Стабильность самосборки и изменчивость белков оболочки бактериальных микрокомпартментов в ответ на изменение окружающей среды

Введение

Бактериальные микрокомпартменты (BMC) - это белковые органеллы, структурно напоминающие вирусные капсиды, разделяющие цитоплазму бактерий [1]. Они широко распространены среди бактериальных филумов [2] и позволяют бактериям разделять ключевые метаболические пути в отсутствие мембраносвязанных органелл, обнаруженных у эукариот [3, 4]. BMC образованы полупроницаемой белковой оболочкой, инкапсулирующей ядро ​​фермента просвета. Оболочка состоит из трех типов структурных белковых компонентов, включая BMC-H (содержащий домен Pfam00936), BMC-T (содержащий два домена Pfam00936) и BMC-P (с доменом Pfam03319) [5,6,7, 8,9]. Основными компонентами оболочки являются BMC-H, которые выглядят как гексамеры с выпуклой и вогнутой поверхностями и покрывают грани оболочки своей вогнутой стороной наружу [10] (рис. 1). BMC-P образуют пентамеры, которые, как предполагается, закрывают вершины икосаэдрической формы, а BMC-T образуют псевдогексамеры, которые расположены в фасетах оболочки, предположительно ответственных за проницаемость оболочки.

Бактериальный микрокомпонент, организация оболочки и самосборка. а Сотни копий гомологов белка оболочки BMC самоорганизуются с образованием икосаэдрической белковой органеллы. Белки BMC-H, выделенные желтым цветом, образуют грани, а белки BMC-P, выделенные красным цветом, занимают вершины. б АСМ-топограммы фасеток оболочек, составленных гексамерами Hoch_5815 BMC-H. Динамические события (кружки) наблюдались в течение нескольких секунд с помощью HS-AFM

Специфические белок-белковые взаимодействия обеспечивают самосборку белков BMC с образованием строго определенных архитектур для выполнения их метаболических функций. Латеральные взаимодействия между белками оболочки считаются основным фактором, определяющим свойства самосборки икосаэдрической оболочки [10]. Было замечено, что гомологи BMC-H могут образовывать различные формы, включая двумерные листы [11, 12], нанотрубки [13,14,15,16,17] и структуры нитей [15, 18,19,20] .

Основываясь на самосборке, селективной проницаемости и свойствах инкапсуляции ферментов естественных органелл, BMC считались идеальной системой с большим потенциалом в биоинженерии, включая создание биореакторов наноразмерных размеров путем заключения в оболочку метаболических ферментов и создание новых молекулярных каркасов с новые функции [21,22,23,24,25,26]. Однако некоторые ключевые вопросы еще предстоит решить в биоинженерии BMC, например, насколько стабильны структуры BMC и как эффективно управлять и оценивать самосборку и образование агрегатов белка BMC. Исследования структур и сборки оболочек BMC и целых BMC проводились с помощью рентгеновской кристаллографии, электронной микроскопии (EM), флуоресцентной микроскопии и динамического рассеяния света (DSL) [10, 11, 16, 22, 27, 28]. , 29,30,31]. Недавно мы использовали высокоскоростную АСМ (HS-AFM), чтобы провести первую визуализацию процесса динамической самосборки белков BMC-H [12].

В этой работе мы используем HS-AFM для мониторинга структурной динамики участков BMC-H при различных pH и ионных условиях, что дает представление о модуляции сборки белков оболочки BMC и предлагает мощный инструмент для количественной оценки с молекулярным разрешением. , о стабильности и вариабельности самосборки белка оболочки BMC.

Методы

Подготовка образца

Очищенный белок BMC-H (Hoch_5815) из Haliangium ocraceum был любезно предоставлен доктором Керфельдом (Национальная лаборатория Лоуренса Беркли). Для замены буфера:исходные образцы при ~ 80 мг / мл ^-1 в Трис-буфере (50 мМ Трис-HCl, pH 7,8, 100 мМ KCl, 10 мМ MgCl ₂ ) были разбавлены до 0,5 мг / мл ^-1 используя желаемый буфер перед формированием изображения AFM (дополнительный файл 1:рисунок S1). Контрольный буфер представляет собой 50-мМ трис-HCl (pH 7,8) и 10 мМ MgCl ₂ . .

Атомно-силовая микроскопия

Требуемые буферы были использованы для поглощения образца на слюде и АСМ изображения. После 5-минутной абсорбции на слюде Hoch_5815 промывали желаемым буфером для удаления иммобилизованных белков и затем отображали с помощью АСМ (дополнительный файл 1:Рисунок S1). Изображения HS-AFM получали с частотой 30 или 40 Гц в растворе в режиме переменного тока с использованием AFM JPK NanoWizard ULTRA speed, оснащенного сканером ULTRA Speed ​​2,8 мкм и ультракороткими зондами Cantilever USC-0,3 МГц (NanoWorld). Минимальные силы нагрузки ~ 100 пикоНьютон были приложены во время АСМ-визуализации, чтобы уменьшить нарушение сборки белка [12, 32,33,34,35,36].

Обработка и анализ изображений

Изначально анализ изображений выполнялся с использованием JPK SPM Data Processing (JPK). Анализ изображения HS-AFM был выполнен с использованием специального макроса на Image SXM (http://www.ImageSXM.org.uk), как описано ранее [12]. Чтобы проанализировать размеры пятен Hoch_5815, изображения размером 512 × 512 пикселей, захваченные при частоте развертки 30 Гц, были сглажены, чтобы удалить любой наклон XY и пороговое значение Z, с последующим двоичным преобразованием для отображения белка вместо белка. Для расчета площади поверхности белков на этих бинарных изображениях использовался анализ частиц. Патчи были определены как объекты, разделенные более чем 3 пикселями (~ 2 нм), чтобы идентифицировать отдельные участки по сравнению с соседними участками. Первоначальные тесты показали, что если установлено большее количество пикселей, соседние участки могут считаться одним непрерывным участком, тогда как при использовании меньшего числа пикселей промежутки между отдельными гексамерами в участках могут быть ошибочно учтены как граница между пятнами. Для анализа динамики белка были проанализированы серии изображений размером 256 × 256 пикселей, снятых при скорости сканирования 40 Гц, с временным разрешением примерно 6,4 с на кадр. Двоичные изображения были вычтены из предыдущего изображения в серии, чтобы показать разностные изображения АСМ. Частичный анализ разностных изображений использовался для подсчета площади собранных и разобранных белков. Уравнение, используемое для расчета динамической скорости, показано следующим образом:

где N представляет собой сумму белых и черных пикселей в пороговом разностном изображении, деленную на количество пикселей, соответствующих одному гексамеру в этом масштабе (Дополнительный файл 1:Рисунок S3, Рисунок S5). Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (SD). Статистический анализ проводился с использованием многомерного дисперсионного анализа или двустороннего дисперсионного анализа, как указано.

Результаты

Мы использовали белки BMC-H (Hoch_5815) из миксобактерий Haliangium ocraceum , которые были выражены в Escherichia coli и характеризуется как гексамеры с шестикратной симметрией [12]. Гексамеры Hoch_5815 могут самоорганизовываться с образованием однослойных листов во второй шкале времени, которые представляют основные структурные компоненты икосаэдрической архитектуры BMC (рис. 1a). Визуализация HS-AFM позволяет нам визуализировать динамическую сборку и организационную гибкость фрагментов листа (рис. 1b) и количественно оценить размер пятна и динамическую скорость белков BMC-H с использованием разработанного анализа изображений (см. Раздел «Методы»).

Реакция на изменение pH

Мы измерили изменения в размере патча как показатель общей способности Hoch_5815 к самосборке. Размер пятна увеличивается с повышением pH от 3 до 10 (рис. 2a; дополнительный файл 1:рис. S2, таблица S1), предполагая, что высокий pH более благоприятен для самосборки белков Hoch_5815, чем условия низкого pH. Это несколько отличается от поведения сборки белков RmmH, которые, как было обнаружено, нерастворимы при pH 6, образуют упорядоченные массивы нанотрубок при pH 8 и склонны к разборке при pH 10 [13]. Кроме того, мы наблюдали высокую степень структурной изменчивости самосборок HOCH_5815 (на что указывает большая SD на Рис. 2a, Дополнительный файл 1:Рис. S2).

Влияние pH окружающей среды на самосборку Hoch_5815. а Средняя площадь поверхности отдельных пятен Hoch_5815, определенная с помощью АСМ ( n =50) (Дополнительный файл 1:Рисунок S2). б Средняя частота динамических событий, определенная HS-AFM ( n =50). * p <0,05, нс не значимо (многомерный дисперсионный анализ)

АСМ визуализация самосборки белков Hoch_5815 в листах оболочки показала, что образование листов оболочки приписывается комбинации сборки и разборки гексамеров [12]. Мы дополнительно исследовали скорость динамики самосборки Hoch_5815 и динамических событий при различных значениях pH (дополнительный файл 1:таблица S2), чтобы изучить стабильность белок-белковых взаимодействий Hoch_5815. Скорость динамики самосборки является максимальной при pH 7 и уменьшается как в кислых, так и в щелочных условиях (рис. 2b; дополнительный файл 1:рис. S3). В частности, он быстро снижается в кислых условиях, особенно от pH 7 до pH 6, и кажется относительно постоянным между pH 4 и pH 3, как показано на рис. 2b.

Вероятно, что pH оказывает большое влияние на электростатические свойства аминокислотных остатков, расположенных на границе раздела гексамер-гексамер. Сниженная динамика и меньший размер пятен на раковине, наблюдаемые в кислых условиях, показывают, что Hoch_5815 имеет пониженную способность к самосборке. Сниженная динамика и больший размер пятен на раковине, наблюдаемые в щелочных условиях, предполагают стабильные взаимодействия гексамер-гексамер, тогда как повышенная динамика гексамеров Hoch_5815 подразумевает гибкие взаимодействия гексамер-гексамер в условиях нейтрального pH.

Реакция на изменение концентрации соли

Мы также проверили, влияет ли концентрация соли в буфере на сборку Hoch_5815. При низких концентрациях (100–200 мМ) MgCl ₂ , CaCl ₂ , и KCl, Hoch_5815 белки образуют относительно меньшие участки, чем те, которые собраны при более высоких концентрациях (300–500 мМ) (Рис. 3a; Дополнительный файл 1:Рис. S4). При 500 мМ мы наблюдали двух- или многослойные листы Hoch_5815 (дополнительный файл 1:Рисунок S4). Эти наблюдения согласуются с предыдущим открытием, что более высокая ионная сила может способствовать образованию более обширных и хорошо упорядоченных 2D кристаллов с помощью CcmK, белков оболочки карбоксисом для ассимиляции углерода [37]. Однако высокоупорядоченные нанотрубки, образованные RmmH, были разобраны, когда концентрация NaCl была увеличена с 50 до 500 мМ [13], что указывает на потенциально различные механизмы, которые опосредуют образование плоских листов и трубчатых форм гексамерами оболочки.

Влияние концентрации соли на самосборку Hoch_5815. а Средние площади пятен, измеренные с помощью АСМ, в диапазоне 100–500 мМ CaCl ₂ , MgCl ₂ , и KCl ( n =50). Повышение концентрации соли привело к увеличению размеров пятен. Значительные изменения площади пятна наблюдались между 200 и 300 мМ (*** p <0,001, * p <0,05, нс незначительный, двусторонний дисперсионный анализ). б Средние скорости динамических событий, определенные из серии изображений высокоскоростной АСМ в диапазоне 100–500 мМ CaCl ₂ , MgCl ₂ , и KCl ( n =50). Каждые 100 мМ изменение концентрации соли приводило к значительному изменению скорости динамических событий (*** p <0,001, * p <0,05, нс незначительный, двусторонний дисперсионный анализ)

Более того, вариации самосборки Hoch_5815, вызванные изменениями в MgCl ₂ и концентрации KCl относительно схожи. Напротив, изменение размера пятна наиболее заметно (до 3000-кратного увеличения), когда CaCl ₂ концентрация повышена с 200 до 300 мМ (рис. 3a), что свидетельствует о более высокой чувствительности самосборки Hoch_5815 к CaCl ₂ чем MgCl ₂ или KCl.

На динамическую скорость самосборки Hoch_5815 также влияют изменения концентрации буферной соли. Увеличение MgCl ₂ , CaCl ₂ , или концентрации KCl могут привести к снижению динамической скорости Hoch_5815 (рис. 3b; дополнительный файл 1:рис. S5). Учитывая увеличение размера пятна, наблюдаемое при более высоких концентрациях соли (рис. 3a), кажется, что латеральные взаимодействия между гексамерами Hoch_5815 более стабильны при высоких концентрациях соли. Изменения CaCl ₂ концентрация имела более выраженный ответ, и был значительный сдвиг в скорости динамических событий между 200 и 300 мМ (рис. 3b), тогда как ответы на изменения в MgCl ₂ и KCl относительно похожи, что согласуется с изменениями в размере пятна (рис. 3a). Интересно, что самые высокие доли событий сборки по сравнению с событиями разборки наблюдались при 400 мМ MgCl ₂ , CaCl ₂ , или KCl (дополнительный файл 1:таблица S2). Это привело к образованию крупных и стабильных однослойных сборок Hoch_5815 под 400 мМ соли (дополнительный файл 1:Рисунок S4). Двухслойные сборки, наблюдаемые при 500 мМ, также стабильны и демонстрируют низкие скорости движения гексамера.

Гибкость сборки белка BMC-H

Уменьшая усилие сканирования до 100 пН, мы минимизировали влияние сканирования наконечником АСМ на сборку белков BMC и получили АСМ-изображения с молекулярным разрешением отдельных гексамеров (рис. 4). События сборки и разборки можно увидеть в одном и том же виде, проверяя динамическую природу сборки оболочки BMC, а не артефакты сканирования наконечника [12]. Визуализация HS-AFM также выявила вариабельность агрегаций белка Hoch_5815. При визуализации образцов при pH 7,5 в присутствии только 10 мМ MgCl ₂ Удивительно, но мы иногда наблюдали образование волоконоподобных структур вместе с разборкой гексамеров Hoch_5815 во второй временной шкале (рис. 4a). Эти подобные волокнам структуры могут быть плотно упакованы параллельно, подобно жгутам нанотрубок, собранным из гексамеров оболочки [13,14,15,16]. Однако расстояние между двумя волокнами составляет 3,72 ± 0,31 нм ( n =30), а их средняя высота составляет 2,46 ± 0,22 нм ( n =30), что меньше, чем у листов оболочки, образованных гексамерами Hoch_5815 (3,45 ± 0,16 нм, n =25) (рис. 4б – е). Эти волокнистые структуры довольно гибки и динамичны во время построения изображения и могут отображать прямые или спиральные структуры различных размеров. Учитывая одновременный внешний вид волоконных структур при разборке гексамеров Hoch_5815 и их меньшую высоту по сравнению с однослойными гексамерными листами, мы предполагаем, что эти волокнообразные структуры образованы отдельными пептидами Hoch_5815, разобранными из гексамеров (рис. 4g). . Вполне вероятно, что абсорбция субстрата в определенных буферных условиях (таких как низкая ионная сила) может привести к прикреплению сторон альфа-спирали пептидов Hoch_5815 к поверхности субстрата и линейному связыванию пептидов с соседними пептидами, хотя предполагается что внутригексамерные взаимодействия, вероятно, сильны [5]. Подробный механизм, лежащий в основе вариабельности агрегации белков оболочки, требует дальнейшего выяснения.

Формирование и динамика волокнистых структур вместе со сборками листов оболочки при HS-AFM. а Внешний вид волокноподобных структур при разборке листов оболочки из гексамеров Hoch_5815, как показано на серии изображений АСМ. б АСМ-топография волоконных структур. c Анализ поперечного сечения (пунктирная линия на панели b ) показывает интервал 3,72 ± 0,31 нм ( n =30) между соседними волоконными структурами, а средняя высота составляет 2,46 ± 0,22 нм ( n =30). г АСМ-топография пятен раковин, состоящих из гексамеров Hoch_5815. е Анализ поперечного сечения (пунктирная линия на панели d ) показывает, что средняя высота гексамеров Hoch_5815 составляет 3,45 ± 0,16 нм ( n =25). е Волокнистые структуры имеют меньшую высоту по сравнению с плоскими листами, состоящими из гексамеров Hoch_5815 (* p <0,05, двусторонний дисперсионный анализ). г Предлагаемая организация и формирование волокнистой структуры, представляющей собой цепочку мономеров Hoch_5815

Обсуждение

BMC состоят из сотен белков, которые самоорганизуются, чтобы сформировать структуры более высокого порядка. Оболочка BMC, состоящая из множества белковых гомологов, является идеальной системой для изучения самосборки и взаимодействия белков. В качестве мощного метода анализа организации биомембран, сборки белков и физических взаимодействий, которые имеют большое значение для физиологических ролей биологических систем [32, 35, 38, 39], AFM использовался для визуализации динамики организации и самосборки Белки оболочки BMC, а также архитектура и механические особенности структур BMC [12, 30, 31, 40,41,42]. Эта работа представляет собой, насколько нам известно, первое количественное определение динамики самосборки белков оболочки BMC при формировании двумерных листов в ответ на изменения окружающей среды с использованием AFM. Результаты подчеркивают врожденную изменчивость и зависимость самосборки белка BMC-H от окружающей среды. По сравнению с EM и DSL, AFM демонстрирует большой потенциал в отслеживании динамических действий самосборки белка BMC в реальном времени с молекулярными деталями.

Белковые взаимодействия играют важную роль в формировании оболочки BMC [10]. Концентрация белка также была задокументирована как критический фактор для формирования оболочки [41, 43]. Кроме того, исследования растворимости in vitro показали, что pH и ионная сила в растворе могут влиять на структурную стабильность BMC [17, 27], а также на поведение сборки белков оболочки BMC при образовании двумерных листов [37, 41]. ], нанотрубки [13, 17] и наноклетки [28], напоминающие об их влиянии на сборку вирусного капсида [44, 45]. Мы также обнаружили осаждение белка и отсутствие образования пятен при pH> 10 и <3 или концентрации соли <10 мМ или> 600 мМ (неопубликованные данные). Здесь мы также показали, что тенденция и динамика сборки зависят от pH и концентрации соли. Хотя белки оболочки могут самособираться в широком диапазоне pH, среда с нейтральным pH, по-видимому, способна улучшить динамику сборки (Fig. 2b). Было обнаружено, что катионы с концентрацией ≥ 300 мМ способствуют образованию двумерных листов; Катионы 400 мМ кажутся желательными для образования больших и стабильных однослойных листов (рис. 3). Эти условия соответствуют цитозольным условиям бактериальных клеток и физиологически значимы. Например, в наиболее физиологически значимых условиях pH E. coli цитозоль составляет примерно 7,4–7,8 [46], а концентрация ионов составляет примерно 100–400 мМ, что жизненно важно для белковых взаимодействий, связывания белок-лиганд, передачи сигналов, поддержания электростатических потенциалов мембран и градиента белков через мембраны [47, 48]. Хотя то, как взаимодействия между образцами и слюдяным субстратом влияют на самосборку белков BMC, еще предстоит изучить, получение изображений AFM дает нам возможность количественно проанализировать динамические изменения самосборки белков BMC в ответ на изменения окружающей среды. P>

Зависящая от окружающей среды динамика сборки белков BMC при образовании фрагментов оболочки, описанная здесь, может отражать их поведение при образовании всего BMC. Фактически, трехмерные структуры BMC кажутся динамически поддерживаемыми органеллами, созданными в природе. BMC демонстрируют заметную структурную гибкость и неоднородность; механическая мягкость структур оболочки BMC, определяемая наноиндентированием AFM [30], и неравновесная динамика сборки BMC, выявленная с помощью компьютерного моделирования [49], подчеркнули различия между BMC и надежными вирусными сборками. Аналогичным образом выяснилось, что биосинтез карбоксисом коррелирует со светом и шаперонами [50, 51]. Совсем недавно было показано, что CcmK3 и CcmK4 могут образовывать гетерогексамеры и кэп на карбоксисомной оболочке pH-зависимым образом, возможно обеспечивая средства для регулирования проницаемости карбоксисомной оболочки и CO ₂ ассимиляция в высокодинамичной микросреде [52]. Точный механизм, лежащий в основе того, как условия окружающей среды в растворе влияют на термодинамическую сборку белков BMC, еще предстоит изучить, например, с использованием комбинации экспериментальных исследований и компьютерного моделирования.

Учитывая самосборку структур BMC, существует значительный интерес к разработке BMC и разработке новых нанобиореакторов на основе BMC, молекулярных каркасов и биоматериалов в биотехнологических приложениях, например, для улучшения клеточного метаболизма, инкапсуляции ферментов, молекулярной доставки и терапии. . Расширенные знания о структурной устойчивости и изменчивости BMC в ответ на изменения окружающей среды будут не только полезными для стратегий создания надежных наноструктур на основе BMC в гетерологичных хозяевах, то есть E. coli или растения [31, 53, 54], но также открывают путь для модуляции образования 2D наноматериалов, а также открытия и закрытия белковых клеток на основе оболочки BMC, тем самым облегчая функциональную регуляцию и целенаправленную молекулярную доставку. Ранее мы продемонстрировали возможность использования подхода генетической модификации для манипулирования специфическими контактами на границах раздела белков оболочки и их поведениями самосборки [12]. Это исследование укрепляет наш набор инструментов для оценки и управления самосборкой оболочки BMC в различных средах.

Выводы

Таким образом, мы использовали HS-AFM для проведения количественных исследований самосборки белка оболочки BMC при различных pH и солевых условиях. Было показано, что образованию более крупных однослойных пятен гексамеров оболочки способствует концентрация соли 400 мМ, а нейтральный pH приводит к более высокой динамической скорости самосборки гексамеров. Также был визуализирован организационный переход белков оболочки от гексамерных сборок к волокнистым массивам. Это исследование показало, что условия окружающей среды играют важную роль в определении организации и самосборки белков оболочки BMC.

Сокращения

BMC:

Бактериальный микрокомпонент

BMC-H:

Гексамер микрокомпонентов бактерий

BMC-P:

Пентамер микрокомпонентов бактерий

BMC-T:

Тример бактериальных микрокомпартментов

DSL:

Динамическое рассеяние света

E. coli :

кишечная палочка

EM:

Электронная микроскопия

HS-AFM:

Высокоскоростная атомно-силовая микроскопия