Магнитные поли (N-изопропилакриламид) нанокомпозиты:влияние метода получения на антибактериальные свойства

Фон

Магнитные термочувствительные полимерные нанокомпозиты используются для широкого спектра применений, включая водоподготовку и наномедицину [1,2,3,4]. Каждый нанокомпозит специально разработан с учетом сочетания свойств, присущих обоим компонентам, то есть магнитных частиц и термочувствительных полимеров, что позволяет создать более специфичный и управляемый нанокомпозит. Магнетит (Fe ₃ О ₄ ) наночастицы придают магнитные свойства, которые позволяют быстро и легко разделить их после приложения внешнего магнитного поля [5]. Поли (N-изопропилакриламид) (PNIPAAm) образует трехмерный гидрогель, который при нагревании в вода выше 32 ° C. Покрытие магнитных наночастиц слоем PNIPAAm не только обеспечивает коллоидную стабильность в воде, но также обеспечивает функциональность поверхности за счет связывания с другими молекулами, такими как лекарства, белки или ферменты [7]. Создание двойных чувствительных нанокомпозитов достигается за счет сочетания двух свойств, которые одновременно реагируют на сочетание температуры и магнетизма. Наиболее распространенные методы, используемые для синтеза Fe ₃ О ₄ Нанокомпозиты -PNIPAAm представляют собой физическое добавление, осаждение на месте и эмульсионную полимеризацию. Физическое добавление, самый простой метод, требует физического смешивания ранее синтезированных магнитных наночастиц и частиц PNIPAAm. Второй метод, осаждение in situ, включает осаждение магнитных наночастиц в присутствии нанополимера PNIPAAm [8]. Третий (и наиболее распространенный) путь, эмульсионная полимеризация, требует полимеризации (N-изопропилакриламида) мономера в присутствии магнитных наночастиц [9,10,11]. Fe ₃ О ₄ Нанокомпозиты -PNIPAAm нашли широкое применение в биомедицинских и биотехнологических приложениях. Потребуются высокостабильные, контролируемые и хорошо диспергированные магнитные наночастицы, чтобы повысить пригодность таких нанокомпозитов для будущих применений. Одно недавнее нововведение связано с внешним магнитным полем, которое создает локальный источник тепла для самонагревающихся частиц, вызывая сжатие PNIPAAm и, в свою очередь, позволяя высвобождать инкапсулированные лекарства [12]. Это явление в сочетании с магнитными шариками, нацеленными на опухоли, открывает другие потенциальные методы лечения рака, такие как гипертермия. Гипертермия может быть вызвана колебанием наночастиц в осциллирующем магнитном поле на частотах от килогерц до мегагерц. Другое Fe ₃ О ₄ Нанокомпозиты -PNIPAAm недавно были синтезированы для контроля высвобождения биоактивных молекул, таких как миоглобин или витамин B12, а также для доставки лекарств [13]. Недавнее исследование с использованием суперпарамагнетика Fe ₃ , покрытого PNIPAAm О ₄ наночастицам удалось показать, что термически индуцированная агрегация наночастиц оксида железа значительно увеличивает контраст T2 во время магнитно-резонансной томографии [14]. Ясно, что Fe ₃ О ₄ -PNIPAAm показывает большие перспективы для будущих разработок как в биомедицинских, так и в биотехнологических приложениях. Следовательно, важно провести дальнейшие исследования биосовместимости этого материала и его антибактериального действия.

В этом исследовании мы исследовали влияние трех методов приготовления на физико-химические свойства Fe ₃ . О ₄ -ПНИПААм нанокомпозиты. При этом мы стремимся оценить наиболее удобный метод приготовления для производства нанокомпозитов с улучшенными свойствами для биологических применений. Впервые мы также описываем антибактериальные эффекты трех Fe ₃ О ₄ -PNIPAAm нанокомпозиты с использованием подхода с несколькими конечными точками, скорости роста бактерий, жизнеспособности, морфологии клеток и уровня повреждения ДНК.

Методы

Химические вещества

Гексагидрат хлорида железа (III) (FeCl ₃ .6H ₂ O, ≥ 98%), тетрагидрат хлорида железа (II) (FeCl ₂ .4H ₂ O, ≥ 99%), гидроксид аммония (26% NH ₃ в H ₂ O), N-изопропилакриламид (NiPAM, ≥ 99%), N, N-метиленбис (акриламид) (BIS, ≥ 99%), додецилсульфат натрия (SDS, ≥ 99%) и персульфат аммония (APS, ≥ 98,5 %) были закуплены в свежем виде в Sigma-Aldrich, Германия.

Приготовление PNIPAAm эмульсионной полимеризацией

NiPAM (4 г), BIS (0,2 г) и SDS (0,3 г) растворяли в 350 мл деионизированной воды (DI) при 70 ° C в атмосфере атмосферного азота. APS (0,0035 г) растворяли в 1 мл DI и добавляли в реакционный сосуд для начала реакции. Через 4 ч реакцию останавливали и полученные частицы промывали деионизированной водой. Наконец, наночастицы PNIPAAm были отделены центрифугированием (12000 об / мин в течение 30 минут) и использованы в дальнейших реакциях.

