ч и 36 ч соответственно. Образец крови помещали в гепаринизированную центрифужную пробирку и центрифугировали при 4000 об / мин в течение 10 мин, а плазму отбирали для хранения при -80 ° C. Содержание даидзеина в образце плазмы определяли с помощью установленного метода ЖХ-МС / МС, чтобы получить кривую зависимости лекарственного средства от времени у испытуемых крыс. Фармакокинетические параметры были рассчитаны с использованием модели без компартментов с использованием программного обеспечения DAS3.0 (профессиональный член Китайского фармакологического общества, Шанхай, Китай).

Определение дайдазина в плазме крыс с помощью ЖХ-МС / МС

Образцы плазмы крысы были предварительно обработаны следующим образом:плазма крысы (50 мкл), метанол (10 мкл), внутренний стандарт (IS) апигенин, растворенный в метаноле (10 мкл, 500 нг / мл), и 5% водный раствор муравьиной кислоты (100 мкл). ) смешивали в чистой пробирке объемом 1,5 мл. После непродолжительного перемешивания на вортексе к смеси добавляли 1,2 мл этилацетата. После встряхивания при комнатной температуре в течение 5 минут смесь центрифугировали при 12000 об / мин в течение 10 минут. Образовавшуюся верхнюю органическую фазу (1 мл) переносили в другую чистую пробирку объемом 1,5 мл, упаривали и повторно растворяли в подвижной фазе (100 мкл). Супернатант, полученный центрифугированием при 12000 об / мин в течение 10 мин, собирали для анализа ЖХ-МС / МС. Количественные условия образцов плазмы крыс описаны ниже:GL Inertsustain C18 (100 мм × 2,1 мм, 3 мкм) соединяли с защитной колонкой Shim-pack Column Holder (5,0 мм × 2,0 мм, 1,6 мкм) при температуре колонки 40 ° С; градиентное элюирование со скоростью 0,2 мл / мин проводили с использованием подвижной фазы, состоящей из воды (A) -метанола (B) в условиях от 50% B до 80% B (0–2,00 мин), 80% B (2,00–4,00 мин), от 80% B до 50% B (4,00–6,00 мин) и 50% B (6,10–8,00 мин). Объем инъекции составлял 10 мкл. Режим мониторинга множества отрицательных ионов (MRM) был использован для обнаружения ионных пар даидзеина ( m / z 253,0 → 224,15) и IS ( м / z 269,00 → 117,05). Остальные условия были указаны следующим образом:источник ионов ESI, температура блока нагрева 400 ° C, температура нагрева трубки DL 250 ° C, распыляющий газ ( N ₂ ) объемный расход 3,0 л / мин, сушильный газ ( N ₂ ) объемный расход 15,0 л / мин, а напряжение распыления ионов - 4,5 В. Время удерживания даидзеина и внутреннего стандарта (апигенина) составляло 4,5 и 5,4 мин соответственно, и эндогенные вещества в плазме не мешали определению даидзеина. и внутренний стандарт (рис. 2). Количественная методология была строго исследована и соответствовала требованиям количественного анализа биологических образцов (Таблица 2).

ВЭЖХ чистой плазмы ( a ), даидзеин + апигенин (внутренние стандарты) + холостая плазма ( b ) и образец плазмы ( c ). 1, даидзейн; 2, апигенин (IS)

Статистический анализ

Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение (SD). Статистические сравнения были выполнены с использованием одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим тестом Тьюки. Значения считались статистически значимыми при p <0,05.

Результаты и обсуждение

Влияние процессов подготовки на характеристики нанолипосом

План ортогонального теста и результаты теста показаны в таблице 3, а результаты дисперсионного анализа показаны в таблице 4. Интуитивный анализ (таблица 3) показал, что порядок влияния четырех факторов на размер частиц был следующим:соотношение лекарственное средство-липид> SPC- соотношение холестерина> температура гидратации> время ультразвуковой обработки, что мало повлияло на эффективность инкапсуляции. Дисперсионный анализ (таблица 4) показал соотношение лекарственное средство-липид; Соотношение SPC-холестерин оказывает значительное влияние на размер частиц. Оптимальные условия приготовления для DLCL были A ₁ В ₁ С ₂ D ₁ отношение SPC к холестерину составляло 55:40, отношение лекарства к липиду составляло 1:10, температура гидратации составляла 50 ° C, а время ультразвуковой обработки составляло 24 мин.

