Наночастицы золота с хитозаном, N-ацилированным хитозаном и хитозановым олигосахаридом в качестве носителей ДНК

Фон

Вкратце генную терапию можно определить как способ введения генетического материала в клетки для различных целей, в том числе для лечения генетических заболеваний [1]. Среди двух основных типов ДНК-векторов для генной терапии, вирусных и невирусных, последний обладает такими преимуществами, как отсутствие иммуногенности, хорошее соответствие, неинфекционность [2], стабильность при хранении и простота производства. С другой стороны, даже когда вирусные векторы, такие как ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы и т. Д., Имеют высокие скорости трансфекции и быструю транскрипцию, они обладают такими недостатками, как быстрое выведение из циркуляции, токсичность, иммуногенность и пониженная способность. нести большие объемы информации [3,4,5]. Обычно в случае невирусных носителей чужеродная ДНК загружается в плазмиду, и она защищается и стабилизируется на протяжении всего образования конъюгатов или комплексов. В частности, хитозан (CO) был изучен для разработки невирусных ДНК-векторов, поскольку он показал высокие скорости трансфекции и низкую токсичность, защищая ДНК от нуклеиновых кислот во время межклеточного транспорта [4]. Этот полимер, широко присутствующий в природе (он является основным компонентом панцирей ракообразных и частью клеточных стенок многих грибов [6]), представляет собой полисахарид, который может быть получен после превращения хитина (с получением 2-амино-2-дезокси -β-D-глюкопираноза повторяющиеся звенья, но все еще сохраняющие небольшое количество остатков 2-ацетамидо-2-дезокси-β-D-глюкопиранозы [7]) (рис. 1a). Медицинское применение природного хитозана в большинстве случаев требует некоторых модификаций полимера; Среди основных недостатков, которые необходимо преодолеть, - нерастворимость при физиологическом pH и высокая вязкость в разбавленном растворе кислоты [8]. Некоторые исследователи отметили, что динамика трансфекции клеток зависит от размера и формы носителя [1, 8, 9, 10, 11, 12], например, Huo et. al. сообщил, как эти свойства коррелируют с эффективностью проникновения в случае наночастиц золота [10].

Растворимость хитозана можно изменять, изменяя распределение оставшихся ацетильных групп в цепи и степень ацетилирования [13]. Другой метод контроля физических свойств хитозана - ацилирование (рис. 1б). В зависимости от доступности аминогрупп и степени ацетилирования некоторые биовзаимодействия хитозана можно контролировать, например, увеличивая его гидрофобность путем ацилирования жирными кислотами [7]. Le Tien et. al. [7] сообщили о N-ацилировании хитозана для матриц с контролируемым высвобождением в фармацевтических препаратах. Bhattarai et. al. [14] получили наночастицы золота, стабилизированные N-ацилированным хитозаном, для применения в физиологических условиях, демонстрирующие преимущества неацилированного хитозана. Другой полезной модификацией хитозана является уменьшение длины полимерной цепи (олигосахарид хитозана, COS) [15]. Среди свойств многих видов COS, полученных из хитозана, их более низкая вязкость и более высокая растворимость в воде очень полезны для многих приложений [16]. Сообщалось, что хитозан с низким молекулярным весом может увеличивать клеточное поглощение, в основном из-за его более короткой длины цепи (2-10 единиц D-глюкозамина) (рис. 1c) и свободных аминогрупп [17,18,19]. Кроме того, синтез наночастиц золота с олигосахаридом хитозана в качестве восстанавливающего агента не включает никаких токсичных реагентов [20].

Химическая структура а хитозан, b ацилированный хитозан и c хитозановый олигосахарид

Золотые наночастицы (AuNP) привели к разработке нового типа наноматериалов, использующих их оптические свойства и высокую физическую стабильность, что делает их очень жизнеспособным вариантом для нескольких приложений [21,22,23,24,25]; тем самым они улучшают клеточную трансфекцию по сравнению с липокомплексами или полимерами за счет более высокой плотности и, таким образом, сокращения времени поглощения [12]. Поскольку золото имеет большое сродство к амино (-NH ₂ ), циано (-CN) и тиол (-SH) функциональные группы, открываются широкие возможности для многих типов функционализации [9, 26]. Катионные монослои получают, например, путем добавления катионных полимеров к наночастицам золота, улучшения взаимодействия нуклеиновых кислот и электростатической адсорбции [27, 28]. Таким образом, нанокомплексы, сочетающие хитозан и золото, используют преимущества обоих материалов для биологических применений [29,30,31,32,33], представляя собой многообещающий материал для разработки носителей ДНК [5, 10, 12, 14].