Получение магнетита (Fe ₃ О ₄ ) Наночастицы

FeCl ₂ · 4H ₂ O (1,9 г) и FeCl ₃ · 6H ₂ O (5,4 г) (молярное соотношение 1:2) растворяли в DI (100 мл) и нагревали до 70 ° C. Гидроксид аммония (NH ₄ ОЙ; 6 мл) быстро добавляли к раствору, при этом немедленно образовывался темно-черный магнитный осадок. Наконец, Fe ₃ О ₄ Суспензию наночастиц перемешивали 30 мин при 70 ° C. Продукт несколько раз промывали ДИ, после чего Fe ₃ О ₄ Наночастицы сушили в роторном испарителе (25 мбар при 40 ° C) до образования тонкого порошка. Это использовалось во всех дальнейших реакциях.

Приготовление магнитного нанокомпозита PNIPAAm эмульсионной полимеризацией (Fe ₃ О ₄ -PNIPAAm-1)

NiPAM (0,4 г), свежеприготовленный Fe ₃ О ₄ наночастицы (0,2 г), BIS (0,2 г) и SDS (0,3 г) растворяли в 350 мл DI и нагревали до 70 ° C в атмосфере азота. Затем APS (0,0035 г) растворяли в 1 мл DI и добавляли в реакционный сосуд для начала реакции. Через 4 ч реакцию останавливали и полученный нанокомпозит промывали ДИ. Наконец, Fe ₃ О ₄ -PNIPAAm-1 отделяли центрифугированием (12000 об / мин в течение 30 минут), а затем сушили с использованием роторного испарителя (25 мбар при 40 ° C). Порошкообразный материал хранили в темноте при комнатной температуре.

Приготовление магнитного нанокомпозита PNIPAAm путем осаждения на месте (Fe ₃ О ₄ -PNIPAAm-2)

FeCl ₂ (0,148 г), FeCl ₃ (0,4 г) и 10 мл DI были хорошо перемешаны и добавлены к 1 г PNIPAAm. NH ₄ Затем к раствору быстро добавляли ОН (3 мл), что немедленно приводило к образованию темно-черного магнитного осадка. Затем суспензию перемешивали в течение 30 мин при 70 ° C. Приготовленный нанокомпозит был промыт ДИ, после чего Fe ₃ О ₄ -PNIPAAm-2 отделяли центрифугированием (12000 об / мин в течение 30 минут) и сушили с использованием роторного испарителя (25 мбар при 40 ° C). Полученный порошок хранили в темноте при комнатной температуре.

Приготовление магнитного нанокомпозита PNIPAAm путем физического добавления (Fe ₃ О ₄ -PNIPAAm-3)

Свежеприготовленный PNIPAAm (1 г), свежеприготовленный Fe ₃ О ₄ наночастицы (0,5 г) и DI (5 мл) хорошо перемешивали, и полученную суспензию перемешивали в течение 30 мин при 70 ° C. Полученный таким образом нанокомпозит был промыт ДИ, после чего Fe ₃ О ₄ -PNIPAAm-3 отделяли центрифугированием (12000 об / мин в течение 30 минут) и сушили с использованием роторного испарителя (25 мбар при 40 ° C). Порошкообразный материал хранили в темноте при комнатной температуре.

Характеристика нанокомпозитов

Размер и дзета-потенциал Fe ₃ О ₄ Нанокомпозиты -PNIPAAm измеряли после полного растворения наночастиц в DI (диспергирование в DI с последующей обработкой ультразвуком в течение 2 минут при комнатной температуре). Измерения дзета-потенциала проводили с использованием анализатора Zetasizer Nano (Malvern Instruments, США) при pH 7. Устройство Zetasizer Nano для динамического светорассеяния (DLS) использовали для измерения гидродинамического диаметра агрегатов частиц в DI. Термогравиметрический анализ (ТГА) был проведен для того, чтобы количественно оценить количество покрытия и определить термическую стабильность нанокомпозита. Термические исследования проводили на 3–4 мг сухого образца при температуре от 25 до 900 ° C с использованием TGA Q500 (TA Instruments, США) в атмосфере азота (скорость нагрева 10 ° C / мин). Магнитные свойства материала измеряли с помощью вибрационного магнитометра MicroMag ™ 2900 (Princeton Measurement Corporation, США). Микроскопические изображения получали с использованием сканирующего электронного микроскопа (SEM), частицы сначала тщательно растворяли в DI, а каплю раствора помещали на медную сетку автоэмиссионного SEM Zeiss ULTRA Plus, снабженного катодом Шоттки. Все изображения были проанализированы с использованием программного обеспечения Smart SEM v 5.05 (Zeiss, Германия) для визуализации при 1,5 кВ.

