Усиленный эффект объединения хлорогеновой кислоты на наночастицы селена в ингибировании агрегации β-амилоида и образования активных форм кислорода in vitro

Фон

Болезнь Альцгеймера (БА) - необратимое прогрессирующее нейродегенеративное заболевание, характеризующееся прогрессирующими когнитивными нарушениями и потерей нейронов [1]. В настоящее время широко признано, что накопление внеклеточных амилоидных бляшек в головном мозге является частым патологическим признаком БА [2, 3]. Бляшки содержат неправильную укладку и агрегацию белка амилоид-β (Aβ) [4]. Хотя точная роль протофибрилл или олигомеров Aβ в патогенезе БА до конца не изучена, накопленные данные свидетельствуют о том, что большинство из них являются токсичными видами, ответственными за дисфункцию и смерть нейронов [5,6,7,8]. Более того, агрегаты Aβ уже существуют в головном мозге пациента с БА. Эти агрегаты будут продолжать форматировать формы кислорода, реактивные к нейротоксинам (АФК), что вызовет серию повреждений клеточных компонентов, таких как ДНК, липиды и белки, и вызовет окислительный стресс при БА [9]. Повреждение нейрона обычно приводит к дефициту обучения и памяти. Таким образом, предполагается, что ингибирование агрегации β-амилоида и образования активных форм кислорода может быть многообещающей терапевтической целью для предотвращения или облегчения патологии БА.

Наноматериалы обладают уникальными физико-химическими свойствами, такими как малый размер, большая площадь поверхности и высокая реакционная способность. Недавно исследования показали, что при соответствующих модификациях поверхности наночастицы (НЧ) могут быть использованы в качестве инструментов для доставки лекарств, визуализации и терапевтических применений при БА [10,11,12]. Как правило, НЧ имеют большую площадь поверхности, что обеспечивает большую адсорбционную способность. В частности, Aβ может связываться с некоторыми NP, чтобы замедлять процессы фибрилляции Aβ. Например, связывание мономера Aβ с полиоксометаллатами снизило бы концентрацию свободных мономеров и сместило бы равновесие в сторону от фибрилляции [13]. Среди этих наноматериалов наночастицы селена (SeNP) демонстрируют несколько характеристик, которые делают их хорошо подходящими для биомедицинских приложений, таких как прямое получение и стабильность. Селен является важным микроэлементом, который играет важную роль в клеточной окислительно-восстановительной регуляции, детоксикации и защите иммунной системы [14]. Таким образом, по сравнению с неорганическими и органическими соединениями селена, SeNP обладают лучшей биосовместимостью и меньшей токсичностью [15]. В настоящее время поверхностные модификации НЧ способствуют сродству связывания между НЧ и Aβ и помогают исправить биохимические свойства конъюгированных молекул. Наше предыдущее исследование показало, что антиамилоидная способность SeNPs может быть дополнительно усилена путем трансплантации антиамилоидного пептида (LPFFD) на поверхность SeNP [12]. Однако большинство этих исследований не фокусировалось на антиокислительной способности НЧ после модификации поверхности.

Хлорогеновая кислота (Хлорогеновая кислота) является основным полифенольным компонентом фруктов, таких как яблоки, груши и ягоды, и ее особенно много в кофе [16]. CGA обладает рядом фармакологических свойств, таких как противораковые, противовоспалительные и антибактериальные [16]. В частности, CGA обладает антиоксидантной и нейропротекторной активностью, что позволяет применять его для лечения болезни Альцгеймера [17, 18]. Однако о влиянии CGA на агрегацию Aβ никогда не сообщалось. Кроме того, использование CGA ограничено его низкой биодоступностью и стабильностью, и только треть CGA, абсорбируемого из желудочно-кишечного тракта, достигает кровообращения [19]. В ряде исследований сообщается, что из-за небольшого размера НЧ они могут попадать в кровоток напрямую через вдыхание, проглатывание и транспортировку по кровотоку ко многим органам. Поэтому, чтобы решить эту проблему, мы исследовали связывание CGA с SeNP (CGA @ SeNP) для повышения потенциальной терапевтической эффективности CGA. В этом контексте целью данного исследования было изучить потенциальную терапевтическую эффективность CGA @ SeNP в отношении агрегации анти-Aβ и антиокисления. Насколько нам известно, ранее не было сообщений об использовании CGA @ SeNP для терапии БА.