Существует множество биологических методов синтеза AuNP, включающих, среди прочего, использование углеводов, микроорганизмов, ферментов, витаминов и биополимеров [34]. Между так называемым зеленым синтезом [35], использование метода синтеза в одном сосуде с использованием хитозана в качестве восстанавливающего и стабилизирующего агента оказалось более гибким и безопасным для биомедицинских приложений [36, 37]. Так же, как и в традиционных методах синтеза, в случае однореакторного синтеза размер получаемых частиц зависит от концентрации восстановителя; таким образом, в конкретном случае хитозанового олигосахарида соотношение хитозан / золото должно контролироваться для получения частиц различного размера, поскольку молекулярная масса хитозана является важным фактором для распределения наночастиц по размеру и форме. Эта работа была направлена ​​на оценку различных нанокомплексов на основе хитозана и AuNP для трансфекции ДНК, включая синтез зеленого / одного горшка с 5 кДа хитозанового олигосахарида, который имеет более низкую молекулярную массу, чем те, о которых сообщалось для аналогичных приложений [36, 38].

Тесты на трансфекцию проводили на клеточной линии HEK-293 ( Homo sapiens (человека) -эпителиальная морфология-эмбриональная почка-плод) с плазмидами pSV-β-Gal и pIRES2-EGFP. Эти тесты были выбраны на основе эффективности трансфекции и цитотоксичности, которые зависят от типа клеток и, согласно Corsi et. al. [4], трансфекция более благоприятна для линии клеток HEK-293 по сравнению с MG63 и мезенхимальными стволовыми клетками.

Методы

Синтез нанокомпозитов

Каждый эксперимент проводился с наночастицами золота с модифицированным и немодифицированным хитозаном; Были использованы два основных метода синтеза:один из них включает химический синтез наночастиц золота с хитозаном в его простой форме (CO-AuNPs) и гидрофобно модифицированным хитозаном с ацильными группами (Acyl-CO-AuNPs), а другой - зеленым / одно- горшечный синтез с использованием короткоцепочечного хитозана (хитозановый олигосахарид, COS @ n-AuNP). Фиг.2 показывает схематическую диаграмму каждого синтеза; соответствующие экспериментальные процедуры описаны ниже.

Принципиальная схема для каждого синтеза: a - б химический синтез наночастиц золота с хитозаном в его простой форме (CO-AuNPs) и с гидрофобно модифицированными ацильными группами (Acyl-CO-AuNPs) и c - е зеленый / однореакторный синтез короткоцепочечного хитозана (хитозановый олигосахарид, COS @ n-AuNP)

Материалы

Тригидрат хлорида золота (III) (HAuCl ₄ ∙ 3H ₂ O), боргидрид натрия (NaBH ₄ ), хитозан с низкой молекулярной массой (50-190 кДа, степень деацетилирования 75%) и олигосахарид хитозана (с низкой молекулярной массой, 5 кДа) были получены от Sigma Aldrich. Всю стеклянную посуду промыли и оставили в ванне со свежеприготовленной царской водкой (HCl:HNO ₃ , 3:1 v / v ) в течение 24 часов и перед использованием тщательно промойте водой Mili-Q, чтобы удалить любые следы металла [39].

Наночастицы хитозана и золота (CO-AuNP)

Синтез наночастиц хитозан-золото проводили по описанию Huang et. al. [9]. Для этого 20 мг раствора хитозана с низкой молекулярной массой (2 мг / мл) добавляли к 10 мл 1% уксусной кислоты и перемешивали на вортексе до полного растворения и хранили в течение ночи. Два миллилитра полученного раствора фильтровали с использованием шприцевого фильтра из полиэфирсульфона 0,22 мкм, затем его смешивали с 1 мл 10 мМ HAuCl ₄ . ∙ 3H ₂ O при сильном перемешивании в течение 30 мин. 0,4 мл свежеприготовленного 100 мМ NaBH ₄ в качестве восстановителя использовался холодный раствор; его добавляли по каплям при перемешивании, и наблюдалось быстрое изменение цвета от желтого до винно-красного; после этого перемешивание продолжали в течение 2 ч (рис. 2а).

Ацилированные наночастицы хитозана и золота (ацил-CO-AuNP)

Капроилхлорид (C ₆ H ₁₁ ClO, Sigma Aldrich) был использован для синтеза ацилированных наночастиц хитозан-золото.