Три партии DLCL были приготовлены параллельно в соответствии с оптимизированным выше способом. EE составлял 85,3 ± 3,6%, а загрузка лекарственного средства составляла 8,2 ± 1,4%. Средний размер частиц составлял 156,1 ± 3,0 нм с PDI 0,294 ± 0,012 и дзета-потенциалом -49 ± 0,6 мВ. Гранулометрический состав DLCL показан на фиг. 3, что указывает на то, что в оптимизированных условиях процесса получения приготовленный DLCL имел узкое и однородное распределение частиц по размеру. Форма и структура частиц DLCL, наблюдаемых с помощью ПЭМ, была круглой или эллиптической, а размер в основном однородным (рис. 4).

Гранулометрический состав DLCL

Электронная микроскопия DLCL

Даидзеин - типичный препарат с плохими гидрофильными и липофильными свойствами. Направленное сочетание лекарственного средства с полярным концом фосфолипида может сделать их оба в высокодисперсном состоянии. Кристаллические характеристики препарата подавлены, а растворимость липидов увеличена [11]. Сообщалось, что при взаимодействии даидзеина и липидного бислоя около 15% даидзеина находится в гидрофильной области липосомальной мембраны [23, 24], а остальная часть распределяется на границе раздела вода / мембрана [25]. Согласно результатам ПЭМ, двойная структура DLCL была очевидна, а введение даидзеина не влияло на двойную структуру липидов.

Влияние процессов приготовления на высвобождение лекарства in vitro

Результаты экспериментов по высвобождению in vitro показаны на рис. 5. В среде высвобождения моделированной желудочной жидкости (0,1 моль / л HCL, содержащая 0,5% твин-80) кумулятивная скорость высвобождения даидзеина составляла около 85% за 1 час. и полное высвобождение через 12 часов; DLCL высвободил 18% через 1 час, 60% через 12 часов и 100% через 48 часов. В среде высвобождения моделированной кишечной жидкости (25 мМ буфер PBS, содержащий 0,5% Твин-80, pH 6,9) совокупная скорость высвобождения даидзеина составляла около 73% через 1 час, 84% через 12 часов и полное высвобождение через 24 часа.; DLCL высвободил 3% через 1 час, 59% через 12 часов и 100% через 48 часов.

Высвобождение in vitro DLCL и свободного даидзеина в растворе гидрохлорида (pH 1,2), содержащем 0,5% Tween 80 ( a ) и фосфатный буфер (pH 6,9), содержащий 0,5% Твина 80 ( b ) (среднее ± стандартное отклонение, n =3)

Результаты эксперимента по высвобождению in vitro показали, что DLCL вызывал значительно медленное высвобождение в диализных средах с pH 1,2 и pH 6,9, а скорость высвобождения в диализных средах с pH 1,2 была выше, чем в диализных средах с pH 6,9. Это может быть связано с тем, что липидные двухслойные структуры уязвимы в кислых условиях и имеют низкую стабильность.

Влияние процессов приготовления на фармакокинетику in vivo

Кривые зависимости средней концентрации даидзеина в плазме от времени после перорального введения однократной дозы даидзеина и DLCL показаны на фиг.6, а основные некомпартментные фармакокинетические параметры даидзеина в обеих группах представлены в таблице 5. Результаты показали, что при изодозе даидазеина (30 мг / кг) в обеих группах концентрация даидзеина в плазме в группе DLCL всегда была выше, чем в группе даидзеина. AUC _{0− t} (площадь под кривой зависимости концентрации лекарственного средства в плазме от времени, которая представляет собой общую абсорбцию после однократной дозы и отражает степень абсорбции лекарственного средства) даидзеина в группе DLCL составила 1515,52 ± 532,40 мкг / л * ч, что в 2,5 раза больше, чем у группа даидзеин ( p <0,05). Кроме того, MRT _{0− t} (среднее время пребывания, то есть время, необходимое для выведения 63,2% лекарства из организма) и t _1/2 (период полувыведения, который представляет собой время, необходимое для уменьшения вдвое концентрации лекарственного средства в плазме в конечной фазе) даидзеина в группе DLCL были увеличены в 1,6 и 1,8 раза, чем в группе даидзеина, соответственно ( p <0,05). Результаты фармакокинетики показали, что DLCL может не только снижать эффект первого прохождения даидзеина, способствуя его пероральному всасыванию, но также увеличивать среднее время его пребывания для достижения эффекта медленного высвобождения.

Кривые зависимости средней концентрации в плазме от времени для DLCL и свободного даидзеина после перорального приема разовой дозы даидзеина (30 мг / кг) (среднее ± стандартное отклонение, n =5)