Золотые наночастицы круглой формы:влияние размера и концентрации частиц на рост корней Arabidopsis thaliana

Фон

В настоящее время современная химия и инженерия производят огромное количество нанообъектов, чтобы улучшить полезные свойства вещества не только в специальных приложениях, но и во все большей степени в продуктах повседневного потребления. Наноструктурированные материалы, например, наночастицы [1, 2], наностержни [3], нанотрубки [4], нетканые нанотекстильные материалы [5], когда они стоят или прикреплены к различным типам подложек, значительно увеличивают выход продукции практически во всех областях промышленного применения, начиная с от косметики [6] и здравоохранения [7] до биоинженерии [8, 9], до приложений преобразования энергии [10] и катализаторов [3]. Хотя включение наноматериалов в эти продукты может улучшить их характеристики, их разрушение в конце срока их полезного использования обеспечивает несколько ключевых точек входа синтетических НЧ в окружающую среду. Специально разработанные наночастицы, которые широко используются в катализаторах, УФ-защитных стабилизаторах красок, антимикробных средствах в текстильной промышленности или в продуктах здравоохранения и косметике (в частности, в продуктах с высокой химической инертностью, таких как Au, Ag, Pt и Pd), должны Следует уделить особое внимание, поскольку они могут накапливаться в окружающей среде почти без изменений в течение многих лет, вызывая пока неизвестные процессы при поглощении их растениями. Что касается наночастиц благородных металлов (НМНЧ), было опубликовано несколько новаторских работ по влиянию наночастиц серебра (AgНЧ) на проростки талайского кресс-салата ( Arabidopsis thaliana ), что указывает на то, что очень низкие концентрации AgNP (<1 ppm) могут быть токсичными для проростков [11]. AgNP размером от 20 до 80 нм явно задерживают рост, а их фитотоксичность зависит от концентрации и размера частиц. Кончик корня (шляпка и колумелла) становился светло-коричневым, когда первичные корни подвергались воздействию AgNP. Коричневый кончик был приписан адсорбции AgNP либо сам по себе, либо в сочетании с материалами клеточной стенки или вторичными метаболитами, продуцируемыми кончиками корней. Однако точный механизм еще не выяснен.

Несмотря на то, что было проведено несколько исследований, посвященных роли НЧ в окружающей среде [12], нацеленные на наночастицы золота (AuNP) все еще редки [13]. Если возможно, большинство опубликованных данных по нанотоксикологии сосредоточено на цитотоксичности млекопитающих [14,15,16] или воздействии на животных и бактерии [17,18,19,20], и лишь в нескольких исследованиях рассматривалась токсичность искусственно созданных веществ. НП к растениям. Кроме того, взаимодействие NMNPs с растениями и другими организмами, которые имеют сходство с растительными клетками, такими как водоросли, до сих пор мало изучено, что означает, что общие последствия воздействия NMNP на растительные клетки все еще остаются неясными [11]. Отсутствие этих данных приводит к неправильному пониманию того, как NMNP передаются и накапливаются на различных уровнях пищевой цепи.

В этой работе мы сообщаем о влиянии наночастиц золота на рост растений, особенно на развитие первичных и боковых корней A. Талиана в присутствии частиц разного размера. AuNP были синтезированы влажным методом в соответствии с биологически безопасным протоколом без использования стабилизаторов, в результате чего были получены сферические наночастицы с точным контролем их размера и распределения по размерам. Перед обработкой растений AuNP были тщательно охарактеризованы с помощью широкого спектра аналитических методов (AAS, ICP-MS, DLS и TEM).

Экспериментальный

Материалы, оборудование и процедуры

Наночастицы золота были синтезированы по слегка адаптированной методике, опубликованной Batús et al. [20]. Вкратце, 149 мл воды нагревали в двугорлой круглодонной колбе на 250 мл до тех пор, пока она не начала кипеть с обратным холодильником. Затем последовательно добавляли 1 мл 0,33 М цитрата натрия и 0,945 мл 10 мг / мл тетрахлораурата (III) калия в воде. Через 30 мин нагревание прекращали и реакционную смесь оставляли охлаждаться. Во всех подготовительных экспериментах использовалась вода Milli-Q (18,2 МОм при 25 ° C).

Для корневых проб A. Талиана , синтезированные AuNP трех разных размеров (10, 14 и 18 нм) центрифугировали при 5000 g в течение 1 ч для увеличения концентрации частиц до предельного значения 2000 мг / л.