Бактериальные штаммы и среды

Грамотрицательные Escherichia coli CCM3954 и грамположительные Staphylococcus aureus CCM 3953 (Брно, Чехия) использовали для всех экспериментов. Подробная информация о штаммах представлена ​​на веб-странице «Чешской коллекции микроорганизмов» (http://www.sci.muni.cz/ccm/). Каждая бактериальная культура была свежеприготовленной и выдерживалась в течение ночи в питательном соевом бульоне (Sigma-Aldrich) перед проведением биологических экспериментов.

Повреждение ДНК

Анализы комет выполняли в соответствии с методологией Singh et al. [15] и Solanky et al. [16]. Все химические вещества были приобретены в компании PENTA (Чешская Республика), если не указано иное. Свежая бактериальная культура (до 10 ⁷ клеток / мл) выращивали в течение ночи, а затем инкубировали с двумя концентрациями (0,1 и 1 г / л) PNIPAAm и каждым из Fe ₃ О ₄ Нанокомпозиты -ПНИПААм в течение 30 мин при 37 ° С.

Микрогель готовили, нанося 100 мл агарозы на матовую поверхность предметного стекла и накрыв ее покровным стеклом размером 24 × 50 мм (ThermoFisher Scientific, США). Предметные стекла оставляли при комнатной температуре на 5 мин, затем покровные стекла снимали и предметным стеклам давали высохнуть. Этот высушенный слой агарозы (первый слой) обеспечивал прочную основу для последующих слоев. После воздействия на бактерии PNIPAAm и Fe ₃ О ₄ Нанокомпозиты -PNIPAAm в течение 30 мин, 2 мкл (содержащих приблизительно 10000 экспонированных клеток) были взяты и смешаны со 100 мкл свежеприготовленной 0,5% агарозы. Эту смесь наносили пипеткой на матовые предметные стекла и сразу же закрывали покровным стеклом (второй слой). Затем предметные стекла охлаждали на стальном поддоне над льдом. Покровные стекла удаляли через 1 минуту и ​​третий слой из 100 мкл лизирующей агарозы (включая 0,5% агарозы с 5 мкг / мл РНКазы A [Ameresco, США], 0,25% N-лауроилсаркозина натрия и 0,5 мг / мл лизоцима). был произведен, опять же с использованием покровного стекла. Затем слайды оставляли на льду на 10 минут, затем помещали во влажную камеру на 30 минут при 37 ° C. После удаления покровного стекла слайды погружали в лизирующий раствор, содержащий 2,5 М NaCl, 100 мМ тетранатриевой соли ЭДТА, 10 мМ трис-буфер с pH 10, 1% лауроилсаркозин натрия и 1% тритон X-100. После 1 ч лизиса при комнатной температуре слайды переносили в раствор для ферментативного расщепления, содержащий 2,5 М NaCl, 10 мМ ЭДТА и 10 мМ трис, pH 7. Четыре буфера с 1 мг / мл протеиназы К. Затем слайды помещали в раствор. инкубировали при 37 ° C в течение 2 часов, после чего их помещали на горизонтальную пластину электрофоретической установки (Scie-Plas, Великобритания) и уравновешивали 300 мМ ацетата натрия и 100 мМ трис-буфера pH 9 в течение 20 минут, затем подвергали электрофорезу при 12 В (0,4 В / см, примерно 100 мА) в течение 30 мин. После электрофореза слайды погружали в 1 М ацетат аммония в этаноле (5 мл 10 М ацетата аммония и 45 мл абсолютного этанола) на 20 мин, абсолютный этанол на 0,5 ч и 70% этанол на 10 мин, после чего слайды сушили на воздухе при комнатной температуре. Для достижения равномерного окрашивания предметные стекла предварительно обрабатывали 50 мл свежеприготовленного раствора 5% буфера ТЕ и 10 мМ NaH ₂ ЗП ₄ . Затем слайды окрашивали 50 мкл свежеприготовленного 1 мМ раствора красителя SYBR (Sigma-Aldrich, США) в буфере ТЕ в течение 30 мин. Миграцию разрывов цепей ДНК (комет) визуализировали с помощью флуоресцентного микроскопа AxioImager при увеличении × 400 и программного обеспечения AxioVision v 4 (Zeiss, Германия). Обычно длина хвоста 50 комет измерялась индивидуально для каждого образца.

Скорость роста бактерий, жизнеспособность и морфология клеток

Протокол эксперимента соответствовал протоколу, описанному в Darwish et al. [17]. Вкратце, Fe ₃ О ₄ Исходную суспензию нанокомпозита -PNIPAAm (10 г / л) добавляли к свежей бактериальной культуре для получения конечных концентраций 0,01, 0,05, 0,5 и 1 г / л. Каждую концентрацию производили в трех экземплярах в 24-луночном планшете. Отрицательный контроль, состоящий только из бактериальных клеток в питательной среде и Fe ₃ О ₄ Нанокомпозит -PNIPAAm только в питательной среде, запускали параллельно. Затем планшет инкубировали при 37 ° C, после чего оптическую плотность образца измеряли при 600 нм (OD600) каждые 2 часа в течение 6 часов с использованием планшет-ридера Synergy ™ HTX (Biotek, США). Скорость роста бактерий определяли как линейную регрессию R измерения OD600 (единицы оптической плотности, AU) в зависимости от времени инкубации в часах. Предварительные измерения образцов нанокомпозитов без клеток (6 часов при 600 нм) показали постоянные значения оптической плотности, которые не влияли на значения оптической плотности нанокомпозитов, измеренные на бактериальных клетках.

