Красный спектральный сдвиг в чувствительной колориметрической диагностике туберкулеза комплексом антиген-антитело ESAT-6:новая стратегия с наночастицами золота

Фон

Туберкулез (ТБ) вызывается Mycobacterium tuberculosis . , одно из основных смертельных заболеваний человека, и первоначально оно поражает легкие. Как следствие, он распространяется на другие части тела, такие как почки, позвоночник и мозг, и становится более серьезным при снижении иммунитета. Чтобы спасти людей с помощью мер предосторожности, обязательно выявлять и лечить туберкулез на латентной стадии. На этом этапе пациент был инфицирован M. туберкулез ; однако возбудитель не активен. Существуют различные методы, которые использовались для выявления туберкулеза на латентной стадии, включая кожную пробу на туберкулез и тест на гамма-интерферон. В большинстве случаев кожная туберкулезная проба сама по себе не может выявить активную туберкулезную инфекцию, и пациент должен быть подтвержден другими вспомогательными тестами, такими как рентгенография грудной клетки, цитология мокроты и посев мокроты [1]. Но эти тесты требуют более сложных лабораторных операций и требуют нескольких месяцев; поэтому разработка более простого и эффективного метода выявления туберкулеза на более ранней стадии является обязательной.

Колориметрический анализ на основе наночастиц золота (ЗНЧ) демонстрирует большое внимание в области биосенсоров из-за их уникальных физических и химических характеристик, таких как более высокий коэффициент экстинкции в видимых длинах волн и изменяемый поверхностный плазмонный резонанс. Монодисперсный раствор ЗНЧ демонстрирует высокие коэффициенты экстинкции и показывает спектр в видимой области. Если GNPs имеют надлежащее пространство среди них, они будут казаться растворами красного цвета и станут синими, когда они будут агрегированы в доступных условиях двухвалентных ионов [2]. В присутствии соответствующих ионов пространства между ЗНЧ будут заполнены, достигнут стадии агрегации и покажут спектральный сдвиг в сторону видимой длины волны, называемый «красным смещением». Воспользовавшись этим спектральным сдвигом, было создано множество колориметрических анализов для обнаружения таких заболеваний, как ВИЧ и грипп [3, 4]. Подобные анализы основаны на одноцепочечных олигонуклеотидных последовательностях, и аптамер широко используется в качестве подходящей молекулы для обнаружения мишени [5, 6]. Одноцепочечные последовательности ДНК или РНК могут связываться на поверхности ЗНЧ за счет координации между атомами золота и азота в основаниях ДНК [7,8,9]. Модифицированные ЗНЧ с олигонуклеотидом стабильны в более высоких солевых условиях. Когда аналит доступен, олигонуклеотид будет отделен от золота и будет агрегирован в присутствии двухвалентных ионов, после чего отобразится синий раствор. Продемонстрированные анализы ВНЧ дешевле, требуют меньше времени на обнаружение, легче функционализировать и демонстрируют визуальное обнаружение с хорошей чувствительностью [10,11,12,13,14]. Из-за такого положительного отношения колориметрические анализы на основе ЗНЧ были расширены для обнаружения более мелких молекул, включая ДНК, РНК, белок, целые клетки и ионы металлов. Было доступно несколько аптамеров для обнаружения этих аналитов с использованием упрощенных колориметрических анализов на основе аптамерного ВНЧ, показывающих красные спектральные сдвиги [15,16,17,18,19].

Несмотря на то, что колориметрические анализы были хорошо задокументированы с аптамером, ДНК или РНК, в некоторых случаях они также оказывают негативное влияние из-за их плохой работы с более длинными последовательностями и неудач с зондом и интерактивным анализом мишени [20,21,22]. Это может быть связано с более высокими зарядами на биомолекулах, которые электростатически сильнее взаимодействуют с поверхностью ЗНЧ, что в конечном итоге делает молекулу-мишень неспособной высвободить прикрепленную молекулу зонда на поверхности ЗНЧ. Чтобы преодолеть это препятствие, мы ввели одностадийный колориметрический анализ на основе антител для обнаружения белка ESAT-6. Белок ESAT-6 - это ранний секретирующий белок, идентифицированный как важный антиген при туберкулезе [23,24,25]. Диагностируя белок ESAT-6 на более ранней стадии, необходимо в обязательном порядке лечить заболевание и не допускать его распространения. На рис. 1а, б показана стратегия, разработанная для обнаружения ESAT-6 по его антителу с использованием колориметрического анализа красного спектрального сдвига на основе ЗНЧ. В этом методе обнаружения используются следующие этапы:(i) поликлональное антитело против ESAT-6 было предварительно смешано с антигеном ESAT-6 / CFP-10, (ii) к этому раствору был добавлен GNP, (iii) NaCl был добавлен, и (iv) было выполнено визуальное обнаружение и анализ красного спектрального сдвига с помощью УФ-спектроскопии. С помощью этих шагов мы выполнили критический анализ, чтобы выяснить основанное на заряде взаимодействие между ЗНЧ и комплексными белками, и пришли к выводу о пригодности предварительного смешивания антитело-антиген для колориметрических анализов. В контрольном эксперименте вместо ESAT-6 использовали культуральный фильтрат-белок-10 (CFB-10) (рис. 1).

Схематическое изображение обнаружения ESAT-6 с помощью одностадийного колориметрического анализа на основе предварительно образованных комплексов на основе антител. а Стратегия для предварительного образования комплекса антител против ESAT-6 с ESAT-6. б Стратегия для предварительно образованного комплекса антитела против ESAT-6 с CFP-10 (контрольный эксперимент)

Методы

Реагенты и биомолекулы

Ранняя секреторная антигенная мишень (ESAT-6) и белок фильтрата культуры 10 кДа (CFP-10) были закуплены у Sino Biological Inc. (Пекин, Китай). Anti-ESAT-6 был приобретен в Santa Cruz Biotechnology (США). Золотая наночастица диаметром 15 нм была получена от Sigma Aldrich (США). Деионизированная вода, произведенная системой деионизации обратным осмосом (18,3 МОм · см SASTEC (M) Sdn. Bhd), использовалась для всего эксперимента.

Оптимизация двухвалентных ионов для совокупного ВНП

Для обнаружения ESAT-6 в текущем исследовании использовали двухвалентные ионы (NaCl) для визуализации агрегации ЗНЧ. Чтобы оптимизировать подходящие условия с NaCl, различные концентрации (конечные концентрации от 50 до 800 мМ) были добавлены к постоянному объему (20 мкл) GNP [одна оптическая плотность (O.D.)]. Через 15 мин изменения цвета фотографировали с помощью цифровой камеры SONY. Спектральные сдвиги с этими изменениями отслеживались с помощью нанофотометра.

Биообрастание ESAT-6 на поверхности GNP:проверка специфичности

Чтобы подтвердить неспецифическое (биообрастание) связывание ESAT-6 с поверхностью ЗНЧ, к 20 мкл ЗНЧ добавляли различные концентрации (конечные концентрации от 1,5 до 100 нМ). Через 30 мин в каждую пробирку добавляли оптимальную концентрацию NaCl, а затем наблюдали изменения цвета и спектральные сдвиги, как показано в вышеупомянутом эксперименте. Аналогичным образом биообрастание было протестировано с помощью CFP-10.

Оптимизация обязательной концентрации анти-ESAT-6 антител на поверхности ВНЧ

Чтобы оптимизировать необходимую концентрацию антитела против ESAT-6 для оценки текущих экспериментов, различные концентрации антитела против ESAT-6 (конечные концентрации должны составлять от 30 до 500 нМ) независимо смешивали с 20 мкл GNP. После 30 мин инкубации в каждую пробирку добавляли оптимальный объем NaCl, делали фотографии и отмечали спектральные изменения через 15 мин.

Обнаружение ESAT-6 с помощью колориметрического красного спектрального сдвига на основе антител

Для разработки колориметрического обнаружения ESAT-6 с помощью колориметрических спектральных изменений красного смещения на основе антител 1 мкл 1 мкМ ESAT-6 (конечный объем будет 500 нМ) первоначально был смешан с 1 мкл оптимальной концентрации антитела против ESAT-6. . После 30 мин инкубации в каждую пробирку добавляли 20 мкл GNP и затем ждали 30 мин. Затем добавляли оптимальную концентрацию NaCl и измеряли спектральные изменения при длине волны от 400 до 800 нм. Точно так же другие концентрации ESAT-6 (от 0 до 500 нМ) титровали той же оптимизированной концентрацией анти-ESAT-6 антител. Чтобы проверить предел обнаружения, ESAT-6 тестировали от самого низкого пикомолярного (от 1,25 пМ) до наномолярного (500 нМ) порядка. Концентрации других молекул (антитела против ESAT-6, GNP и NaCl) поддерживались постоянными.

Результаты и обсуждение

Колориметрический анализ на основе антител, показывающий спектральные изменения в виде красного сдвига, использовался здесь для обнаружения ESAT-6. На Фигуре 1а схематически показан одноэтапный колориметрический анализ на основе антител; в присутствии ESAT-6 изменение цвета раствора GNP ожидается синим с красным спектральным сдвигом при потере стабильности GNP при высокой концентрации двухвалентного иона NaCl, тогда как в отсутствие ESAT-6 GNP является стабильным из-за прикрепления антитела против ESAT-6 к поверхности GNP и приводит к сохранению его первоначального красного цвета даже при высокой концентрации NaCl. Эта стратегия была подтверждена с использованием неспецифического CFP-10 против антитела против ESAT-6, и он должен был отображать раствор GNP красного цвета (рис. 1b). Поскольку CFB-10 также является основным белком, вызывающим туберкулез, мы использовали его в качестве контрольного белка [26]. Как правило, для этого типа анализа, основанного на ВНЧ, ВНЧ размером от 13 до 15 нм хорошо подходят для достижения более высокой чувствительности [27], а увеличение размера ВНЧ не подходит для достижения хорошего предела обнаружения. Это связано с тем, что увеличивающийся размер ЗНЧ требует большего количества антител для связывания на поверхности ЗНЧ. Если на поверхности связывается большее количество антител, это приводит к ложноотрицательному результату. Здесь мы хотели использовать 15 нм ЗНЧ и достигли максимальной чувствительности к субпикомолярному уровню.

Оптимизация двухвалентных ионов для контролируемого агрегирования ВНП

Для этой оптимизации обнаружения мы использовали NaCl для агрегации ВНП. Когда мы проверили необходимую концентрацию NaCl, как показано на рис. 2, к ВНЧ были добавлены различные концентрации NaCl, цвет раствора стал приобретать синий цвет, что указывает на агрегацию со 100 мМ NaCl. А также из спектра было ясно видно, что только с агрегированным ЗНЧ (концентрации NaCl от 100 до 800 мМ) наблюдается красное смещение на длине волны ~ 600 нм, тогда как дисперсное ЗНЧ (концентрации NaCl от 0 до 50 мМ) мМ) все еще сохраняет свой спектр около 500 нм. Однако наблюдается незначительное изменение спектра пика при использовании 50 мМ NaCl. Из этих результатов был сделан вывод, что для агрегации ЗНЧ нам необходимо не менее 100 мМ NaCl, но для получения повышенной чувствительности мы использовали более высокую концентрацию (800 мМ) NaCl для дальнейших экспериментов. Ранее аналогичный диапазон NaCl для агрегации ЗНЧ был показан Gopinath et al. [10].

Оптимизация двухвалентных ионов. От 0 до 800 мМ NaCl смешивали с постоянным GNP (1 O.D.). Через 15 мин сканировали на длине волны от 400 до 800 нм. Фотографии сделаны цифровой камерой, как показано на вставке к рисунку. На изменение спектра и цвета указывает агрегация ЗНЧ со 100 мМ NaCl. Пики обозначены соответствующими цветными сферами

Оптимизация антител ESAT-6 для диспергирования ВНП

После оптимизации NaCl мы определили подходящую концентрацию антитела против ESAT-6 для проведения экспериментов. Поскольку чувствительность сильно зависит от концентрации антител, необходимо желать подходящей концентрации анти-ESAT-6 антитела, чтобы вызвать дисперсию GNP. Суть заключается в том, что если желательна минимальная концентрация антитела, с ним можно легко образовать комплекс при добавлении мишени, и отсутствуют свободные молекулы, которые можно было бы присоединить к ЗНЧ, тогда как, если доступно несколько антител, когда мы пытаемся обнаружить низкая концентрация ESAT-6, только небольшое количество антител образует комплексы. Затем оставшееся антитело связывается на поверхности ЗНЧ и вызывает стабильность ЗНЧ, что вызывает меньшую чувствительность. IgG антитела имеет более высокую молекулярную массу (~ 150 кДа), благодаря чему свободные антитела легко связываются на поверхности ЗНЧ за счет электростатического взаимодействия или ионно-водородной связи между концевыми анионными группами на поверхности ЗНЧ [28]. Из-за более высокой молекулярной массы количество антител меньше, и здесь он был сбалансирован ESAT-6 с молекулярной массой 6 кДа, который имеет больше молекул даже при более низкой концентрации. Как показано на фиг. 3a, мы сначала добавили от самой низкой концентрации анти-ESAT-6 антитела (30 нМ) и увеличили до максимальной концентрации (500 нМ) к ВНЧ. Было показано, что 30 нМ антитела против ESAT-6 с ЗНЧ находится в переходной стадии агрегации даже с 800 мМ NaCl из-за недостаточного количества доступных антител на поверхности ЗНЧ, но из 60 нМ антитела против ESAT-6, Раствор сохранил красный цвет благодаря достаточному количеству анти-ESAT-6 антител, связывающихся на поверхности ЗНЧ. До тестирования максимальной концентрации (500 нМ) цвет GNP сохранялся красным с высокой стабильностью. После принятия решения о том, что подходящей концентрацией является 60 нМ антитела, чтобы проверить стабильность конъюгатов анти-ESAT-6 антитела и ЗНЧ, мы попытались увеличить концентрации NaCl. Как показано на фиг. 3b, приготовленный конъюгат антитела с GNP (60 нМ антитела с GNP) очень стабилен даже при добавлении 1 М NaCl. Спектр на рис. 3c также показывает тот же результат, что и визуальное обнаружение; Полученные конъюгаты ЗНЧ антител против ESAT-6 сохраняют свой пик на уровне ~ 520 даже при высокой концентрации NaCl, и в то же время только ЗНЧ приводит к агрегированию с 800 мМ NaCl с максимумом пика при ~ 500 нм.

Оптимизация и стабильность антител ESAT-6. Различные концентрации антитела против ESAT-6 тестировали с использованием 800 мМ NaCl. а Агрегация или дисперсия ЗНЧ с антителом против ESAT-6 (от 0 до 500 нМ); Стрелка указывает переходную область для оптимальной концентрации антител. б Стабильность 60 нМ ЗНЧ в комплексе с антителами с различными концентрациями NaCl (от 0,012 до 1000 мМ). c Спектры для разных комплексов. Пики обозначены соответствующими цветными сферами

Обнаружение ESAT-6 с использованием предварительно образованных антител путем колориметрического сдвига красного спектра и проверка биообрастания ESAT-6

Поскольку антитело из 60 нМ показывает превосходную стабильность, первоначально мы попытались обнаружить ESAT-6 в комплексе с 60 нМ анти-ESAT-6 антителом. ESAT-6 представляет собой белок с меньшей молекулярной массой и размером 6 кДа, хорошо подходящий для колориметрического анализа. Перед проведением эксперимента по обнаружению мы проверили биообрастание ESAT-6 на поверхности ЗНЧ; поскольку существует вероятность связывания ESAT-6 с GNP, это может привести к ложноположительным или ложноотрицательным результатам. Как показано на фиг. 4, в ESAT-6 с концентрацией до 100 нМ GNP не был стабильным при 800 мМ NaCl, что указывает на то, что ESAT-6 не связывается электростатически с поверхностью GNP. Это отсутствие обрастания также указывает на то, что аминокислотный состав ESAT-6 играет важную роль в этом анализе. После этого подтверждения мы обнаружили, что ESAT-6 предварительно образовал комплекс с 60 нМ анти-ESAT-6 антителом. Различные концентрации ESAT-6 были объединены с постоянной концентрацией (60 нМ) антитела, а затем добавлены к ЗНЧ. Наконец, добавляли 800 мМ NaCl для оценки агрегации с красным спектральным сдвигом. Как показано на фиг. 5a (вставка), обнаружение ESAT-6 от 0,5 до 500 нМ подтвердило четкое изменение цвета с переходами по сравнению с контролем (только с 60 нМ антителом). Цвет растворов изменился с красного на синий даже при 0,5 нМ и усилился еще при 15 нМ, и это могло быть связано с полным насыщением ESAT-6. Похоже, что не остается антител, чтобы связываться с ЗНЧ даже при 0,5 нМ. Ссылаясь на графическое представление Фиг. 5a, от 15 до 500 нМ ESAT-6 показывает полное насыщение. Из рис. 5b ясно видно, что спектр контрольного эксперимента (без белка ESAT-6) показывает хороший профиль при ~ 500 нм, тогда как для ESAT-6 с 0,5 и 500 нМ спектры были смещены в красную область. На основании этих результатов был сделан вывод, что мы можем обнаруживать белок ESAT-6 от 0,5 нМ и при этом снижать его до более низких концентраций из-за явного синего цвета.

Тест на образование отложений ESAT-6 на поверхности ГНЗ. Различные концентрации ESAT-6 были смешаны с GNP, и через 30 мин было добавлено 800 мМ NaCl. Также показано схематическое изображение. Синий цвет указывает на агрегирование

Обнаружение ESAT-6 при более высоких концентрациях. а Графическое представление для обнаружения ESAT-6. ESAT-6 в различных концентрациях смешивали с 60 нМ антитела и после 30 мин инкубации добавляли ЗНЧ. Затем добавляли 800 мМ NaCl, чтобы вызвать изменение цвета. ESAT-6 от 0,5 нМ был обнаружен с четким изменением цвета (с красного на синий). Фотографии сделаны цифровой камерой, как показано на вставке к рисунку. б Спектральные изменения на длине волны от 400 до 800 нм. Пики обозначены соответствующими цветными сферами

Предел обнаружения ESAT-6 по колориметрическому сдвигу красного спектра

Поскольку 60 нМ анти-ESAT-6 антитела продемонстрировали очевидное улучшение для обнаружения ESAT-6, чтобы определить предел обнаружения, мы провели точную настройку с помощью ESAT-6 до самого низкого пикомолярного (от 1,25 до 5000 пМ). ). Как показано на фиг. 6а, начиная с 1,25 пМ ESAT-6, наблюдается начало синего цвета из-за образования комплекса между ESAT-6 и антителом. С 2,5 пМ цвет раствора, который изменился на синий, усилился и сохранил изменения цвета при дальнейших концентрациях. В контрольном эксперименте (без ESAT-6) цвет раствора оказался красным, что подтверждает специфичность текущего эксперимента (рис. 6а). Этот результат был также подтвержден спектром, показанным на рис. 6б. В контрольном растворе изменений в спектре нет, но от 1,25 до 5 нМ белка ESAT-6 спектры смещены в красную сторону в сторону 600 нм. При 5 нМ ESAT-6 наблюдался полный спектральный сдвиг с максимумами пиков. Основываясь на этих экспериментальных результатах, мы могли сделать вывод, что предел обнаружения ESAT-6 составляет примерно самый низкий пикомолярный (1,25 пМ) с использованием прекомплекса антитела ESAT-6.

Предел обнаружения ESAT-6 колориметрическим анализом на основе антител. а Графическое представление для обнаружения ESAT-6. ESAT-6 в различных концентрациях смешивали с 60 нМ антитела и после 30 мин инкубации добавляли ЗНЧ. Затем добавляли 800 мМ NaCl, чтобы вызвать изменение цвета. Белок ESAT-6 титровали от 1,25 до 5000 пМ. Фотографии сделаны цифровой камерой, как показано на вставке к рисунку. б Спектральные изменения на длине волны от 400 до 800 нм. Пики обозначены соответствующими цветными сферами

Точная настройка с учетом специфики

Поскольку мы могли обнаружить ESAT-6 с помощью 60 нМ антитела против ESAT-6, затем мы попробовали такое же обнаружение с немного высокой концентрацией антитела против ESAT-6, равной 75 нМ. Полученные результаты представлены на рис. 7а. Было обнаружено, что небольшое изменение цвета происходило при использовании 75 нМ предварительно образованного комплекса антитела при 850 пМ ESAT-6. Мы увеличили концентрацию ESAT-6 до 100 нМ, и мы могли наблюдать прогресс в изменении цвета на синий. В этих экспериментах было отмечено, что предел обнаружения находится в наномолярном диапазоне при использовании 75 нМ предварительно образованного комплекса антитела. Наконец, чтобы подтвердить специфичность связывания ESAT-6, мы также протестировали аналогичный анализ с использованием предварительного комплекса анти-ESAT-6 и белка CFP-10 из M. туберкулез . Результаты ясно видны, что только ESAT-6 обладает специфичностью, а CFP-10 может быть подходящим контролем (рис. 7b). В целом, из приведенных выше результатов стало ясно, что оптимизация концентрации антител является обязательной для повышения чувствительности колориметрического анализа.

Обнаружение ESAT-6 с помощью 75 нМ анти-ESAT-6 антител. а Представление об изменении цвета. ESAT-6 в различных концентрациях смешивали с 75 нМ антитела и после 30 мин инкубации добавляли ЗНЧ. Затем добавляли 800 мМ NaCl, чтобы вызвать изменение цвета. ESAT-6 от 0,85 нМ был обнаружен с четким изменением цвета (с красного на синий). Фотографии сделаны цифровым фотоаппаратом. б Спектральные изменения на длине волны от 400 до 800 нм. Пики обозначены соответствующими цветными сферами. Анализ специфичности проводился с использованием CFP-10 и показал, что он является отрицательным контролем

Выводы

Туберкулез (ТБ) - серьезное опасное для жизни заболевание человека, и выявление туберкулеза на более ранней стадии помогает предотвратить распространение и лечить болезнь. В этом исследовании мы выбрали раннюю секреторную антигенную мишень (ESAT-6), один из основных белков при туберкулезе. Мы ввели одностадийный колориметрический анализ красного спектрального сдвига на основе антител с использованием наночастиц золота, и предел обнаружения составил 1,25 пМ. Специфичность этого анализа была выяснена с использованием контрольного белка (CFP-10), и он не показывает изменения цвета при добавлении GNP. С другой стороны, ESAT-6 сам по себе не привязан к ВНП. Благодаря этим доказательствам, присутствие предварительно образованных комплексов ESAT-6 и анти-ESAT-6 антител было продемонстрировано с надежностью колориметрического анализа красного спектрального сдвига. Эта стратегия проста и позволяет быстро обнаруживать аналогичные виды аналитов за один шаг. Кроме того, этот анализ может быть расширен с помощью небольшой молекулы в комплексе с подходящим антителом, чтобы быть подходящим для обнаружения в месте оказания медицинской помощи. Эта методика определенно работает с белками и пептидами меньшего размера. С белками большего размера, в зависимости от зарядов аминокислот, могут быть различия.

Сокращения

CFP-10:

Белок фильтрата культуры 10 кДа

ДНК:

Нуклеиновая кислота дезоксирибозы

ESAT-6:

Ранняя секреторная антигенная мишень 6 кДа

ВНП:

Золотая наночастица

NaCl:

Натрия хлорид

O.D:

Одна оптическая плотность

РНК:

Нуклеиновая кислота рибозы

ТБ:

Туберкулез

UV:

Ультрафиолет