Гелеобразование

Ацилирование хитозана (низкомолекулярного) проводили по методу, описанному Remant Bahadur et al. [6] с небольшими изменениями. Для этого 0,83 г хитозана добавляли к 100 мл 1% раствора уксусной кислоты при перемешивании магнитной мешалкой, которое продолжалось в течение 24 часов. Пять миллилитров этого раствора фильтровали с помощью шприцевого фильтра из полиэфирсульфона 0,22 мкм, а затем его pH доводили до 7,2 с помощью 0,1-молярного раствора гидроксида натрия (NaOH), медленно добавляемого при интенсивном перемешивании. Один миллилитр капроилхлорида добавляли к 5 мл этого последнего раствора и полученную смесь перемешивали в течение 5 часов. PH смеси доводили до 6,8–7 раствором гидроксида. Полученный гель осаждали ацетоном и центрифугировали при 5000 об / мин в течение 20 мин при 4 ° C. Избыток капроновой кислоты удаляли трехкратной промывкой метанолом (50–60 ° C) и декантированием, давая высохнуть в течение 3 дней на плите. Этот гель был использован для синтеза нанокомпозитов.

Нанокомпозиты

Один миллилитр 10-мМ HAuCl ₄ ∙ 3H ₂ Раствор О добавляли к 2 мл геля, разбавленного до 0,33% в 0,1 М растворе HCl, при перемешивании в течение 1 часа. Наконец, добавив к этому последние 0,4 мл 0,1-М NaBH ₄ В свежеприготовленном холодном растворе при перемешивании было очевидно образование наночастиц золота с переходом в розовый / красный цвет до завершения 2 часов непрерывного перемешивания (рис. 2b).

Наночастицы хитозанового олигосахарида и золота (COS @ n-AuNP)

COS @ n-AuNP получали по модифицированной методике, описанной Manivasagan et al. [20]. Хитозановый олигосахарид (COS) добавляли к 10 мл HAuCl ₄ . ∙ 3H ₂ O и перемешивали 60 мин при 80 ° C. Было выполнено четыре синтеза, варьируя количество COS (100 и 200 мг) и концентрацию золота в HAuCl ₄ ∙ 3H ₂ О раствор (0,003 и 0,017 мас.%). В таблице 1 показаны параметры, используемые при синтезе AuNP для каждого эксперимента. Формирование наночастиц золота было очевидным с изменением цвета винно-красный / розово-красный, регистрируя изменение цвета в разное время в каждом случае, в зависимости от количества восстановителя и прекурсора золота. Полученные нанокомпозиты очищали центрифугированием при 12000 g в течение 30 мин (рис. 2c – f).

Характеристика нанокомпозитов

Инфракрасная спектроскопия

Хитозан, используемый для CO-AuNP, ацилированный хитозан для Acyl-CO-AuNP и хитозановый олигосахарид для серии COS @ n-AuNP, были охарактеризованы с помощью FTIR-спектрометрии (Spectrum One, Perkin Elmer) для подтверждения ацилирования полимера Acyl-CO путем сравнения интенсивность характеристических полос функциональных групп между образцами. Степень замещения (SD) оценивалась по данным ИК-спектров, согласно Remant Bahadur et. al. [6].

ξ-потенциал

Zetasizer (Nano Z, Malvern) использовался для оценки поверхностного потенциала композита. Ожидается, что нанокомпозиты обладают положительным потенциалом для успешной адгезии к ДНК с образованием комплексов. ξ- Потенциал оценивали до и после образования комплекса для подтверждения изменений после адгезии ДНК. Для измерения поверхностного потенциала использовали 1,5 мл соответствующих разбавленных образцов с использованием капиллярной ячейки (DTS 1060, Malvern).

УФ-видимая спектроскопия

Спектры UV-Vis (UV-1800 m, Shimadzu) в диапазоне от 400 до 700 нм были получены для предварительного подтверждения образования наночастиц золота с помощью полосы поверхностного плазмонного резонанса около 530 нм. Дополнительно, спектры от свежеприготовленных нанокомпозитов были использованы для качественной оценки фотостабильности образцов; это было сделано путем сравнения со спектрами, полученными от тех же образцов через 150 дней после синтеза, отслеживая изменения вокруг полосы поверхностного плазмонного резонанса, выбирая один образец для каждого метода и используя COS @ 2-AuNP как наиболее репрезентативные для COS @ n-AuNP. ряд. Кварцевая ячейка использовалась в качестве контейнера для образца, а деионизированная вода - в качестве холостого опыта.