Эффективная концентрация нанокомпозита при 10% ингибировании (EC10) скорости роста бактерий ( µ ) рассчитывали для каждой формы Fe ₃ О ₄ -PNIPAAm на основе уравнения: I (%) =( µ _C - µ _Т ) / µ _C × 100, где I это торможение, µ _C - среднее значение скорости роста в контроле, а µ _Т - скорость роста культуры под воздействием нанокомпозита [18].

После 24-часовой инкубации аликвоты по 100 мкл каждого образца окрашивали с помощью набора L7007 Bacterial Viability Kit (Molecular Probes, Invitrogen, США) в темноте в течение 15 минут. Определение доли живых (Ex / Em 485/528 нм) и мертвых клеток (Ex / Em 485/645 нм) выполняли с использованием планшет-ридера Synergy ™ HTX (Biotek, США). Процент мертвых клеток рассчитывали как отношение мертвых клеток к живым. В то же время изображения Э. coli и С. золотистый были получены с помощью флуоресцентного микроскопа AxioImager (Zeiss, Германия) с Ex / Em 470 / 490–700 нм. Длина E. coli ячеек и площади S. золотистый кластеры клеток определяли при увеличении × 600 с использованием программного обеспечения AxioVision v 4 (Zeiss, Германия).

Статистический анализ

Различия между бактериальными штаммами, инкубированными в PNIPAAm, с различным Fe ₃ О ₄ Нанокомпозиты -PNIPAAm и контрольные образцы без нанокомпозитов были протестированы с использованием ANOVA и теста Даннета (GraphPad PRISM, США).

Результаты

В данном исследовании мы синтезировали Fe ₃ О ₄ Нанокомпозит -PNIPAAm, использующий три различных протокола:эмульсионная полимеризация (Fe ₃ О ₄ -PNIPAAm-1), осаждение на месте (Fe ₃ О ₄ -PNIPAAm-2) и физическое добавление (Fe ₃ О ₄ -ПНИПААм-3). СЭМ-изображения показали, что тип используемого протокола оказывает явное влияние на морфологию образца и размер частиц с Fe ₃ О ₄ -ПНИПААм-1, Fe ₃ О ₄ -ПНИПААм-2 и Fe ₃ О ₄ -PNIPAAm-3 демонстрирует широкое распределение по размерам, агломерацию из-за высокой поверхностной энергии между наночастицами и наличие магнитных диполярных взаимодействий ( Рис. 1 ) .

Изображения и гистограммы PNIPAAm, полученные с помощью сканирующего электронного микроскопа ( a ), Fe ₃ О ₄ -PNIPAAm-1 ( b ), Fe ₃ О ₄ -PNIPAAm-2 ( c ) и Fe ₃ О ₄ -PNIPAAm-3 ( d ). Масштабная шкала =200 нм

ТГА показало, что Fe ₃ О ₄ Образцы -PNIPAAm стали относительно стабильными при температурах выше 400 ° C (рис. 2). В целом наночастицы PNIPAAm показали более низкое остаточное содержание, чем Fe ₃ О ₄ -ПНИПААм нанокомпозиты. Значения дзета-потенциала для поверхностного заряда составляли - 1,58 мВ для PNIPAAm, - 15,6 мВ для Fe ₃ . О ₄ -PNIPAAm-1, - 16,4 мВ для Fe ₃ О ₄ -PNIPAAm-2 и - 1,8 мВ для Fe ₃ О ₄ -ПНИПААм-3. Значения магнитометра с вибрирующим образцом для насыщения намагниченности составляли 50,4 ЭМЕ / г для Fe ₃ О ₄ -PNIPAAm-1, 53,7 emu / г для Fe ₃ О ₄ -PNIPAAm-2 и 21,0 emu / г для Fe ₃ О ₄ -ПНИПААм-3. Динамическое рассеяние света выше (45 ° C) и ниже (25 ° C) LCST показало гидродинамический размер PNIPAAm 50 нм при 25 ° C и 27 нм при 45 ° C; 412 нм при 25 ° C и 197 нм при 45 ° C для Fe ₃ О ₄ -ПНИПААм-1; 212 нм при 25 ° C и 130 нм при 45 ° C для Fe ₃ О ₄ -PNIPAAm-2 и 122 нм при 25 ° C и 60 нм при 45 ° C для Fe ₃ О ₄ -ПНИПААм-3 (рис. 3).

Термогравиметрический анализ PNIPAAm (a), Fe ₃ О ₄ -ПНИПААм-1 (б), Fe ₃ О ₄ -PNIPAAm-2 (c) и Fe ₃ О ₄ -ПНИПААм-3 (д)

Динамическое рассеяние света ниже (25 ° C) и выше (45 ° C) нижнего критического значения температуры раствора, фазового перехода для PNIPAAm ( a ), Fe ₃ О ₄ -PNIPAAm-1 ( b ), Fe ₃ О ₄ -PNIPAAm-2 ( c ) и Fe ₃ О ₄ -PNIPAAm-3 ( d )

Fe ₃ О ₄ -ПНИПААМ Нанокомпозитный эффект на бактериальную ДНК

После короткого воздействия в течение 30 минут разрывы цепи ДНК были определены для обоих E. coli и С. золотистый в клетках, обработанных Fe ₃ О ₄ Нанокомпозиты -PNIPAAm, 40% EtOH (положительный контроль) и необработанные клетки (отрицательный контроль). Все Fe ₃ О ₄ Нанокомпозиты -PNIPAAm показали столь же значительный эффект ( P <0,001) на среднем E. coli и С. золотистый Длина хвоста кометы при всех концентрациях (рис. 4) по сравнению с контрольными клетками, инкубированными без нанокомпозитов.

Пример кишечной палочки хвост кометы , после обработки Fe ₃ О ₄ -PNIPAAm-3 ( а ). Результаты разрывов цепи ДНК (длина кометного хвоста) для Escherichia coli ( б ) и золотистый стафилококк ( c ) инкубировали в течение 30 мин с 40% EtOH (положительный контроль), без нанокомпозитов (отрицательный контроль), PNIPAAm (0,1 и 1 г / л) и (1) Fe ₃ О ₄ -ПНИПААм-1, (2) Fe ₃ О ₄ -PNIPAAm-2 и (3) Fe ₃ О ₄ -PNIPAAm-3 (полосы ошибок представляют стандартное отклонение для длины кометы в 50 ячеек). Уровень значимости *** P <0,001

Fe ₃ О ₄ -ПНИПААМ Нанокомпозит с антибактериальным действием

Темпы роста показали, что грамположительные S. золотистый был менее устойчив, чем грамотрицательный E. coli ко всем нанокомпозитам после 6-часовой выдержки. Fe ₃ О ₄ -PNIPAAm-1 и Fe ₃ О ₄ -PNIPAAm-2 сильно ингибирует рост бактерий по сравнению с PNIPAAm и Fe ₃ О ₄ -ПНИПААм-3, с Э. coli скорость роста значительно снизилась с 0,08 до 0,028 ( P <0,001) с Fe ₃ О ₄ -PNIPAAm-2 и 0,005 ( P <0,001) с Fe ₃ О ₄ -ПНИПААм-1 (1 г / л). Никакого эффекта не наблюдалось на E. coli скорость роста либо PNIPAAm, либо Fe ₃ О ₄ -ПНИПААм-3 (рис. 5а). Для сравнения, скорость роста S. золотистый был затронут все Fe ₃ О ₄ Нанокомпозиты -PNIPAAm и наночастицы PNIPAAm. При более низких концентрациях (0,01 г / л и 0,05 г / л) скорость роста лишь незначительно снизилась с 0,07 до 0,06 ( P <0,05). Однако при более высоких концентрациях (0,5 и 1 г / л) наблюдалось значительное снижение с 0,07 до 0,001 с PNIPAAm, 0,0 с Fe ₃ О ₄ -ПНИПААм-1, 0,01 с Fe ₃ О ₄ -PNIPAAm-2 и 0,009 с Fe ₃ О ₄ -PNIPAAm-3 (все P <0,001; Рис. 5б). Кроме того, EC10 для всех Fe ₃ О ₄ -PNIPAAm нанокомпозитов и контроль наночастиц PNIPAAm был ниже для S. золотистый чем для E. coli (Таблица 1).

Относительная скорость роста Escherichia coli ( а ) и золотистый стафилококк ( б ) после 6-часовой инкубации в различных концентрациях (0,01, 0,05, 0,5 и 1 г / л) PNIPAAm (красные кружки), Fe ₃ О ₄ -ПНИПААм-1 (оранжевые ромбы [1]), Fe ₃ О ₄ -ПНИПААм-2 (зеленые треугольники [2]) и Fe ₃ О ₄ -ПНИПААм-3 (синие треугольники [3]). Планки ошибок показывают стандартное отклонение, рассчитанное из n =3. Уровень значимости *** P <0,001

Процент погибших E. coli клетки увеличивались с увеличением концентрации Fe ₃ О ₄ Нанокомпозит -ПНИПААм через 24 ч. PNIPAAm (0,5 и 1 г / л), например, вызывал значительное увеличение E. coli мертвые клетки (20%) по сравнению с культурами без Fe ₃ О ₄ -Нанокомпозит -ПНИПААм (12%). Fe ₃ О ₄ -PNIPAAm-1 (0,5 г / л) приводил к до 28% погибших E. coli клеток и 32% при 1 г / л ( P <0,001). Эффект Fe ₃ О ₄ -PNIPAAm-2 был ниже, чем у Fe ₃ О ₄ -PNIPAAm-1 и Fe ₃ О ₄ -PNIPAAm-3, при этом процент мертвых клеток увеличивается с 13 до 25% при воздействии концентраций 0,01 и 1 г / л соответственно ( P <0,001). Как при 0,5, так и при 1 г / л Fe ₃ О ₄ -PNIPAAm-3 привел к примерно 25% мертвых клеток ( P <0,001; Рис. 6а). Процент погибших S. золотистый на клетки существенно повлиял только 1 г / л Fe ₃ О ₄ -PNIPAAm-1 и Fe ₃ О ₄ -PNIPAAm-3, количество мертвых клеток достигает 50 и 48% соответственно ( P <0,001). Контроль без нанокомпозитов содержал приблизительно 18% мертвых клеток, тогда как при более низких концентрациях PNIPAAm, Fe ₃ О ₄ -PNIPAAm-1 и Fe ₃ О ₄ -PNIPAAm-3, доля мертвых клеток была еще ниже. PNIPAAm при концентрациях 0,5 и 1 г / л приводил к 25 и 30% ( P <0,005) мертвых клеток соответственно. Fe ₃ О ₄ -PNIPAAm-2 не влиял на S. золотистый культур (рис. 6б).

Процент мертвых кишечной палочки ( а ) и золотистый стафилококк ( б ) клетки после 24-часового воздействия PNIPAAm и (1) Fe ₃ О ₄ -ПНИПААм-1, (2) Fe ₃ О ₄ -PNIPAAm-2 и (3) Fe ₃ О ₄ -ПНИПААм-3. Планки погрешностей показывают стандартное отклонение n =3. Уровни значимости * P <0,05, ** P <0,005, *** P <0,001

Не было разницы в среднем E. coli длина клетки (5 мкм) и средний S. золотистый площадь кластера клеток (200 мкм ² ) для любого нанокомпозита или контроля PNIPAAm при самых низких концентрациях (0,1 г / л; рис. 7). При более высоких концентрациях E. coli длина не изменилась в присутствии Fe ₃ О ₄ -PNIPAAm-2, а также S. золотистый площадь группы ячеек в присутствии Fe ₃ О ₄ -ПНИПААм-1. Однако Э. coli длина была значительно увеличена в присутствии 1 г / л PNIPAAm (5,4 мкм, P <0,005), Fe ₃ О ₄ -ПНИПААм-1 (6 мкм, P <0,001) и Fe ₃ О ₄ -ПНИПААм-3 (10 мкм, P <0,001) (рис. 7а), а S. золотистый образует более крупные кластеры при воздействии PNIPAAm (1937 мкм ² , P <0,001), Fe ₃ О ₄ -ПНИПААм-2 (924 мкм ² , P <0,001) и Fe ₃ О ₄ -ПНИПААм-3 (1722 мкм ² , P <0,001) (рис. 7b).

Длина кишечной палочки ячейки ( а ) и области скопления Staphylococcus aureus ячейки ( b ) после 24-часовой инкубации с PNIPAAm и (1) Fe ₃ О ₄ -ПНИПААм-1, (2) Fe ₃ О ₄ -PNIPAAm-2 и (3) Fe ₃ О ₄ -ПНИПААм-3. Планки погрешностей показывают стандартное отклонение, определенное из n =50. Уровни значимости ** P <0,05 и *** P <0,001

Обсуждение

Как метод синтеза, так и средства, с помощью которых магнитные наночастицы были добавлены в полимерную матрицу, оказали явное влияние на внутренние физико-химические свойства магнитного Fe ₃ О ₄ -ПНИПААм нанокомпозиты. Поэтапный синтез оказал сильное влияние на свойства нанокомпозита, что привело к изменению формы частиц, гранулометрического состава, размера и химического состава поверхности, а также к последующим изменениям магнитных свойств [19, 20]. Эмульсионная полимеризация (Fe ₃ О ₄ -PNIPAAm-1), простой и точный метод, позволил получить стабильные нанокомпозиты с узким гранулометрическим составом и самой низкой склонностью к агрегации, качества, особенно важные для биомедицинских приложений [17]. Полученные в результате как стерического, так и кулоновского отталкивания, частицы были достаточно малы, чтобы избежать преципитации [21]. Наименее эффективным методом было физическое добавление (Fe ₃ О ₄ -ПНИПААм-3). Мало того, что он был произведен в три отдельных этапа и, следовательно, требовал больше времени для приготовления, полученный нанокомпозит показал более высокую агрегацию, чем любой из двух других методов производства. Более того, наши результаты показали, что Fe ₃ О ₄ -PNIPAAm-3, полученный таким образом, мог содержать нежелательные PNIPAAm и Fe ₃ О ₄ остатки наночастиц.

Полимеры могут присоединяться к магнитным наночастицам либо физическими (нековалентными), либо ковалентными связями, в результате чего полученный гибридный материал проявляет определенные свойства в зависимости от выбранного пути синтеза. Значительное ресуспендирование магнитных наночастиц происходит, когда приготовление происходит в растворителе, в котором происходит образование гибридных наночастиц, вследствие чего агрегация и сегрегация могут стать проблемой. В этом случае формирование магнитных наночастиц in situ во многих случаях может быть лучшей альтернативой. Кроме того, если концентрация поверхностно-активного вещества слишком низкая, коалесценция изменит размер капель, тогда как при слишком высокой концентрации могут образоваться мицеллы, что приведет к зародышеобразованию мицелл. В этом отношении важно тщательно выбирать концентрацию поверхностно-активного вещества на основе точных характеристик свойств поверхности и степени модификации частиц, чтобы гарантировать, что поверхность неорганических частиц совместима с полимерной матрицей.

Для оценки магнитных свойств Fe ₃ О ₄ -ПНИПААм, важно знать содержание МНЧ в нанокомпозите. ТГА использовали для количественного определения количества МНЧ и исследования термической стабильности Fe ₃ О ₄ Нанокомпозиты -PNIPAAm по сравнению с наночастицами только PNIPAAm. Все три Fe ₃ О ₄ -Нанокомпозиты -PNIPAAm показали более высокую термическую стабильность, чем наночастицы PNIPAAm, предположительно из-за присутствия Fe ₃ О ₄ частицы в матрице (рис. 2). Более высокие остатки в магнитных нанокомпозитах можно объяснить присутствием неорганического Fe ₃ О ₄ соединений в образцах, выдержанных даже при более высоких температурах.

Fe ₃ О ₄ -PNIPAAm-1 показал самую высокую термическую стабильность нанокомпозита, наряду с самой низкой потерей веса. До 200 ° C основным источником потери веса была потеря воды и физическая адсорбция полимерного слоя [22]; однако при температуре выше 200 ° C потери в основном связаны с разложением химического слоя, связывающего PNIPAAm. Остаток образца, который стал стабильным при температуре выше 400 ° C, составлял 87% от исходного веса, что соответствует количеству магнитных наночастиц в нанокомпозите. Одной из целей этого процесса приготовления было создание нанокомпозита с магнитными свойствами, предотвращающими агрегацию и позволяющими ему быстро повторно диспергироваться, как только магнитное поле отключается. Such properties would allow its use in a range of different fields, including hyperthermic treatment of tumours, as contrasting agents in magnetic resonance imaging, in tissue repair, biomedical device coating, immunoassay, cell separation and biomagnetic separation of biomolecules [18, 23,24,25,26]. We tested our nanomaterials through magnetisation saturation, which assesses the maximum possible magnetisation of the substance beyond which no further change takes place despite an increase in the magnetic field. Our results showed Fe₃ О ₄ -PNIPAAm-2 to have the highest magnetisation saturation level of the three nanocomposites tested. Our values were lower (53.7 emu/g) than those previously reported for uncoated Fe₃ О ₄ nanoparticles (92 emu/g) [27], however, presumably due to surface order/disorder interactions in the magnetic spin moment and an increase in nanocomposite weight and volume due to the presence of the PNIPAAm polymer layer.

Of special interest as regards biomedical application is the behaviour of polymer-water solutions stable below a LCST [28]. After heating the prepared Fe₃ О ₄ -PNIPAAm nanomaterials above the transition temperature, a coil-to-globule transition occurred, followed by inter-molecular association. All three Fe₃ О ₄ -PNIPAAm nanomaterials displayed very similar behaviour, with all shrinking as temperature increased. PNIPAAm is widely used as a thermoresponsive polymer due to the proximity of its LCST (~ 30–32 °C) to physiological temperature. Furthermore, the thermo-responsibility of PNIPAAm has proved useful for drug release in vivo [28]. Nanoscale magnetic hydrogels based on PNIPAAm have now been developed for theranostic application, with those embedded with low concentrations of Fe₃ О ₄ magnetic nanostructures resulting in an LCST of ~ 40 °C, making Fe₃ О ₄ -PNIPAAm of especial interest for controlled drug release application [29].

SEM nanoparticle histograms displayed a broader size distribution than those using DLS (Fig. 1). Interpretation of DLS data involves the interplay of multiple parameters, however, including the size, concentration, shape, polydispersity and surface properties of the particles. Measurement of the hydrodynamic size of thermoresponsive samples in relation to temperature is a common method of characterising LCST behaviour, with nanoparticles shrinking as temperatures increase, soluble polymers precipitating and particle size increasing. As expected, PNIPAAm had a lower hydrodynamic size than the Fe₃ О ₄ -PNIPAAm nanocomposites. Of the nanocomposites, Fe₃ О ₄ -PNIPAAm-3 displayed the lowest hydrodynamic size and a narrow size distribution. Variability in hydrodynamic size is likely to be due to the presence of Fe₃ О ₄ nanoparticles in the PNIPAM matrix, which increases both the particle dimension and aggregation in water (Fig. 3) [8].

All Fe₃ О ₄ -PNIPAAm nanocomposites displayed antimicrobial properties (Table 2), with both Gram-negative and Gram-positive bacteria negatively affecting E. coli growth rate in the order Fe₃ О ₄ -PNIPAAm-1 > Fe₃ О ₄ -PNIPAAm-2 > Fe₃ О ₄ -PNIPAAm-3 = PNIPAAm and S. золотистый growth rate as Fe₃ О ₄ -PNIPAAm-1 > Fe₃ О ₄ -PNIPAAm-2 > Fe₃ О ₄ -PNIPAAm-3 > PNIPAAm. Similarly, the antibacterial properties desired for medical applications such as biomedical device coatings and wound dressing materials have been confirmed for a number of new PNIPAAm composites, including ZnO-PNIPAAm, Ag-PNIPAAm and chitosan-PNIPAAm [23,24,25,26].

In comparison with the modified Fe₃ О ₄ nanomaterials described in our earlier studies, the PNIPAAm-1, PNIPAAm-2 and PNIPAAm-3 nanocomposites all showed a stronger effect on both E. coli и С. золотистый , with S. золотистый EC10 growth inhibition ranging from 0.04 to 0.06 g/l for the three nanomaterials, while modified APTS-, PEG- and TEOS-MNPs ranged between 0.1 and 0.25 g/l [17], and polymer-coated Fe₃ О ₄ (PEI-mC-, PEI- and OA-MNPs) had a value of 0.15 g/l [18]. Inhibition of bacterial growth could have been caused by several factors, including cell membrane damage, oxidative stress and cell elongation, resulting in the production of lethal cells. The cells could, on the other hand, survive such unfavourable conditions by employing repair enzymes, antioxidants and/or transient growth arrest. This could partly explain the phenomenon that in lower concentrations (0.01 and 0.05 g/l) of PNIPAAm, Fe₃ О ₄ -PNIPAAm-1 and Fe₃ О ₄ -PNIPAAm-3, the proportion of dead cells of S. золотистый was lower after 24-h incubation than in control where no such factor inducing mobilisation of the defence/repair system was present. Higher concentrations of PNIPAAm and nanocomposites caused indeed significant increase in dead cells of E. coli и С. золотистый corresponding well with significant decrease in growth rate of the cell cultures.

Exposure to 1 g/l of the nanocomposite resulted in changes to bacterial cell morphology, with greatest change to E. coli cell length caused by Fe₃ О ₄ -PNIPAAm-3 > Fe₃ О ₄ -PNIPAAm-1 > PNIPAAm > Fe₃ О ₄ -PNIPAAm-2, and Fe₃ О ₄ -PNIPAAm-3 > Fe₃ О ₄ -PNIPAAm-2 > PNIPAAm > Fe₃ О ₄ -PNIPAAm-1 for S. золотистый clustering. This effect was also observed previously when the same bacteria were exposed to different functional magnetic nanoparticles [17]. Elongation of E. coli cells in the presence of nanocomposites is indicative of transient growth arrest and is evidence of an adaptive response to oxidative stress or DNA damage [30]. In the case of S. золотистый , which is a biofilm formation species, the cells became embedded over a larger area than the nanocomposite-free control when exposed to PNIPAAm, Fe₃ О ₄ -PNIPAAm-2 and Fe₃ О ₄ -PNIPAAm-3 (Fig. 8). No S. золотистый biofilm was produced when in contact with Fe₃ О ₄ -PNIPAAm-1, possibly due to its stronger antibacterial properties. S. золотистый usually produces a biofilm in harsh environments to protect the cells [31]; however, this could also have an adverse effect on the bacteria as nanocomposites can integrate through the biofilm and harm the cells, as has already been described for Pseudomonas sp. [32].

S. золотистый cell culture without nanocomposites (a ) and the cells embedded in biofilm after incubation with nanocomposites for 24 h (b ). The scale bar is 10 μm

Iron could lead to DNA damage in bacterial cells as described in previous reviews [33, 34]; hence, we attempted to test whether our MNPs caused DNA damage to bacteria. The presence of Fe₃ О ₄ -PNIPAAm nanocomposites at both low and high concentrations (0.01 or 1 g/l) caused significant damage to E. coli и С. золотистый DNA, even after short exposures (30 min). To the best of our knowledge, this is the first acute genotoxicity study of magnetic composites on bacteria; as a result, we cannot compare our results with those of other authors directly. Previous studies have shown no genotoxicity attributable to PNIPAAm nanoparticles, however, and no decrease in cell viability when tested against two kinds of mammalian cell at nanoparticle concentrations of up to 800 mg/l [30]. On the other hand, previous genotoxicity studies on MNPs (γ-Fe₃ О ₄ ) have shown a negative effect on human fibroblast cells at 100 mg/l [35]. Studies performed with mammalian cell lines, however, cannot be directly compared to studies done with bacterial cells, due to significant differences in eukaryotic and prokaryotic cells.

Выводы

Magnetic poly(N-isopropyl-acrylamide) nanocomposites were prepared through emulsion polymerisation (Fe₃ О ₄ -PNIPAAm-1), in situ precipitation (Fe₃ О ