Биосовместимые этосомальные везикулы с 5-аминолевулиновой кислотой / наночастицами Au для трансдермальной синергетической фотодинамической / фототермической терапии гипертрофических рубцов in vitro

Фон

Гипертрофический рубец (HS), частая и неизбежная проблема после кожных повреждений дермы, имеет гораздо более толстую фиброзную дерму, чем нормальная кожа [1, 2]. Гистопатологически HS показывает увеличение гипертрофических рубцовых фибробластов (HSF), которые расположены в виде волнистых структур, ориентированных на поверхность эпителия и образующих узелковые структуры [3]. Несмотря на то, что клинически доступны различные методы лечения, лечение ГВ сопряжено с множеством проблем из-за многочисленных ограничений. Внутрипочвенная инъекционная терапия широко используется в клинической практике. Однако он ограничен как неудобными операциями, так и побочными эффектами, такими как стойкая гипопигментация и атрофия кожи [4]. Прессотерапия ограничена побочными эффектами, такими как ишемия тканей, а также снижением тканевого метаболизма [5]. Чтобы преодолеть эти ограничения, лазерная терапия служит местным и неинвазивным методом, который был разработан и применяется в лечении ГВ более 25 лет с использованием преимуществ лазерного излучения [6]. Как правило, лазерную терапию можно разделить на фотодинамическую терапию (ФДТ) и фототермическую терапию (ФТТ) на основе разных принципов.

ФДТ использовалась для лечения ГВ, благодаря своей высокой селективности и небольшому количеству побочных эффектов [7]. Его принцип состоит из двух этапов:(а) фотосенсибилизаторы преимущественно агрегируют в HSF и (б) под воздействием соответствующего лазера фотосенсибилизаторы производят цитотоксические активные формы кислорода (ROS), которые приводят к апоптозу HSF [8, 9]. Среди различных фотосенсибилизаторов 5-аминолевулиновая кислота (ALA) оказалась отличным кандидатом для местного лечения в дерматологии без значительных побочных эффектов. Таким образом, ФДТ на основе АЛК (АЛК-ФДТ) широко использовалась при лечении ГВ с разрешения Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США в 2010 г. [10]. Однако его эффективность является спорной из-за двух ограничений:(а) плохая проницаемость ALA как в ткань HS, так и в HSF и (б) низкие квантовые выходы ROS. Для достижения выраженного эффекта в клинике применяют высокие дозы ALA или лазер высокого уровня. К сожалению, высокие дозы ALA приводят к повреждению сальных желез и эпидермиса, а лазер высокого уровня имеет тенденцию вызывать повреждение здоровых тканей. Поэтому большое внимание было уделено повышению проницаемости ALA и квантовых выходов ROS при ФДТ-лечении HS. Недавно было обнаружено, что этосомные везикулы (ES), специально разработанные липосомы, способны преодолевать барьер в HS для местной доставки и достигать значительного прогресса [11, 12]. В нашей предыдущей работе приготовленный ЭС с АЛК (АЛК-ЭС) способен доставлять гораздо больше АЛК в ГВ по сравнению с традиционной системой водно-спиртового раствора [13]. Следовательно, ES может увеличивать проницаемость ALA для повышения эффективности HS при ФДТ. Между тем, новый синергетический метод лечения, сочетающий ФДТ с ЧТВ, обещает повысить как квантовый выход ROS, так и эффективность лечения HS.

PTT также является необычным тераностическим методом лечения различных заболеваний [14, 15]. До сих пор он успешно применялся в клиническом лечении HS [16]. Его механизм развивается, собирая световую энергию, генерируя тепло, а затем приводя к испарению тканей, коагуляции, апоптозу HSF и денатурации коллагена. Тем не менее, PTT имеет серьезные побочные эффекты при лечении HS, такие как мокнутие, изъязвление и дискомфорт от жжения, из-за его плохой селективности в отношении ткани HS с помощью лазера высокого уровня [4]. В последнее время PTT, мостиковые нанотехнологии, был расценен как потенциальное лечение HS с высокой селективностью и минимально инвазивным для фототермического эффекта. И, что более важно, на основе наночастиц Au (AuNP) в качестве эффективных фотоадсорбирующих агентов было подтверждено, что PTT увеличивает квантовые выходы ROS по двум причинам:(a) термическая PDT значительно увеличивает апоптотическую гибель клеток за счет увеличения генерации ROS при температуре -зависимым образом, и [17] (б) AuNPs могут конъюгировать с ALA и увеличивать квантовые выходы ROS из-за локализованного поверхностного плазмонного резонанса (LSPR) [18, 19]. Таким образом, синергетическая фотодинамическая / фототермическая терапия (PDT / PTT) на основе ALA / AuNP обещает преодолеть существующие ограничения как PDT, так и PTT при лечении HS.

В последнее время синергетическая PDT / PTT на основе AuNP широко используется в различных методах лечения рака инъекционным путем [20, 21]. В отличие от рака, HS подходит для местного применения [22]. Однако пучки коллагена в дерме HS представляют собой большие препятствия для проникновения ALA и AuNP, что ограничивает эффективность синергетического лечения PDT / PTT для HS. Следовательно, то, как заставить ALA и AuNPs одновременно проникать в HS, имеет решающее значение для синергизма PDT / PTT с максимальной терапевтической эффективностью и минимальным побочным эффектом [23, 24]. Кроме того, подходящая синергетическая PDT / PTT на основе ALA / AuNP также должна удовлетворять следующим условиям:(a) AuNP могут генерировать тепло с помощью гелий-неонового лазера, который используется в ALA-PDT, и (b) система доставки должна быть высокой. биосовместимый. Однако описанные различные фотосенсибилизаторы / AuNP не могут применяться для местной трансдермальной доставки и лечения HS из-за проницаемости и плохой биосовместимости [25].

В данной работе для синергетической PDT / PTT HS в данной работе разработан ES (A / A-ES), нагруженный ALA / AuNP, с превосходной биосовместимостью и проницаемостью. Биосовместимый A / A-ES готовится как AuNP, так и загруженными ALA ES посредством процесса ультразвуковой обработки без каких-либо токсичных агентов. Приготовленный A / A-ES показывает сильное поглощение в диапазоне 600-650 нм в результате плазмонной связи между соседними AuNP, загруженными вместе с A / A-ES. Это позволяет использовать He-Ne лазер для стимуляции A / A-ES с одновременным генерированием тепла и ROS, которые могут способствовать апоптозу HSF. A / A-ES демонстрирует отличную проницаемость для одновременной доставки ALA и AuNP в HS в исследовании in vitro. Наконец, принимая HSF в качестве мишени, эффективность PDT / PTT для HS in vitro исследуется по накоплению внутриклеточного протопорфирина IX (PpIX), квантовым выходам ROS и апоптозу HSF. Кроме того, проницаемость в HSF также наблюдается с помощью ПЭМ. Благодаря синергетическому эффекту A / A-ES способствует одновременному проникновению как ALA, так и AuNP в HS и HSF, вызывая более высокий уровень апоптоза клеток по сравнению с индивидуальным PTT или PDT. Одним словом, A / A-ES представляет собой многообещающую систему трансдермальной доставки для местного введения ALA и AuNP, имеет большой потенциал в синергетической PDT / PTT HS и открывает новое окно для лечения HS.

Результаты и обсуждения

Характеристика A / A-ES

Ультразвуковая обработка была ключевым параметром при получении A / A-ES по двум причинам:(а) AuNP могли быть сформированы с помощью ультразвуковой обработки без какого-либо токсичного агента, что наделяло A / A-ES биосовместимостью; (б) обработка ультразвуком может перестроить липидные бислои с образованием большего количества пузырьков с небольшими размерами и относительно большими внутренними ядрами, которые могут загружать больше ALA и AuNP. В этой работе AuNPs были сформированы, как описано в следующих схемах:(а) высокореакционные радикалы H • и OH • генерировались внутри пузырьков в результате гомолиза H ₂ O (уравнение 1), (b) окисляющие радикалы H • могут отобрать альфа-H из CH ₃ Канал ₂ ОН и образуют восстанавливающий радикал СН ₂ • Канал ₂ OH (уравнение 2) и (c) во время пиролиза внутри пузырьков радикал CH ₂ • Канал ₂ OH может уменьшить Au ³⁺ для формирования AuNPs (уравнение 3) [26].

Сначала A / A-ES проверяли с помощью UV-Vis (рис. 1а). Он имел сильное поглощение в диапазоне 600–650 нм в результате плазмонного взаимодействия между соседними AuNP в одном и том же A / A-ES [20]. Следовательно, он может использовать лазерное излучение с длиной волны 632 нм для одновременного PDT и PTT для HS. Кроме того, A / A-ES показал относительно узкое распределение по размерам, и средний размер составлял 166 ± 83 нм, согласно анализу DLS на рис. 1b. Интересно, что два распределения по размерам были отнесены к незагруженным AuNP и A / A-ES. Кроме того, большая разница между двумя распределениями предполагает, что количество A / A-ES было намного больше, чем количество незагруженных AuNP. Эффективность PDT зависела от количества ALA, загруженного в A / A-ES. Благодаря использованию метода активной нагрузки трансмембранного градиента pH, ЭЭ ALA составила 20%, что было выше, чем в опубликованных работах (менее 10%) [27]. Морфология A / A-ES также была изучена. На изображениях SEM (рис. 1c) A / A-ES выглядели как интактные сферические пластинчатые пузырьки размером 200 нм, а AuNPs можно было четко наблюдать и загружать в ES. Помимо AuNP, ламели доходили до поверхности AuNP на рис. 1d, что было характерно для ES [28, 29]. Кроме того, подготовленные A / A-ES, загружающие различное количество AuNP, имели аналогичные размеры в Дополнительном файле 1:Рисунок S1. Таким образом, A / A-ES был преобразован в стабильную и деформируемую структуру под действием ультразвука, что позволяет A / A-ES протискиваться через узкое пространство в HS. Подводя итог, можно сказать, что A / A-ES был успешно приготовлен с 20% EE ALA и сильным поглощением при 600-650 нм. Его морфология также очень способствовала бы проницаемости, что согласуется с последующими исследованиями ФДТ / ЧТТ in vitro.

а УФ-видимые спектры ES, ALA и A / A-ES. б Распределение подготовленных A / A-ES по размерам. c , d СЭМ и ПЭМ изображения A / A-ES

Исследование трансдермальной проницаемости in vitro A / A-ES

Сохранение A / A-ES было важным параметром для оценки проницаемости и эффективности лечения A / A-ES. Таким образом, количество удерживаемых как ALA, так и AuNP в HS с разным временем было исследовано с использованием диффузионных ячеек Франца. Как показано на рис. 2а, как ALA, так и AuNP быстро достигли максимального удерживания в первые 2 часа из-за функции увеличения проникновения ES. После достижения максимума удержание как ALA, так и AuNP постоянно снижалось, потому что A / A-ES проникал через всю HS. Результаты показали, что у A / A-ES была достаточная проницаемость. По сравнению с применяемой дозой ALA (2 мг) 48% ALA находилось в ткани HS, что свидетельствует в пользу PDT HS. Кроме того, одинаковые изменения удерживания между ALA и AuNP предполагают, что и ALA, и AuNP загружены в ES, что согласуется с результатами микроскопии. В соответствии с результатом, 2 часа были подходящим временем для местного применения с максимальным удерживаемым количеством A / A-ES. В наших предыдущих работах ЭС рассматривался как высокоэффективный носитель лекарственного средства для усиления проникновения лекарственного средства в ткань ГВ [13]. Таким образом, распределение и действие A / A-ES в HS также было изучено с помощью ПЭМ в этой работе. Как показано на рис. 2b, A / A-ES в виде неповрежденной структуры был обнаружен в дерме, что указывает на то, что A / A-ES может стабильно проникать через эпидермис в дерму HS. В нижней части дермы, показанной на рис. 2c, ES и AuNPs наблюдались как состояние разделения, предполагая, что A / A-ES будет высвобождать как ALA, так и AuNP. Интересно, что AuNPs могут агрегироваться в дерме, даже если они не загружены в ES. Более того, было обнаружено, что больше AuNPs накапливается в дерме на Fig. 2d, что может обеспечивать плазмонную связь между соседними AuNPs для сбора световой энергии и генерации тепла. Вкратце, исследование трансдермальной проницаемости in vitro продемонстрировало, что A / A-ES был высокоэффективным носителем лекарственного средства для усиления проникновения как ALA, так и AuNP в ткань HS, а агрегированные AuNP в дерме способствовали генерированию тепла [20]. Таким образом, A / A-ES продемонстрировал большой потенциал синергетической PDT / PTT для HS.

а сумма удержания ALA и AuNP. б Распределение A / A-ES в ткани HS. c Распределение ES и AuNP в ткани HS. г Накопление AuNP в ткани HS

In Vitro PDT / PTT HSF

Анализ биосовместимости

Хотя биосовместимость AuNPs была хорошо доказана в опубликованных работах, биосовместимость A / A-ES с HSF также должна быть изучена в этой работе [30, 31]. Различные концентрации ALA-ES, Au-ES и A / A-ES (исходя из концентраций ALA от 0,1 до 10 мМ, Au-ES была той же концентрацией AuNP, что и A / A-ES) инкубировали с HSF в течение 12 часов. без облучения. Результат показал отсутствие темновой цитотоксичности в концентрациях не более 2,0 мМ при выживаемости клеток более 90%. Когда концентрации были выше 2,0 мМ, было обнаружено небольшое снижение выживаемости клеток. Результаты показали, что A / A-ES обладают превосходной биосовместимостью, и PDT / PTT следует проводить при концентрации 2,0 Mm в следующих исследованиях (примерно 14% A / A-ES в культуральных средах, v / v .) Рис. 3.

Жизнеспособность клеток HSF после обработки ALA-ES, Au-ES и A / A-ES в темноте в течение 12 ч

PDT / PTT для HSF

A / A-ES может преодолевать барьеры поверхностной проницаемости путем слияния A / A-ES с HSF мембраной и затем высвобождать ALA и AuNPs непосредственно в цитоплазму клетки [32]. Согласно механизму ALA-PDT, ALA, высвобождаемая из A / A-ES, может превращаться в PpIX в цитоплазме HSF. С помощью лазера PpIX продуцировал цитотоксические АФК, что приводило к апоптозу клеток. Таким образом, CLSM был использован для изучения накопления как PpIX, так и ROS на рис. 4 [33, 34]. Перед лазерным облучением красная флуоресценция PpIX в основном распространялась в цитоплазме HSF. PpIX в HSF, обработанном ALA-ES и A / A-ES, были намного больше, чем аутологичный PpIX в HSF, обработанном Au-ES. Более того, без лазерного облучения АФК во всех HSF вряд ли можно было обнаружить, что также было разумным. После лазерного облучения интенсивности PpIX в HSF, обработанном ALA-ES и A / A-ES, были уменьшены, и ROS в этих клетках можно было легко обнаружить с высокой интенсивностью. Между тем, HSF, обработанный Au-ES, не имел ответа в PpIX и ROS, потому что у них не было достаточного количества аутологичного PpIX. Интересно, что A / A-ES может способствовать генерации большего количества ROS, чем ALA-ES, по сравнению с интенсивностью ROS, которая была приписана AuNP. Кроме того, морфология клеток также предоставила дополнительную информацию. HSF, обработанный ALA-ES, имел эвморфизм, в то время как HSF, обработанный Au-ES, демонстрировал нездоровые выступы из плазматической мембраны. Напротив, HSF, обработанный A / A-ES, проявлял как выступающие и втягивающиеся «пузырьки», что было признаком умирающих клеток [35]. Эти различия в генерации ROS и морфологии клеток были приписаны PTT на основе AuNP, что также было исследовано с помощью инфракрасного изображения на рис. 5. Согласно механизму AuNP-PTT, AuNPs в цитоплазме HSF могли поглощать лазер с длиной волны 632 нм и генерировать достаточно тепла. вызвать апоптоз или некроз клеток при облучении. Поэтому фототермические эффекты ALA-ES, Au-ES и A / A-ES контролировались с помощью инфракрасной тепловизионной камеры. По сравнению с ALA-ES, Au-ES и A / A-ES имели явно более высокую температуру (41,3 ° C для Au-ES и A / A-ES, 36,5 ° C для ALA-ES) при облучении. После того, как лазер был удален, все температуры быстро снизились до нормального значения в течение 1 мин, предполагая, что лечение с помощью лазерного излучения могло быть безопасным [36]. Следовательно, AuNPs, загруженные в ES, могут обеспечивать эффективный PTT, который также обеспечивается анализом апоптоза и некроза. Подводя итог, можно сказать, что A / A-ES может увеличить квантовый выход ROS и обеспечить фототермический эффект для достижения превосходной эффективности синергетической обработки PDT / PTT для HSF.

Конфокальные изображения HSF, обработанного ALA-ES, Au-ES и A / A-ES в течение 6 часов с последующим без / с облучением. Масштабная линейка - 100 мкм

. Инфракрасная микроскопия HSF, обработанного ALA-ES, Au-ES и A / A-ES в течение 6 часов под ( a ) и после облучения ( б )

Анализ апоптоза и некроза

Эффективность PDT / PTT дополнительно изучалась с помощью апоптоза и некроза HSF, обработанного ALA-ES, Au-ES и A / A-ES под воздействием лазерного излучения. Анализ апоптоза проводили с использованием анализа проточной цитометрии двойного окрашивания аннексином V-FITC и йодидом пропидия (PI) (фиг. 6). Результаты контроля показали, что лазерное облучение не влияло на жизнеспособность клеток (рис. 6а). Перед облучением ALA-ES, Au-ES и A / A-ES показали хорошую биосовместимость. После облучения HSF, обработанный ALA-ES, Au-ES и A / A-ES, пропорции некроза и апоптоза имели значительные различия. Вкратце, наблюдалась самая высокая фракция как некроза, так и апоптоза HSF, обработанного A / A-ES, что соответствовало результату CLSM. На рис. 6e статистический анализ экспериментов показал, что гибель некротических клеток увеличилась до 61,8% при лечении A / A-ES, что указывает на то, что A / A-ES имеет лучшую синергетическую эффективность PDT / PTT для HSF, чем индивидуальная PDT ( 47,7% некротической гибели клеток) и PTT (24,3% некротической гибели клеток). Интересно, что результат также показал, что PDT играет более эффективную роль в лечении HS по сравнению с PTT, а PTT на основе AuNP может способствовать эффекту PDT. Эти результаты можно объяснить тем, что A / A-ES может увеличивать квантовые выходы ROS и обеспечивать фототермический эффект для достижения превосходной эффективности синергетической обработки PDT / PTT для HSF. Хотя EE ALA в A / A-ES был намного ниже, чем у ALA-ES (20 против 54%), наблюдалась аналогичная некротическая гибель клеток как A / A-ES, так и ALA-ES (61,8 против 78 %). Этот результат можно объяснить тем, что A / A-ES может увеличивать квантовые выходы ROS за счет фототермического эффекта и LSPR AuNP.

Анализ апоптоза HSF, обработанного ALA-ES ( b ), Au-ES ( c ) и A / A-ES без / с лазерным облучением ( d ), а также статистический анализ живого, раннего апоптоза и позднего апоптоза и некроза ( e ). а был контроль. Лазер (-) и (+) означает без / с лазерным облучением

Визуализация A / A-ES в HSF

Подробные изменения морфологии и структуры HSF, вызванные PDT / PTT, также были исследованы как с помощью световой микроскопии, так и с помощью ПЭМ на рис. 7. Перед облучением HSF, обработанный A / A-ES, хорошо для роста, устойчивое прилипание к эвморфизму, что указывает на A / A- ES имел отличную биосовместимость, как и ожидалось (рис. 7a). На их ПЭМ-изображении, помимо различных органелл в нормальной цитоплазме, обработанный HSF имел много агрегатов AuNP в цитоплазме клетки (пустые рамки на фиг. 7c). Это можно объяснить тем, что слияние A / A-ES с клеточными мембранами может доставлять больше AuNP и ALA в HSF. Следовательно, AuNP могут действовать как более эффективный фототермический источник из-за более сильного плазмонного эффекта связи и увеличивать квантовые выходы ROS за счет LSPR. Интересно, что показано в пунктирной рамке на фиг. 7c, некоторые AuNP не попали в HSF из-за экзоцитоза, что еще раз продемонстрировало превосходную биосовместимость A / A-ES. После облучения HSF проявлял свойство отмирающих клеток - выступы из плазматической мембраны (рис. 7б) [37]. Из-за ROS и фототермического эффекта набухание митохондрий и разрыв внешней мембраны, как другие индикаторы смерти HSF, были обнаружены в цитоплазме HSF (рис. 7d) [35]. Кроме того, был обнаружен ES с его характерной мембранной структурой (красные рамки на рис. 7d). Подводя итог, можно сказать, что A / A-ES может способствовать проникновению ALA и AuNP в HSF и разрушать HSF с помощью синергетического PDT / PTT.

Изображения световой микроскопии HSF, обработанного A / A-ES до ( a ) и после облучения ( б ). ПЭМ-изображения HSF, обработанного A / A-ES до ( c ) и после облучения ( d )

Выводы

Биосовместимый A / A-ES был легко приготовлен для синергетической PDT / PTT HS in vitro путем проникновения в HS и разрушения HSF. Используя ультразвуковую обработку, AuNP были синтезированы и загружены одновременно в отсутствие каких-либо токсичных агентов. A / A-ES имел сильное поглощение в диапазоне 600-650 нм как эффект плазмонной связи между соседними AuNP в ES с высоким EE для ALA (около 20%). Исследование трансдермальной проницаемости in vitro продемонстрировало, что A / A-ES является высокоэффективным лекарственным носителем для увеличения проникновения как ALA, так и AuNP в ткань HS . In vitro PDT / PTT для HSF показала, что A / A-ES может увеличивать квантовые выходы ROS за счет фототермического эффекта и LSPR AuNP, вызывая высокий уровень апоптоза или некроза клеток. Одним словом, биосовместимые A / A-ES имели лучшую синергетическую эффективность PDT / PTT для HSF, чем индивидуальные PDT и PTT, обнадеживая перспективу для лечения HS. Дальнейшая работа будет сосредоточена на изучении in vivo синергетической ФДТ / ЧТВ для HS на моделях рубцов, и соответствующая работа продолжается.

Эксперименты и методы

Подготовка A / A-ES

Сто восемьдесят миллиграммов фосфатидилхолина (PC, 95,8% соевого лецитина, Lipoid GmbH, Германия), растворенного в 1,8 мл CH ₃ Канал ₂ ОН, 0,6 мл HAuCl ₄ (10 мМ, Aladdin, Шанхай, Китай) и 3,6 мл буферного раствора ALA-цитрат (CBS, 0,01 M, 12 мг ALA, pH 4,0), в свою очередь, добавляли в раствор ПК по каплям. Смесь перемешивали при 700 об / мин в течение 10 мин для приготовления раствора предшественника. Как показано на схеме 1, раствор предшественника помещали в ультразвуковую среду при 200 Вт на 30 мин, пока он не приобрел ярко-красный цвет. Затем реакционный раствор обрабатывали на центрифуге (8000 об / мин, 20 мин) для удаления остаточного HAuCl ₄ и ПК. Наконец, осаждение повторно диспергировали в 3 мл водно-спиртового раствора ALA (ALA-HA, 2 мг / мл ALA, 30% этанол) и инкубировали методом активной загрузки в трансмембранном градиенте pH в соответствии с нашей предыдущей работой [13]. При инкубации большое количество внешней неионизированной ALA диффундировало через бислои ES во внутреннее кислое водное ядро ​​ES, а затем они протонировались и захватывались в ES. После инкубации был подготовлен A / A-ES. В этой работе ALA-ES был приготовлен в соответствии с нашей предыдущей работой с той же концентрацией ALA, что и A / A-ES. ES (Au-ES), нагруженный AuNP, получали как A / A-ES без ALA с той же концентрацией AuNP, что и A / A-ES.

Принципиальная схема подготовки A / A-ES

Характеристика A / A-ES

A / A-ES отрицательно окрашивали фосфорновольфрамовой кислотой (1,5 мас.%), А затем наблюдали с помощью просвечивающего электронного микроскопа (TEM, JEOL, Япония, ускоряющее напряжение 120 кВ). A / A-ES также исследовали с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM, JEOL, Япония, ускоряющее напряжение 10 кВ). Распределение A / A-ES по размерам определяли с помощью анализа динамического светорассеяния (DLS) в системе контроля NiComp 380ZLS (Nicomp, США). ALA была определена методом дериватизации флуоресцеамина, и детали были показаны в дополнительном файле 1. Эффективность улавливания (EE) ALA, определенная методом ультрафильтрации, была показана в дополнительном файле 1. Наконец, УФ-видимые спектры были сняты на приборе Спектрофотометр Varian Cary 50 UV-Vis (Perkin Elmer, США).

Исследование проницаемости in vitro, проведенное Franz Diffusion Cells

Исследование проницаемости A / A-ES проводилось с использованием диффузионных ячеек Франца с размером 2,8 см ² эффективная площадь проникновения. Рецепторные клетки, включая донорское и рецепторное отделения, поддерживали при 37 ° C с помощью циркулирующей водяной бани. Ткани HS были собраны с информированного согласия в Девятой народной больнице Шанхая и в соответствии с этическими принципами Хельсинкской декларации 1975 года, утвержденными Шанхайской девятой народной больницей. Свежую ткань HS без жировой ткани (менее чем через 24 часа после иссечения) помещали в рецепторный отсек роговым слоем вверх к донорскому отсеку. Один миллилитр A / A-ES был добавлен в донорское отделение, а затем донорское отделение было покрыто парафильмом для предотвращения испарения. После проникновения в разное время ткани HS быстро промывали для удаления остаточных A / A-ES на поверхности HS. Для накопления удерживаемого количества ALA и AuNP в HS ткани HS разрезали на мелкие кусочки, и ALA из тканей HS экстрагировали диализом в PBS в течение 24 часов. Растворы экстрактов анализировали на предмет удерживания ALA в ткани HS. Ткани HS, удерживаемые в диализных мешках, также анализировали на удерживаемое количество AuNP с помощью масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (ICP-MS). После проникновения ALA-ES в течение 2 ч ткань HS промывали, подвергали префиксации, дегидратировали, инфильтрировали и после этого фиксировали. После заделки в эпоксидную смолу их вырезали в виде ультрасрезов (толщиной 50 нм, перпендикулярно эпидермису) и наблюдали с помощью ПЭМ при ускоряющем напряжении 120 кВ.

In Vitro PDT / PTT для HSF

Культура клеток

HSF выделяли и культивировали обычным методом следующим образом:кусочки свежей ткани HS (1 мм ³ , менее чем через 6 ч после иссечения) переваривали с использованием коллагеназы типа I (Invitrogen, США) для получения суспензии отдельных клеток. HSF выращивали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM, Invitrogen, США), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS, Gibco, США) при 37 ° C и 5% CO ₂ . Среду для культивирования следует менять каждые 3 дня, и клетки пассировали при 80% конфлюэнтности. Пройдя две и три клетки использовали в следующих экспериментах.

Анализ биосовместимости

При оценке биосовместимости A / A-ES HSF высевали в 96-луночные планшеты в количестве 2 × 10 ³ ячеек / лунка. Культуральную среду заменяли средой без FBS и свежеприготовленными ALA-ES, Au-ES и A / A-ES в различных концентрациях соответственно. Через 12 часов жизнеспособность клеток измеряли с помощью набора для подсчета клеток 8 (CCK-8, Dojindo, Japan) в соответствии с инструкциями производителя.

Процедура PDT / PTT

HSF высевали в 12-луночные планшеты при 4 × 10 ⁴ ячеек / лунка. Через 12 ч культуральные среды, соответственно, содержащие свежеприготовленные ALA-ES, Au-ES и A / A-ES (14%, v / v ), заменяли средой без FBS на 6 ч. После обработки HSF промывали PBS и инкубировали в культуральной среде в течение 1 часа. Затем они были облучены гелий-неоновым лазером (длина волны 632 нм, 40 мВт / см ² , Shanghai Institute of Laser Technology, China) with 20 min. Then, culture medium was replaced with fresh DMEM containing 10% FBS for another 24 h in preparation for subsequent experiments. Furthermore, HSF treated with A/A-ES and irradiation was prefixed, dehydrated, and embedded to prepare ultrasections for TEM examination.

Intracellular PpIX and ROS Generation Assay

Intracellular PpIX accumulation and ROS generation in HSF were detected by using confocal laser scanning microscopy (CLSM, Leica TCS SP5, Germany). The ROS generation assay was performed using a DCFH-DA and followed the manufacturer’s instructions. The coverslip with cells was mounted on a glass slide and observed at 405 nm excitation/635 nm emission for PpIX and 488 nm excitation/560 nm emission for ROS. All data was analyzed by LAS AF software.

Apoptosis and Necrosis Assay

The apoptosis and necrosis of HSF were analyzed by flow cytometry after double staining Annexin V-FITC and propidium iodide (PI) double staining. The samples were prepared according to the protocol of Annexin V-FITC/PI apoptosis detection kit and then analyzed by BD FACSCalibur (BD Biosciences, Mountain View, USA). The data analysis was performed with FlowJo 7.6 software.

Statistical Analysis

Data were presented as mean ± SD unless otherwise stated. Statistical significance was determined using a two-tailed student’s test (P  < 0.05) unless otherwise stated.

Сокращения

A/A-ES:

5-Aminolevulinic acid/Au nanoparticle-loaded ethosomal vesicle

ALA:

5-Aminolevulinic acid

ALA-ES:

ALA-loaded ES

ALA-PDT:

ALA-based PDT

Au-ES:

AuNP-loaded ES

AuNPs:

Au nanoparticles

CLSM:

Confocal laser scanning microscopy

DLS:

Динамическое рассеяние света

DMEM:

Dulbecco’s Modified Eagle Medium

EE:

Entrapment efficiency

ES:

Ethosomal vesicles

FBS:

Fetal bovine serum

HS:

Hypertrophic scar

HSF:

Hypertrophic scar fibroblasts

ICP-MS:

Inductively coupled plasma-mass spectrometry

LSPR:

Localized surface plasmon resonance

PDT:

Photodynamic therapy

PDT/PTT:

Photodynamic/photothermal therapy

PpIX:

Protoporphyrin IX

PTT:

Photothermal therapy

ROS:

Reactive oxygen species

SEM:

Сканирующая электронная микроскопия

ТЕМ:

Просвечивающий электронный микроскоп