Просвечивающая электронная микроскопия (ТЕМ)

ТЕМ-микроскопию (JEM 1010, JEOL) использовали для определения формы и гранулометрического состава. Для изображений ПЭМ образцы нанокомпозитов были приготовлены путем нанесения 10 мкл раствора на подложку из медной сетки 200 меш, покрытой формваром, и сушки при комнатной температуре в течение 15 мин. Были отобраны три изображения для каждого образца и проанализированы с помощью самодельной программы обработки изображений, разработанной с использованием программного обеспечения Matlab®.

Степень образования и адгезии комплекса

Нанокомпозитная пДНК

pSV-β-Gal (6,82 т.п.н.) и pIRES2-EGFP (5,3 т.п.н.) (пДНК) были выделены из трансформированного DH5α Escherichia coli . Очистку плазмиды проводили щелочным лизисом с использованием набора для выделения микробной ДНК Mo Bio® UltraClean. Электрофорез в агарозном геле был использован для проверки структурной целостности плазмид с использованием высокопроизводительного ультрафиолетового трансиллюминатора и получения изображений с помощью цифровой системы визуализации Kodak Gel Logic 100. Концентрация и чистота плазмидной ДНК были подтверждены с помощью мультидетекторного микропланшетного ридера Synergy ™ 2 с использованием программы Gen5. Комплексы получали смешиванием плазмидной ДНК (пДНК) с каждым типом нанокомпозитов наночастиц золото-хитозан в среде Игла, модифицированной Дульбекко без сыворотки (DMEM, Sigma-Aldrich), в количествах плазмид от 200 до 400 нг. Адгезию пДНК к нанокомпозиту оценивали электрофорезом с использованием геля агарозы при 0,8% и напряжении 90 В в течение 60 мин.

Трансфекция комплекса наночастиц хитозан-золото-пДНК в клетки HEK-293

Культура клеток

HEK-293 Homo sapiens (человеческая) -эпителиальная морфология - эмбриональные клетки почки-плода культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко, с фетальной бычьей сывороткой (SFB, Sigma-Aldrich) при 37 ° C и 5% CO ₂ -содержащая атмосфера. Для трансфекции пДНК клетки HEK-293 высевали по 12000 клеток на лунку в 96-луночный планшет и инкубировали в течение 24 часов при 37 ° C в 5% CO ₂ -содержащая атмосфера, достигающая 90% слияния.

Эффективность трансфекции с помощью pIRES2-EGFP

Функционализацию нанокомпозита пДНК in vitro выполняли путем заливки культуральной среды из лунок до тех пор, пока она не покрывала почти все клетки, и добавления раствора комплекса в каждую лунку (15 мкл нанокомпозитов и 200 нг ДНК), инкубируя в течение 2 ч при тех же условиях культивирования. После этого добавляли 500 мкл полной среды DMEM для инкубации в течение 48 часов. Трансфекцию pIRES2-EGFP оценивали непосредственно с помощью флуоресцентной микроскопии (Axio Vert.A1, Carl Zeiss).

Эффективность трансфекции с помощью pSV-β-Gal

Гистохимию X-gal использовали для оценки активности β-галактозидазы путем модификации экспрессии плазмиды pSV-β-Gal на линии клеток HEK-293; в этой методологии трансфицированные клетки стали синими. Функционализацию нанокомпозита пДНК in vitro проводили, как описано выше, инкубируя в течение 2 часов при тех же условиях культивирования. После этого добавляли 500 мкл полной DMEM для инкубации в течение 24 часов, меняя среду и инкубируя еще 24 часа. Лунки промывали два раза 50 мкл стерильного фосфатно-солевого буфера (PBS) 1 × после удаления культуральной среды, затем клетки фиксировали 2% формальдегидом и 0,2% смесью глутаральдегида в течение 5 мин; после этого их дважды промывали 50 мкл PBS 1 ×. Фиксатор удаляли перед промывкой два раза 50 мкл PBS 1 ×, а затем разбавленной смесью 0,4 мг / мл X-gal (5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозид, Sigma-Aldrich). в 5 мМ ферроцианиде калия (Meyer) и 2 мМ хлориде магния (Meyer) на PBS 1 ×. Затем клетки инкубировали 24 ч при комнатной температуре. Экспрессию β-галактозидазы наблюдали с помощью светлопольной микроскопии (AE2000, Motic), принимая 5 полей на лунку с объективом × 40, ожидая, что трансфицированные клетки станут синими. Эффективность трансфекции оценивали путем сравнения клеток с экспрессией β-галактозидазы (окрашены в синий цвет) с общим количеством клеток на поле. Липофектамин ^TM 2000 (30 мкл) использовали в качестве положительного контроля для каждого теста.