А. Талиана Семена Columbia (Col-0) (полученные от Lehle Seeds, США) стерилизовали поверхность 30% ( v / v ) отбеливающим раствором в течение 10 мин и пять раз промыть стерильной водой. Стерильные семена высевали на чашки с агаром, содержащие ½ среды Murashige-Skoog (MS) и 1% растительный агар (pH 5,8). Для синхронизации прорастания семян чашки с агаром выдерживали при 4 ° C в течение 2 дней. А. Талиана растения выращивали в течение 5 дней в вертикально ориентированных пластинах в камере для выращивания при 22 ° C с 100 мкмоль м ^{- 2} s ^{- 1} интенсивность света в условиях длинного дня (цикл свет / темнота 16 часов / 8 часов)

Пятидневные проростки аналогичного размера переносили на чашки с агаром (20 растений на чашку), содержащие среду 1/16 MS, различные концентрации AuNP (0, 1, 10 и 100 мг / л) и 1% растительный агар ( pH 5,8). AuNP добавляли в среду после автоклавирования. В качестве контроля также исследовали действие натрийцитратного буфера. Отмечали длину корня и выращивали сеянцы в течение следующих 5 дней. Прирост длины основного и боковых корней измеряли с помощью программного обеспечения JMicroVision 1.2.7.

Аналитические методы

Приготовленные растворы AuNP были охарактеризованы с помощью атомно-абсорбционной спектроскопии (AAS), масс-спектроскопии с индуктивно связанной плазмой (ICP-MS), динамического рассеяния света (DLS) и просвечивающей электронной микроскопии (TEM).

Концентрации полученных НЧ определяли методом ААС на приборе VarianAA880 (Varian Inc., США) с использованием пламенного распылителя на длине волны 242,8 нм. Типичная погрешность определения концентрации этим методом составляет менее 3%.

Индуктивно связанная плазма с масс-спектроскопическим детектором (ICP-MS) была использована для определения концентрации ионов Au, происходящих из непрореагировавшего химического источника Au, с использованием трехквадрупольного спектрометра Agilent 8800 (Agilent Technologies, Япония), подключенного к автоматическому пробоотборнику. Коллоидный раствор AuNPs переносили пипеткой в ​​гидрофобные микропробирки объемом 1,5 мл и центрифугировали при 30000 g на центрифуге Eppendorf 5430 в течение 1 ч. После центрифугирования 0,3 мл супернатанта осторожно удаляли пипеткой и анализировали ICP-MS. Распыление образцов проводили с помощью устройства MicroMist, оснащенного перистальтическим насосом. Чистый буферный раствор (2,2 мМ цитрата натрия) использовали в качестве холостого образца. Погрешность измерения была менее 3%.

ПЭМ-изображения получали с помощью JEOL JEM-1010 (JEOL Ltd., Япония), работающего при 400 кВ. Каплю коллоидного раствора помещали на медную сетку, покрытую тонкой пленкой аморфного углерода на фильтровальной бумаге. Избыток растворителя удаляли. Образцы сушили на воздухе и хранили под вакуумом в эксикаторе перед размещением на держателе образцов. Размер частиц был измерен по микрофотографиям ПЭМ и рассчитан с учетом не менее 500 частиц.

Распределение частиц по размерам определяли с помощью Zetasizer ZS90 (Malvern Instruments Ltd., Англия) в режиме DLS для распределения частиц по размерам, оборудованном лавинным фотодиодом для обнаружения сигнала. В качестве источника света использовался твердотельный лазер с диодной накачкой (50 мВт, 532 нм). Измерения проводились в кюветах из полистирола при комнатной температуре.

Результаты и обсуждение

Характеристика наночастиц

Размер и распределение AuNP по размеру определяли с помощью анализов TEM и DLS. Результаты суммированы в таблице 1 вместе с концентрациями AuNP, определенными с помощью AAS сразу после синтеза NP, и концентрациями остаточных ионов Au, определенными с помощью ICP-MS. Из этих данных очевидно, что наш протокол синтеза обеспечивает хорошо контролируемые наночастицы Au с довольно узким распределением по размерам. Здесь мы использовали модифицированный метод, опубликованный Batús et al. [20] для синтеза стабилизированных цитратом AuNP с регулируемым размером и формой. Разработанный протокол позволяет целенаправленно увеличивать размер на основе увеличения предварительно синтезированных AuNP посредством катализируемого поверхностью восстановления Au ³⁺ вместе с эффективным одновременным ингибированием вторичной нуклеации.

Wang et al. [21] обнаружили, что во время 3-дневного гидропонного воздействия на A. Талиана либо к Ag ⁺ и AgNP (5 нМ) при одинаковой концентрации, концентрация Ag снижалась быстрее в Ag ⁺ -обработанный раствор, чем в растворе AgNP, что указывает на более быстрое поглощение Ag ⁺ ионы. Поэтому мы уделили особое внимание минимизации возможного влияния ионов Au на искажение результата. Синтезированные AuNP центрифугировали до предельной концентрации 2000 мг / л и разбавляли средой MS до требуемых концентраций (1, 10 и 100 мг / л). После этой процедуры концентрацию остаточных ионов Au в растворах, содержащих 100 мг / л AuNP, определяли с помощью ICP-MS (см. Таблицу 1). По-видимому, центрифугирование положительно повлияло как на присутствие остаточных ионов Au, концентрации которых были снижены на два порядка по сравнению с растворами в исходном состоянии (таблица 1, AAS), так и на содержание самого цитратного буфера.

Для количественной оценки полидисперсности НЧ мы выполнили измерение DLS, которое очень чувствительно к присутствию в конечном итоге конгломератов частиц (рис. 1). В этом измерении даже небольшое количество агломерированных наночастиц вызывает преобладание соответствующего пика на значительно более высоких диаметрах, особенно в распределении размеров, взвешенных по интенсивности (см. Вставку на рис. 1). К счастью, агломерации частиц не было обнаружено, и поэтому на достоверность оценки размера может повлиять только сферическое приближение [22]. Несмотря на этот недостаток, измерение DLS дает статистически более значимую общую картину распределения частиц по размерам по сравнению с ТЕМ, поскольку оно оценивает сразу весь объем образца. Из-за преимущественно круглой формы полученных наночастиц (см. Рис. 2) размеры, полученные методом DLS, хорошо согласуются с размерами, полученными с помощью ПЭМ (таблица 1). Видимые агломераты частиц, видимые на изображении ПЭМ (рис. 2, 10 нм), были, скорее, вызваны необходимостью удаления растворителя при измерениях ПЭМ, а не взаимосвязью отдельных частиц в самом коллоидном растворе.

Анализ динамического светорассеяния (числово-взвешенное распределение по размерам) водных растворов AuNP разного размера. На вставке показаны «сырые» данные, взвешенные по интенсивности. Цифры относятся к среднему диаметру частиц в нм

ПЭМ-изображения подготовленного набора AuNP. Обратите внимание, что увеличение изображения различается в зависимости от размера НП

Адаптация растворов наночастиц к условиям биологии растений

Из-за сильной тенденции к агрегации AuNP в среде для выращивания растений (среда MS), обычно используемой для роста растений in vitro [23], нам пришлось оптимизировать взаимное соотношение этих двух компонентов, чтобы избежать агрегации NPs при сохранении приемлемых условий для роста растений. Были протестированы различные разведения MS. Агрегация AuNP была хорошо видна по изменению цвета (переход от красного к пурпурному). Из-за низкой начальной концентрации AuNP в исходном состоянии (около 30 мг / л, см. Таблицу 1), недостаточной для биологических экспериментов, было необходимо увеличить концентрацию NP путем центрифугирования. С помощью этой процедуры мы увеличили концентрацию частиц до предельного значения 2000 мг / л. Такие растворы НЧ затем разбавляли до конечных концентраций, что также уменьшало концентрацию цитратного буфера в наших экспериментах. Для экспериментов по выращиванию А. Талиана , мы разводили AuNP в среде 1/16 MS. В этой среде обнаруживалась минимальная агрегация НЧ, и НЧ были намного более стабильными по сравнению с 1/2 МС, 1/4 МС и 1/8 МС с почти неизменным ростом растений. Концентрацию AuNP в конечных растворах определяли методом ААС. Поскольку эксперименты по выращиванию растений проводились in vitro (в стерильных условиях), изучалось также влияние процедуры стерилизации на НЧ. Обычно применяемое автоклавирование (121 ° C, 20 мин) приготовленных питательных сред приводило к полной агрегации исследуемых НЧ. Поэтому данная процедура не подходила для наших экспериментов. Добавление НЧ в автоклавированную агаровую среду с температурой около 60 ° C было наконец использовано в качестве альтернативной процедуры, при которой не было обнаружено агрегации НЧ и процесс стерилизации все еще оставался эффективным.

Влияние НЧ на рост корней Arabidopsis thaliana in vitro

Модельные растения, такие как двудольные A. Талиана могут помочь понять факторы стресса, снижающие урожайность сельскохозяйственных культур во всем мире, с целью выявления генов, которые могут улучшить жизнеспособность в условиях стресса [24]. Все протестированные формы AuNP оказали значительное влияние на боковые корни (LR). И длина (рис. 3a), и количество (рис. 3b) LR были уменьшены у растений, обработанных AuNP. Самые высокие концентрации AuNP (100 мг / л) из всех исследованных размеров частиц вызвали уменьшение длины LR примерно до 50%. Количество LR уменьшается примерно до 70% в случае AuNP 18 нм и максимальной концентрации (100 мг / л). Немного меньшее уменьшение количества LR наблюдалось при использовании максимальной концентрации AuNP меньшего размера (14 и 10 нм) (рис. 3b). Длина первичных корней также уменьшилась после обработки AuNP (рис. 3в). Отрицательный эффект 10-нм AuNP был значительным, особенно при более высоких концентрациях частиц. Эффект более крупных частиц (14, 18 нм) был намного меньше и аналогичен эффекту натрийцитратного буфера, который использовали в качестве контроля. Большинство опубликованных исследований сконструированных НЧ указывало на определенную степень фитотоксичности, особенно при высоких концентрациях НЧ. Например, покрытые цитратом AgNP ингибировали A. Талиана удлинение корня проростков с линейной зависимостью от дозы от 67 до 535 мкг / л через 2 недели [25]. Несколько других исследований с использованием анализов удлинения корня и прорастания семян продемонстрировали, что на фитотоксичность влияет размер НЧ. Многие исследования пришли к выводу, что чем меньше НЧ, тем они более фитотоксичны. Однако это обобщение о размерно-зависимой токсичности созданных наноматериалов не всегда верно для всех комбинаций растений и типов НЧ [21, 25]. Напротив, одностенные углеродные нанотрубки положительно влияли на удлинение корней томатов, капусты, моркови и салата за 24–48 часов [26]. О положительном влиянии 24 нм AuNP на скорость прорастания семян и вегетативный рост сообщили Kumar et al. [13].

Влияние AuNP на а длина и b количество боковых корней и c удлинение первичного корня A. Талиана саженцы. Растения подвергали воздействию различных концентраций (0,1, 10 и 100 мг / л) AuNP 10, 14 и 18 нм. Данные представляют собой средние значения + стандартное отклонение 19–20 растений. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001; т тест

Существенный положительный эффект AuNP размером 10 нм на рост корневых волосков наблюдался во время экспериментов по росту корней (рис. 4). Этот эффект показал сильную зависимость от концентрации. Увеличение концентрации NP вызывает более выраженный рост корневых волосков (рис. 4д). Такое поведение часто наблюдается у корней, выращиваемых на почвах, бедных фосфором [27]. Подобный эффект не наблюдался в случае AuNP 14 и 18 нм. В противоположность этому, Гарсиа-Санчес и др. [28] заметил, во время А. Талиана обработка коммерчески доступными AgNPs, ингибирование количества корневых волосков, относящихся к 1 см корня растения. Уменьшение корней волос наблюдалось в случае всех протестированных частиц, независимо от их конкретного размера (10, 20, 40 и 80 нм), при использовании однородной концентрации лечебных растворов 200 мг / л. Корневые волоски существенно увеличивают площадь поверхности корней, контактирующей с почвой, и большая часть воды и питательных веществ, попадающих в растение, всасывается через них. Таким образом, на их развитие в значительной степени влияют раздражители окружающей среды и сигналы стресса [29].

Влияние различных концентраций AuNP 10 нм на рост корневых волосков у A. Талиана саженцы. а Контроль, b - г проростки, обработанные 1, 10 и 100 мг / л AuNP соответственно, и e детали индуцированного роста корневых волосков у растений, подвергнутых воздействию 100 мг / л AuNP. Масштабные линейки соответствуют 1 см

Выводы

Мы успешно получили золотые наночастицы путем мягкого двухкомпонентного восстановления (цитрат натрия – тетрахлораурат калия) в водной среде с получением круглых частиц с узким распределением и отличным контролем их конечного размера. Центрифугирование после синтеза позволило достичь желаемых концентраций НЧ и исключило влияние ионов и цитратного буфера на искажение результатов в экспериментах на растениях. Влияние AuNP разного размера (10, 14 и 18 нм в диаметре) и концентрации (1, 10 и 100 мг / л) на рост корней A. Талиана был исследован. Количество и длина боковых корней значительно уменьшились после обработки растворами НЧ с более высокой концентрацией частиц, независимо от их конкретного размера. Негативное влияние на рост первичных корней наблюдалось в случае AuNP размером 10 нм. Удивительно, но самые маленькие AuNP (10 нм) явно индуцировали рост корневых волосков. В целом, это исследование показало, что прямое воздействие AuNP на растения в значительной степени способствовало фитотоксичности и подчеркивает необходимость экологически ответственной утилизации отходов и ила, содержащих наночастицы Au.

Сокращения

AAS:

Атомно-абсорбционная спектроскопия

AgNPs:

Наночастицы серебра

AuNP:

Наночастицы золота

DLS:

Динамическое рассеяние света

ICP-MS:

Масс-спектроскопия с индуктивно связанной плазмой

LRs:

Боковые корни

MS:

Мурашиге и Скуг

NMNP:

Наночастицы благородных металлов

НП:

Наночастицы

ТЕМ:

Просвечивающая электронная микроскопия