Методы / экспериментальные

Материалы и линии ячеек

Aβ40 синтезирован в GL Biochem Ltd. (Шанхай, Китай). Диоксид селена (Na ₂ SeO ₃ ), NaBH ₄ , тиазолиловый синий тетразолий бромид (МТТ), тиофлавин Т и 2 ', 7'-дихлородигидрофлуоресцеин диацетат (DCFH-DA) были от Sigma (Сент-Луис, Миссури, США). CGA был приобретен у Aladdin (Шанхай, Китай). Среда Игла, модифицированная Дульбекко (DMEM), фетальная бычья сыворотка (FBS) и лошадиная сыворотка были получены от Gibco (Life Technologies AG, Швейцария). Клетки PC12 (феохромоцитома крысы, Американская коллекция типовых культур) культивировали в среде DMEM с добавлением 5% FBS и 10% лошадиной сыворотки при 37 ° C в 5% CO ₂ влажная среда при 37 ° C.

Подготовка CGA @ SeNP

Во-первых, исходные растворы 25 мМ CGA, 0,1 M Na ₂ SeO ₃ , и 0,1 М NaBH ₄ были подготовлены. Затем 200 мкл аликвоты Na ₂ SeO ₃ раствор смешивали с различными объемами CGA, и соотношения концентраций реагентов Na ₂ SeO ₃ в CGA были 1:1, 1:2, 1:4, 1:6 и 1:8. После этого 200 мкл 0,1 М NaBH ₄ добавляли в смесь и перемешивали в течение 30 мин. Цвет раствора изменился на красный. Превышение CGA и Na ₂ SeO ₃ были удалены диализом. Мы обнаружили, что наилучшее соотношение концентраций Na ₂ SeO ₃ для CGA было 1:6.

Характеристика CGA @ SeNP

Свежеприготовленные CGA @ SeNP были охарактеризованы с помощью просвечивающего электронного микроскопа (ТЕМ; Hitachi, H-7650), инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье (FT-IR; ИК-спектрометр Equinox 55) и УФ-видимой спектроскопии (спектрофотометр Carry 5000). Распределение по размерам определяли анализатором частиц Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Limited). Флуоресценцию наночастиц проводили на спектрофлуориметре JASCO FP6500 ( λ ex =350 нм).

H ₂ О ₂ Анализ генерации

Гидроксильный радикал, 2,29-азинобис- (3-этилбензотиазолин-6-сульфоновая кислота) (ABTS ⁺ ), а активность CGA и CGA @ SeNP по улавливанию супероксид-анионов анализировали с помощью коммерческих наборов (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Нанкин, Китай). Восстановительную способность образцов измеряли следующим образом:2 мл CGA или CGA @ SeNPs инкубировали с 2 мл фосфатного буфера (0,2 моль / л, pH 6,6) и 2 мл K ₃ Fe (CN) ₆ (1%, w / v ) при 50 ° C в течение 20 мин. После этого реакцию останавливали добавлением 2,5 мл трихлоруксусной кислоты (10%, w / v ) и центрифугировали при 3000 об / мин в течение 10 мин. Два миллилитра супернатанта смешивали с 2 мл дистиллированной воды и 1 мл FeCl ₃ . (0,1%, w / v ) при комнатной температуре в течение 10 мин. Наконец, оптическую плотность измеряли при 700 нм. Витамин c (Vc) использовали в качестве положительного контроля в анализе антиоксидантной активности.

H ₂ О ₂ генерацию Aβ40 анализировали с помощью DCFH-DA. Исходный раствор DCFH-DA (1 мМ), приобретенный в Beyotime Institute of Biotechnology (Шанхай, Китай). Четыре микромоляра пероксидазы хрена (HRP) получали в буфере (20 мМ Трис-HCl / 150 мМ NaCl, pH 7,4). Растворы образцов, содержащие 35 мкМ Aβ40 с 20, 40 и 60 мкг / мл CGA @ SeNP / CGA или без них, инкубировали при 37 ° C в течение 3 дней. К каждому образцу добавляли аскорбат (10 мкМ) и инкубировали в течение 1 часа. Анализы образцов выполняли путем добавления DCFH-DA (20 мкл, 100 мкМ) и HRP (2 мкл, 0,04 мкМ) к раствору образца (10 мкл). Спектры флуоресценции с длинами волн возбуждения и излучения 488 и 525 нм были измерены спектрофлуориметром JASCO FP6500.

Измерения флуоресценции тиофлавина T

Кинетику фибрилляции Aβ40 детектировали с помощью красителя тиофлавин Т (ThT). Вкратце, 35 мкМ Aβ40 инкубировали с 20, 40 и 60 мкг / мл CGA @ SeNPs / CGA при 37 ° C от 0 до 5 дней. Каждый день отбирали 50 мкл раствора и добавляли к 200 мкл раствора ThT (15 мкМ ThT в 50 мМ PBS, pH 7,4). Затем возбуждение ThT составляло 440 нм и регистрировалась длина волны излучения 490 нм.

ТЕМ

Морфологию Aβ40 в присутствии или в отсутствие CGA @ SeNPs / CGA наблюдали с помощью ТЕМ (Hitachi, H-7650). Образцы готовили так же, как и в анализе флуоресценции ThT. После 3 дней инкубации 10 мкл раствора образца наносили на покрытые углеродом медные решетки на 10 мин. Затем каждую сетку окрашивали 1,5% ( w / v ) фосфорновольфрамовой кислоты (pH 7,4) и дают высохнуть.

Связывание наночастиц с Aβ40 также подтверждали с помощью ПЭМ. Сначала 35 мкМ Aβ40 инкубировали в течение 3 дней для форматирования волокон. Затем в предварительно инкубированный раствор добавляли наночастицы 20 мкг / мл и инкубировали еще 6 часов. После этого образец был исследован на ПЭМ.

Измерения резонансного рассеяния света

Резонансное рассеяние света (RSL) измеряли по методу Yu et al. [20] с некоторыми изменениями. Определенное количество дисперсии Aβ40 разбавляли до 1 мл H ₂ . O, а конечная концентрация CGA @ SeNPs варьировала от 0,05 до 0,45 мкг / мл. Смесь инкубировали 10 мин. Интенсивности РЛС регистрировали на флуороспектрофотометре Cary Eclipse (Agilent Technologies, США) путем синхронного сканирования возбуждающего и эмиссионного монохроматоров (Δ λ =0 нм) от 200 до 800 нм. Ширина щели возбуждения и излучения была установлена ​​на 5 нм.

Анализ цитотоксичности

Жизнеспособность клеток анализировали с помощью анализа МТТ. Клетки PC12 высевали с плотностью 5000 клеток на лунку на 96-луночные планшеты в свежей среде без FBS. Aβ (35 мкМ) совместно инкубировали с 60 мкг / мл CGA @ SeNP / CGA в течение 3 дней или без него. После этого клетки обрабатывали этими образцами еще 72 ч. После инкубации клетки обрабатывали 10 мкл МТТ на лунку, следуя руководству по анализу пролиферации клеток в одном водном растворе Cell Titer 96 (Promega). Высвобождение лактатдегидрогеназы (ЛДГ) анализировали с использованием коммерческого набора для обнаружения. Клетки PC12 обрабатывали, как указано выше. По окончании обработки 96-луночный планшет центрифугировали при 1500 × g на 10 мин. Активность ЛДГ в супернатантах измеряли в соответствии с инструкциями производителя.

Внутриклеточное создание ROS

Эффекты CGA @ SeNPs / CGA на Aβ40-индуцированную генерацию внутриклеточных ROS контролировали с помощью анализа DCFH-DA. Ячейки PC12 (1 × 10 ⁵ на лунку) обрабатывали так же, как и в анализе МТТ. Затем клетки дважды промывали PBS и инкубировали с DCFH-DA (10 мМ) при 37 ° C в течение 30 мин. Уровень внутриклеточных АФК исследовали под флуоресцентным микроскопом (увеличение × 200) с длинами волн возбуждения и испускания 488 нм и 525 нм соответственно. Для измерения внутриклеточного уровня ROS клетки обрабатывали таким же образом и собирали центрифугированием, повторно суспендировали в PBS. Затем клетки были проанализированы методом проточной цитометрии.

Анализ совместного окрашивания TUNEL-DAPI

Клетки PC12 обрабатывали так же, как в анализе МТТ. После этого клетки на предметных стеклах камеры фиксировали 3,7% формальдегидом и повышали проницаемость с помощью 0,1% Triton X-100 в PBS. Анализ окрашивания проводили с использованием набора для анализа мечения ник-концов терминальной трансферазы dUTP (TUNEL) (KeyGen BioTECH, Нанкин, Китай) в соответствии с протоколом производителя. Изображения были получены с помощью флуоресцентного микроскопа (увеличение × 200).

Статистика

Статистическая значимость оценивалась с использованием одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим апостериорным тестом Бонферрони. Статистическая значимость была установлена ​​на уровне P . <0,05.

Результаты и обсуждение

Характеристика CGA @ SeNP

В этом исследовании мы используем простой метод синтеза CGA @ SeNP путем восстановления смеси CGA и Na ₂ SeO ₃ с NaBH ₄ . Наночастицы размером от 30 до 150 нм были более благоприятными для клеточного поглощения [21]. ПЭМ показала, что CGA @ SeNP имеют сферическую структуру с диаметром около 100 нм (рис. 1a), что позволяет предположить, что размер CGA @ SeNP подходит для биологического применения. Анализ элементного состава показал, что Se, C и O могут быть легко обнаружены на графике энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии (EDX) CGA @ SeNPs (рис. 1b). Сигнал атомов Se составил 30,00% вместе с сильным сигналом атома C (52,60%) и сигналом атома O (1,50%) от CGA, что указывает на то, что мы успешно получили CGA @ SeNP.

Характеристика CGA @ SeNP. а ПЭМ-изображения CGA @ SeNP. б EDX-анализ CGA @ SeNP. c УФ-видимый спектр поглощения CGA @ SeNPs. г Спектр излучения CGA @ SeNPs

Спектр поглощения CGA в УФ-видимой области показывает характерный пик поглощения при 334 нм (рис. 1c). Однако наблюдался небольшой сдвиг в спектре поглощения CGA @ SeNP в УФ-видимой области, и пик поглощения изменился до 337 нм. Длины волн излучения CGA и CGA @ SeNP определяли с помощью флуоресцентного спектрофотометра. Длина волны излучения CGA составляла 442,9 нм, которая была сдвинута до 437,5 нм в CGA @ SeNPs (рис. 1d). Эти результаты подтвердили присутствие CGA на поверхности SeNP. ИК-Фурье-спектр CGA @ SeNPs свидетельствует о том, что CGA входил в состав нанокомпозита. Частота растяжения O – H находится на уровне 3353,99 см ⁻¹ . в спектре FT-IR CGA (Дополнительный файл 1:Рисунок S1); однако этот характерный пик в CGA @ SeNPs был изменен на 3419,00 см ^-1 . Сдвиг подтвердил, что CGA был конъюгирован с поверхностью SeNP через группу -OH.

Стабильность CGA @ SeNP в физиологических условиях важна для оценки их будущего применения. Таким образом, распределение по размерам CGA @ SeNPs в PBS (pH 7,4) контролировали при комнатной температуре в течение 7 дней. Как показано в Дополнительном файле 1:Рисунок S2, размер CGA @ SeNPs оставался стабильным со средним размером около 100 нм, а CGA @ SeNPs сохраняли хорошую диспергируемость в воде в PBS в течение 7 дней. Хорошая стабильность CGA @ SeNP поддерживает их потенциальное применение в медицине.

Запрещение создания ROS

Депонированный Aβ может активировать микроглию и стимулировать микроглию к выработке нейротоксинов, таких как ROS, которые могут в дальнейшем вызывать серьезное повреждение нейронов в головном мозге [22]. Кроме того, ROS, такие как перекись водорода (H ₂ О ₂ ) также могут генерироваться агрегатами Aβ [23]. Таким образом, мы исследовали антиоксидантную активность CGA @ SeNP и влияние CGA @ SeNP на H ₂ , индуцированный агрегатами Aβ. О ₂ формирование. Как показано в Дополнительном файле 1:Рисунок S3, CGA @ SeNP обладают сильной улавливающей активностью против радикалов в зависимости от концентрации. Когда концентрация достигает 60 мкг / мл, гидроксильный радикал ABTS ⁺ , а активность по улавливанию супероксид-анионов достигла 70,3%, 95,2% и 95,1% соответственно. Очевидно, восстанавливающая сила CGA @ SeNPs возрастает с увеличением концентрации. Среди всех образцов CGA @ SeNP продемонстрировали сильную восстанавливающую способность и способность улавливать гидроксильный радикал, ABTS ⁺ , и супероксид-анион, чем Vc и CGA. Эти результаты свидетельствуют о том, что CGA @ SeNP проявляют более высокую антиоксидантную активность, что может помочь в поглощении активного кислорода при БА. Следует отметить, что модификация CGA на SeNP оказывает синергетический эффект на антиоксидантную активность.

Влияние CGA @ SeNP на Aβ-опосредованный H ₂ О ₂ образование было исследовано с помощью анализа DCFH-DA [24], который может указывать на образование H ₂ О ₂ из Aβ в присутствии или в отсутствие CGA @ SeNP. Как показано на рис. 2, CGA @ SeNPs и CGA уменьшали H ₂ О ₂ дозозависимым образом. Что еще более важно, образцы Aβ, содержащие CGA @ SeNP, показывают меньше H ₂ О ₂ чем те, которые содержат CGA, показывая, что высокая антиоксидантная активность CGA @ SeNPs продемонстрировала больший эффект, чем CGA, в снижении Aβ-индуцированного H ₂ О ₂ поколение.

H ₂ О ₂ образование в результате реакций Aβ40 в присутствии или в отсутствие наночастиц. Aβ =35 мкМ, наночастицы / CGA =20, 40 и 60 мкг / мл

Подавление агрегации Aβ с помощью CGA @ SeNP

Хотя антиоксидантная активность CGA является хорошо известным свойством, активность CGA против агрегации амилоида все еще неизвестна. Чтобы проверить возможность использования CGA @ SeNP для терапевтического применения при БА, ингибирующий эффект CGA @ SeNP на агрегацию Aβ был сначала исследован с помощью флуорометрического анализа на основе ThT, который является хорошо зарекомендовавшим себя методом мониторинга образования β-слоев при непрерывном время [25]. Как показано на фиг. 3а, Aβ40 агрегировал спонтанно, и флуоресценция фибрилл Aβ постепенно увеличивалась, пока не достигла плато к 3 дням инкубации. Мы наблюдали, что CGA @ SeNP были способны медленно агрегировать амилоидные белки с увеличением концентрации. Достигнута интенсивность флуоресценции волокон Aβ40 примерно в два раза выше, чем у Aβ40, инкубированного с 60 мкг / мл CGA @ SeNP. Однако в CGA наблюдалось небольшое или нулевое изменение интенсивности флуоресценции ThT, что позволяет предположить, что CGA лишь незначительно ингибирует агрегацию Aβ40.

Эффект ингибирования CGA @ SeNP на фибрилляцию Aβ40. а Флуоресценция ThT образования фибрилл Aβ40 в присутствии или в отсутствие наночастиц / CGA от 0 до 5 дней. Aβ40 =35 мкМ, наночастицы / CGA =20, 40 и 60 мкг / мл. б Морфология Aβ40, инкубированного с наночастицами или CGA или без них, в течение 3 дней. Aβ40 =35 мкМ, наночастицы / CGA =60 мкг / мл

Морфологические изменения Aβ40, инкубированного с CGA или CGA @ SeNP или без них, показаны на фиг. 3b. Aβ40, инкубированный в течение 3 дней, образовывал обильные фибриллы, тогда как в присутствии CGA @ SeNP (60 мкг / мл) фибриллы не образовывались. Как и ожидалось, CGA не оказывал значительного ингибирования фибриллогенеза Aβ, тогда как большие количества агрегатов наблюдались в растворе Aβ40, обработанного CGA, что соответствовало флуорометрическому анализу ThT. Эти результаты показали, что после модификации CGA на SeNP он, очевидно, может уменьшить образование β-листов.

Активность связывания CGA @ SeNP с Aβ40

Чтобы лучше понять ингибирующую активность CGA @ SeNP в отношении агрегации Aβ, мы исследовали аффинность связывания CGA @ SeNP с Aβ40. Во-первых, чтобы оценить связывание наночастиц с волокнами Aβ40 на ультраструктурном уровне, волокна Aβ40 инкубировали с CGA @ SeNP. Мы наблюдали, что фибриллы специфически связываются на поверхности SeNPs без присутствия каких-либо свободных неассоциированных взвешенных наночастиц (рис. 4a).

Сродство CGA @ SeNP к Aβ40. а Связывающая способность CGA @ SeNPs на волокнах Aβ40. Полученные волокна Aβ40 инкубировали с CGA @ SeNP и исследовали с помощью ТЕМ. Aβ40 =35 мкМ, CGA @ SeNPs =60 мкг / мл. б Аффинность и спецификация CGA @ SeNP для мономера Aβ40. Спектры RLS мономера Aβ40 в присутствии различных концентраций CGA @ SeNP. Aβ40 =600 нМ, концентрация наночастиц, 1–9:0, 0,05, 0,1, 0,15, 0,2, 0,25, 0,3, 0,35 и 0,4 мкг / мл. c Спектры RLS CGA @ SeNPs, концентрация наночастиц, 1–9:0,05, 0,1, 0,15, 0,2, 0,25, 0,3, 0,35, 0,4 и 0,45 мкг / мл

Резонансное рассеяние света (RLS) - это мощный оптический метод, основанный на упругом рассеянии света, который широко применяется для изучения размера, формы и распределения наночастиц в растворе [26]. Таким образом, затем мы использовали RLS для анализа взаимодействия между мономером Aβ40 и CGA @ SeNP. Как показано на рис. 4b, c, интенсивность RLS у НЧ намного ниже, чем у НЧ, инкубированных с 600 нМ мономера Aβ40 в той же концентрации. Как только CGA @ SeNPs подверглись воздействию молекул Aβ, Aβ, как полагают, связывается на поверхности SeNP через N-доноры, содержащие боковые цепи аминокислот, с образованием связи Se – N [27]. Образование конъюгатов молекул Aβ на CGA @ SeNP приводит к увеличению размера разброса, что увеличивает интенсивность RLS системы (рис. 4b). В сочетании с результатами анализа ThT и ПЭМ предполагается, что взаимодействия между большой поверхностью CGA @ SeNP и мономером Aβ40 могут привести к неблагоприятным условиям для зародышеобразования и роста фибрилл из-за блокирования прямого контакта между мономерами. Таким образом, CGA @ SeNP оказывают большее влияние, чем CGA, в ингибировании агрегации Aβ40.

Подавление нейротоксичности Aβ40

Цитотоксичность Aβ40 в присутствии или в отсутствие CGA @ SeNP в клетках PC12 исследовали с помощью МТТ-анализа. На рис. 5а показано, что волокна Aβ40 были токсичными для клеток PC12, что снижало жизнеспособность клеток до 53%. В присутствии CGA @ SeNP выживаемость клеток увеличивалась примерно до 95%. Однако предварительная обработка клеток CGA лишь незначительно увеличивала выживаемость клеток до 66%. Кроме того, CGA @ SeNP не токсичны для клеток PC12 (дополнительный файл 1:рисунок S4), что позволяет предположить, что CGA @ SeNP могут ингибировать нейротоксичность Aβ40.

Нейротоксичность Aβ40, инкубированного с CGA @ SeNP / CGA или без него. а Жизнеспособность клеток PC12 по отношению к Aβ40 в присутствии CGA @ SeNP или CGA проверяли с помощью анализа МТТ. б Выброс ЛДГ в питательную среду. Aβ40 =35 мкМ, CGA @ SeNPs / CGA =60 мкг / мл

Сообщалось, что Aβ преимущественно иммобилизуется на поверхности клетки и вызывает повреждение клеточной мембраны [28]. Поэтому, чтобы определить целостность клеточной мембраны после воздействия Aβ40 в присутствии или в отсутствие NPs / CGA, мы измерили внеклеточные уровни ЛДГ в среде для культивирования клеток. В этом анализе высокий уровень ЛДГ отражает повреждение клеточной мембраны. Как показано на фиг. 5b, по сравнению с контролем после воздействия Aβ40 высвобождение ЛДГ увеличивалось до 142%. В соответствии с результатом МТТ в присутствии CGA @ SeNP высвобождение ЛДГ снижалось до нормального уровня. Интересно, что мы наблюдали, что CGA не снижает концентрацию LDH, предполагая, что CGA не может предотвратить повреждение клеточной мембраны клеток PC12, вызванное агрегатами Aβ.

Предотвращение индуцированного Aβ40 образования ROS в клетках PC12

Агрегаты Aβ способны продуцировать АФК, которые могут вызывать окислительный стресс при БА [29]. Из-за антиоксидантных и антиагрегационных свойств CGA @ SeNPs мы предположили, что он способен снижать индуцированную Aβ40 генерацию ROS в клетке PC12. Таким образом, влияние NP на индуцированную агрегатом Aβ40 генерацию ROS измеряли с помощью DCFH-DA. DCF представляет собой флуоресцентный маркер, полученный в результате реакции нефлуоресцентного DCFH-DA с ROS, который может указывать на образование ROS, индуцированное агрегатами Aβ40. Как показано в дополнительном файле 1:фиг. S5, обработка агрегатами Aβ40 вызывала более чем 1,5-кратное увеличение содержания ROS по сравнению с необработанными клетками. Обработка CGA @ SeNP снижала интенсивность флуоресценции DCF в клетках PC12, указывая на то, что CGA @ SeNP снижали АФК, индуцированную фибриллами Aβ, до нормального уровня. Интересно, что CGA также снизила генерацию ROS в клетках PC12, но не так очевидно, как CGA @ SeNP.

Предотвращение апоптоза клеток, индуцированного Aβ40, в клетках PC12

Сообщалось, что гибель нейрональных клеток, вызванная фибриллами Aβ, является критическим событием при патологии БА [30]. Для дальнейшего изучения цитотоксичности фибрилл Aβ40 мы выполнили совместное окрашивание TUNEL-DAPI, чтобы определить влияние NP или CGA на апоптоз клеток, индуцированный Aβ40. Фрагментация ДНК является признаком апоптоза клеток, который можно обнаружить на ранних стадиях апоптоза с помощью TUNEL [31]. Как показано на фиг. 6, апоптотические ядра окрашивали ярким флуоресцентным зеленым цветом с помощью TUNEL. Aβ40 резко увеличивал количество ядер, окрашенных TUNEL, тогда как обработка CGA @ SeNP вызывала уменьшение TUNEL-положительных ядер, демонстрируя, что CGA @ SeNP могут защищать нейроны от апоптоза клеток PC12, индуцированного Aβ40. В противном случае высокие уровни АФК в клетках также участвуют в апоптозе [32]. Таким образом, эти результаты указывают на то, что апоптоз, вызванный Aβ40, может быть отнесен к генерации ROS. Стоит отметить, что CGA может также снижать апоптоз клеток, индуцированный Aβ40. По данным анализа МТТ и ЛДГ, CGA не увеличивал выживаемость клетки и не уменьшал вызванное агрегатом Aβ повреждение клеточной мембраны. Объединив результаты анализа ТЕА и ThT, мы обнаружили, что CGA обладает антиоксидантными свойствами, которые могут очищать активный кислород в процессе агрегации Aβ, но не могут полностью ингибировать агрегацию Aβ. Следовательно, CGA может уменьшать образование ROS в инкубационном растворе и клетках PC12, защищая апоптоз клеток, вызванный ROS, но не может уменьшить повреждение клеточной мембраны, вызванное агрегатом Aβ. Повреждение клеточной мембраны приведет к утечке внутриклеточного содержимого в окружающую ткань, что может привести к повреждению ткани и воспалению [33]. Таким образом, сочетание ингибированной агрегации Aβ и образования активных форм кислорода можно рассматривать как новый терапевтический метод.

CGA @ SeNP предотвращают индуцированный Aβ40 апоптоз клеток PC12. Апоптоз клеток определяли с помощью анализа совместного окрашивания TUNEL-DAPI. Ядро нормальных клеток окрашивали в синий цвет, а фрагмент ДНК - в зеленый. Aβ40 =35 мкМ, CGA @ SeNPs / CGA =60 мкг / мл

Выводы

Таким образом, CGA обладает антиоксидантным фармакологическим свойством, но не влияет на ингибирование фибрилляции Aβ. Модификация поверхности CGA на SeNP придает ему новое свойство антиагрегации. Aβ40 может связываться на поверхности CGA @ SeNP, что приводит к неблагоприятным условиям для зародышеобразования и роста фибрилл из-за блокирования прямого контакта между мономерами. В этом случае CGA @ SeNP ингибировали агрегацию Aβ40, очищали ROS и защищали клетки PC12 от разрушения клеточной мембраны и ROS-опосредованного апоптоза, индуцированного агрегатами Aβ40. Однако в группе CGA агрегаты Aβ иммобилизовались на поверхности клетки и вызывали повреждение клеточной мембраны, что также приводило к гибели клеток. В целом, CGA @ SeNP более эффективны, чем CGA, в снижении токсичности Aβ40 при длительном использовании.

Сокращения

ABTS ⁺ :

2,29-Азинобис- (3-этилбензотиазолин-6-сульфоновая кислота)

AD:

Болезнь Альцгеймера

Aβ:

Амилоид-β

CGA:

Хлорогеновая кислота

DCFH-DA:

2 ', 7'-Дихлородигидрофлуоресцеиндиацетат

DMEM:

Среда Игла, модифицированная Дульбекко

EDX:

Энергодисперсионная рентгеновская спектроскопия

FBS:

Фетальная бычья сыворотка

FT-IR:

Инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье

HRP:

Пероксидаза хрена

LDH:

Лактатдегидрогеназа

MTT:

Тиазолиловый синий тетразолий бромид

ROS:

Активные формы кислорода

RSL:

Измерения резонансного рассеяния света

SeNPs:

Наночастицы селена

ТЕМ:

Просвечивающий электронный микроскоп

ThT:

Тиофлавин Т

ТУНЕЛЬ:

Маркировка ника терминальной трансферазы dUTP

Vc:

Витамин с