Жизнеспособность клеток по методу исключения красителей

Микрокультуры использовали через 24 ч после пассажа клеток. Культуральную среду удаляли, и клетки промывали 1 × PBS перед добавлением 40 мкл комплексного раствора. После этого клетки инкубировали в течение 2 ч при 37 ° C и 5% CO ₂ . -содержащая атмосфера. Для исключения красителя раствор комплекса отмывали от клеток с помощью 50 мкл PBS 1 × и добавляли 20 мкл трипанового синего (0,2% на PBS 1 ×). С этой последней смесью клетки инкубировали в течение 10 минут при 37 ° C и 5% CO ₂ . -содержащая атмосфера. После этой последней инкубации краситель удаляли из лунок и промывали два раза 50 мкл PBS 1 ×. Клетки наблюдали с помощью светлопольной микроскопии, считая окрашенные в синий цвет клетки (мертвые или поврежденные) против общего количества клеток на поле. Тесты на жизнеспособность клеток были получены для различных концентраций комплекса в воде от 0,1 мМ до 3 мМ, CO-AuNP и ацил-CO при 3 мМ; COS @ 3-AuNP и COS @ 4-AuNP в концентрации 0,5 мМ; и самая низкая концентрация (0,1 мМ) для COS @ 1-AuNP и COS @ 2-AuNP.

Программное обеспечение Image J ( Программное обеспечение с открытым исходным кодом ( OSS ) лицензия ) вместе с плагином Image-based Tool for Counting Nuclei-ICTN были использованы для подсчета клеток для тестов на трансфекцию и жизнеспособность.

Результаты и обсуждения

Синтез и характеристика нанокомпозитов

Среди трех видов комплексов, синтезированных в данной работе, COS @ n-AuNP заслуживает особого внимания, поскольку они были синтезированы без использования токсичных реагентов, таких как боргидрид натрия или бромид цетилтриметиламмония (CTAB). Сообщалось, что хитозан подходит в качестве восстанавливающего и стабилизирующего агента и оптимальной концентрации для синтеза комплексов AuNP желаемых размеров и форм в зависимости от множества факторов:времени реакции, температуры, степени деацетилирования хитозана и его молекулярной массы, среди прочего [38 , 40]. С учетом этого, молекулярная масса хитозана поддерживалась постоянной на уровне 5 кДа для четырех синтезов COS @ n-AuNP, принимая HAuCl ₄ ∙ 3H ₂ Растворы О и хитозана в различных концентрациях.

На рис. 3 представлены спектры поглощения в УФ и видимой областях нанокомпозитов AuNPs-хитозан, синтезированных в данной работе. Плазмонные полосы с центром при 534 нм для хитозана (CO-AuNPs), 507 нм для ацилированного хитозана (Acyl-CO-AuNPs) и для различных олигосахаридов хитозана при 533 нм (COS @ 1-AuNPs), 530 нм (COS @ 2 -AuNPs), 535 нм (COS @ 3-AuNPs) и 536 нм (COS @ 4-AuNPs) подтверждают присутствие наночастиц золота. На вставках к этому рисунку показаны изображения полученных нанокомпозитов, окраска которых зависит от концентрации, размера, формы и функционализации поверхности наночастиц.

УФ-видимые спектры нанокомпозитов. Значения на вставках соответствуют максимальной длине волны локализованного поверхностного плазмонного резонанса. Эти максимумы были следующими:для CO-AuNP при 534 нм (0,1 М NaBH ₄ ) ( а ), для Acyl-CO-AuNPs при 507 нм ( b ), а для олигосахарида хитозана COS- @ n-AuNP при 533, 530, 535, 536 нм для каждого из 1–4 препаратов нанокомпозитов различной толщины ( c )

Стабильность нанокомпозитов

На рис. 4 показано сравнение спектров поглощения в УФ-видимой области для свежесинтезированных нанокомпозитов и через 150 дней после синтеза; как можно наблюдать, два спектра для каждого случая остаются по существу одинаковыми, без значительного смещения максимума резонансных полос и без признаков дополнительных пиков. Эти результаты качественно свидетельствуют о высокой стабильности полученных нанокомпозитов.

Стабильность нанокомпозитов наночастиц золота по спектрам поглощения в УФ-видимой области, полученным через 150 дней после синтеза:химически синтезированные CO-AuNPs ( a ) и ацил-CO-AuNP ( b ) и зеленый / однореакторный синтез для COS @ 2-AuNP ( c )

Инфракрасные спектроскопии трех различных образцов хитозана показаны на рис. 5. Этот метод использовался для идентификации ацилированного хитозана путем сравнения его полос поглощения в инфракрасной (ИК) области (которые являются характеристиками химической структуры) с ИК-спектрометрией. база данных. Следует отметить некоторые характерные ИК-полосы:полосы хитозана (50–190 кДа, степень деацетилирования 75%) при 1656 см ⁻¹ , 1593 см ⁻¹ , и 1373 см ⁻¹ соответствуют амидным группам (амиды I, II и III соответственно); полоса на 2895 см ⁻¹ соответствует связям C-H, а между 3200–3500 см ⁻¹ к связям N-H и O-H. Для ацилированного хитозана ИК-полосы были получены при 1651 см ^-1 . , 1591 см ⁻¹ , и 1369 см ⁻¹ соответствуют амидным группам (амиды I, II и III соответственно), а находящиеся внутри 3200–3500 см ⁻¹ соответствуют связям N-H и O-H. Ацилирование хитозана подтверждено данными ИК-спектроскопии [7]:полоса при 1591 см ^-1 был ниже для ацилированного хитозана по сравнению с нативным хитозаном из-за большего количества вторичных амидов на ацилированном хитозане. Полосы внутри 3200–3500 см ⁻¹ , характерный для колебаний N-H и O-H в природном хитозане, исчезает для ацилированного хитозана и хитозанового олигосахарида из-за восстановления первичного амида.

ИК-Фурье-спектры хитозана, ацил-хитозана и хитозанового олигосахарида. Ремешок на 1591 см ⁻¹ соответствует вторичным амидам; 3200–3500 см ⁻¹¹ области соответствуют колебаниям N-H и O-H

Степень замещения ацилированного хитозана оценивалась по данным Bahadur et. al. [6] следующим выражением:

где A ₁₆₅₁ =1.973965 и A ₃₃₅₀ =1,977278 соответствует поглощению (для колебаний амида I и OH соответственно) ацилированного хитозана при 1631 см ^-1 и 3350 см ⁻¹ соответственно, а 0,25 соответствует группам свободных аминов. Была получена степень N-ацилирования 75%.

ξ Потенциально

Значения ξ-потенциала были получены для каждого композита следующим образом (таблица 2, столбец «ξ-потенциал»):43,3 мВ (CO-AuNPs), 40,2 мВ (Acyl-CO-AuNPs), 52,2 мВ (COS @ 1-AuNPs). , 55,3 мВ (COS @ 2-AuNP), 51,6 мВ (COS @ 3-AuNP) и 46,3 мВ (COS @ 4-AuNP). Потенциал для всех нанокомпозитов был положительным из-за аминогрупп хитозана, как и планировалось для достижения образования комплекса ДНК за счет электростатических сил. После образования комплекса снижение значений ξ-потенциала подтвердило успешную адгезию ДНК (таблица 2, столбец «ξ-потенциал / ДНК»).

Просвечивающая электронная микроскопия (ТЕМ)

На рис. 6 показаны типичные ПЭМ-микрофотографии для каждого нанокомпозита, а также гистограммы размеров наночастиц для расчета распределения по размерам. Распределение размеров для каждого нанокомпозита было получено следующим образом:были получены три изображения ПЭМ для каждого образца и проанализированы с помощью самодельного программного обеспечения для обработки изображений, разработанного с помощью Matlab®, и количество наночастиц составило 500 для Acyl-CO-AuNPs, 1000 для CO-AuNPs. и 100 для серии COS @ n-AuNP. Средний размер каждого образца представлен в таблице 2, столбец «Средний диаметр ПЭМ (нм)». Стоит отметить, что AuNP, синтезированные с олигосахаридом хитозана, имели сферическую форму с лучшим распределением по размерам по сравнению с аналогичными, полученными с помощью других методик зеленого синтеза, описанных в литературе [36, 38, 41,42,43].

Микрофотографии ПЭМ от a 4,7 нм AuNP ацилированного хитозана, b AuNP хитозана 3,5 нм (0,1 М NaBH ₄ ), c 7,4 нм олигосахаридные AuNP хитозана (COS @ 1), d 15.6 нм олигосахаридные AuNP хитозана (COS @ 2), e 10 нм олигосахаридные AuNP хитозана (COS @ 3) и f 14 нм олигосахаридные AuNP хитозана (COS @ 4)

Степень образования и адгезии комплекса:нанокомпозитная пДНК

Были проведены электрофореграммы всех комплексов пДНК и чистой ДНК с использованием различных концентраций плазмиды; результаты показаны на фиг. 7. На фиг. 7а показаны соответствующие электрофореграммы для чистой плазмиды и всех комплексов, содержащихся с 200 и 300 нг плазмиды. Распределение образцов нанокомпозита для этой электрофореграммы выглядит следующим образом:ацил-CO-AuNP (300 и 200 нг) на дорожках 1 и 2, CO-AuNP (300 нг) на дорожке 3, COS @ 1-AuNP (300 и 200 нг) в 4 и 5, COS @ 2-AuNP (300 и 200 нг) в 6 и 7, COS @ 3-AuNP (300 и 200 нг) в 8 и 9, COS @ 4-AuNP (300 и 200 нг) в 10 и 11, и 300 нг чистой пДНК на дорожке 12. Для всех тестов использовали 10 мкл комплексного раствора. Этот рисунок показывает, что только пДНК перемещается в геле (как видно на дорожке 12), а другие комплексы пДНК остаются в своих соответствующих лунках, подтверждая, таким образом, адгезию пДНК ко всем комплексам. Это связано с взаимодействием положительных зарядов аминогрупп хитозана, остающегося на поверхности наночастиц золота, и отрицательных зарядов фосфатных групп спиралей ДНК.

а Электрофореграммы нанокомплексов с концентрацией пДНК 200 и 300 нг. Дорожка 12 соответствует чистой пДНК. б CO-AuNP и ацил-CO-AuNP с 300 нг пДНК, чистая пДНК на дорожке 3. c COS@2-AuNPs nanocomplex with 300 and 350 ng of DNA, 400 ng of pure pDNA at lane 3. d same CO-AuNPs and Acyl-CO-AuNPs at 1:10 dilution, with respectively pure DNA control at lane 3

To evaluate the retention ability of COS@2 complexes, eletropherograms for the corresponding pDNA complex were carried out with the same COS@2 concentration but different pDNA concentrations (300 ng, 350 ng, and 400 ng); the results are shown in Fig. 7b. Lanes 1, 2, and 3 on this figure correspond to plasmid concentration of 300 ng, 350 ng, and 400 ng, respectively; results in lane 1 is in perfect agreement with the corresponding result in Fig. 7a (lane 7) and, both results in lane 2 and 3 of Fig. 7b, indicate that retention power of this complex is below 350 ng of the plasmid.

Chitosan-Gold Nanoparticle-pDNA Complex Transfection into HEK-293 Cells

As it was pointed out before, two different tests were made in order to evaluate pDNA transfection, taking advantage of the X-galactosidase activity of the pSV-β-Gal plasmid and the fluorescence activity for the case of the piRES2-EGFP plasmid. Figure 8 shows the micrographs of transfection test in HEK-293 cells by X-galactosidase activity on pSV-β-Gal; blue cells in this figure (pointed out by arrows) are some of the transfected cells, according to the corresponding methodology. On the other hand, Fig. 9 shows the fluorescence micrographs of transfected HEK-293 cells; this technique was used to evaluate transfection efficiency with pIRES2-EGFP plasmid. For both figures, (a) shows pure cells and (b) shows cells using LipofectAMINE ^TM 2000 as a positive control. Corresponding transfections rates with each conjugate are shown as follows:(c) CO-AuNP, (d) Acyl-CO-AuNPs, (e) COS@1-AuNPs, (f) COS@2-AuNPs, (g) COS@3-AuNPs, and (h) COS@4-AuNPs. Transfection efficiency percentages obtained with the different complexes were as follows:CO-AuNP 27%, Acyl-CO-AuNP 33%, COS@1-AuNP 48%, COS@2-AuNP 60%, COS@3-AuNP 45%, and COS@4-AuNP 52%. Figure 10 shows the histograms for the transfection percentages obtained with each complex. Transfection efficiency was evaluated by comparing cells presenting pDNA expression against total cells per well. The highest transfection efficiencies were obtained with conjugates from COS@2-AuNP complexes; this can be explained by the highest chitosan/gold ratios used for this green method of synthesis. These results may complement those reported by Köping-Höggård et. al. [40], which suggests that the use of DNA conjugates with chitosan oligomers of different length affects the stability and transfection efficiency. The present work deserves additional consideration since the transfection efficiencies were improved in this case using low molecular weight chitosan oligosaccharides complexed with gold nanoparticles.

HEK-293 Homo sapiens (human)-epithelial morphology-embryonic kidney-fetus cell transfection tests (pSV-β-Gal). а HEK-293 cells, b positive control:LipofectAMINE ^TM 2000, c CO-AuNP, d Acyl-CO-AuNPs, e COS@1-AuNPs, f COS@2-AuNPs, g COS@3-AuNPs, and h COS@4-AuNPs. Arrows point to transfected cells

HEK-293 Homo sapiens (human)-epithelial morphology-embryonic kidney-fetus cell transfection tests (pIRES2-EGFP).a HEK-293 cells, b positive control:LipofectAMINE ^TM 2000, c CO-AuNP, d Acyl-CO-AuNPs, e COS@1-AuNPs, f COS@2-AuNPs, g COS@3-AuNPs, and h COS@4-AuNPs. Arrows point to transfected cells

Transfection efficiency percentages obtained with the different nanocomplexes (pSV-β-Gal and pIRES2-EGFP test). HEK-293-transfected cells

Dye Exclusion Test

Figure 11 (inset) shows the micrographs for cell viability evaluation. Blue dyed cells (dead or damaged) were compared against total cells per field. The highest cell viability was obtained with COS@1-AuNPs and COS@2-AuNPs, with 93.53% and 93.46%, respectively. It is interesting to note that COS@2-AuNPs also showed the best transfection efficiency. Among COS@n-AuNP series, COS@4-AuNPs showed lower viability (78.23%). As expected, tests with LipofectAMINE ^TM 2000 and CO-AuNPs presented the lowest viability (61.45% and 77.85% respectively). Finally, viabilities with Acyl-CO and COS@3-AuNPs were 90.75% and 92.08 % respectively.

Cell viability percentages obtained with the different nanocomplexes (pSV-β-Gal and pIRES2-EGFP test). HEK-293 cells

Conclusions

Chitosan, acylated chitosan, and chitosan oligosaccharide nanocomposites with gold nanoparticles, featuring positive charges, were synthesized. They presented good stability in colloidal solution; this confirms the viable use of chitosan as a stabilizer and chitosan oligosaccharide as both reducing agent and stabilizer, and positive charges by its amino groups improved affinity with plasmid DNA. Size distributions of the synthesized gold nanoparticles were in a range of 3 to 15 nm. Gel electrophoresis and ξ-potential studies showed that plasmid DNA was successfully incorporated to the nanoparticles by interaction with the positive charges from chitosan at the surface of the nanocomposites. The best transfection efficiency, with 93.46% viability, was obtained with the COS@2-AuNP complexes, possibly due to its relatively high chitosan/gold ratio (1.96/0.003); this means larger effective surface for the anchoring of the plasmids by means of the electrostatic interaction of its phosphate groups with the chitosan amine functional groups. The COS@n-AuNP complexes obtained by the green/one-pot synthesis described in this work showed high transfection efficiency, as compared with those obtained with traditional chemical synthesis (CO-AuNPs and Acyl-CO-AuNPs), and can be proposed as promising green route-synthesized pDNA vehicles without the inconvenience of using toxic chemical reagents. Moreover, chitosan oligosaccharide as a reducing agent can be considered as a green synthesis method for AuNPs and renders spherical nanoparticles with good size distribution. This kind of safe and non-toxic routes of synthesis for nanocomplexes, like the ones proposed in this work, deserve further research in the search of obtaining more safe plasmid carriers for gene therapy applications.

Доступность данных и материалов

All datasets on which the conclusions of the manuscript rely are presented in the main paper.

Сокращения

Acyl-CO:

Acylated chitosan

AuNP:

Наночастицы золота

CO:

Chitosan

COS:

Chitosan oligosaccharide

DMEM:

Модифицированный носитель Орла, созданный Дульбекко

FTIR:

Инфракрасное преобразование Фурье

PBS:

Физиологический раствор с фосфатным буфером

pDNA:

Plasmid Deoxyribonucleic acid

ТЕМ:

Просвечивающая электронная микроскопия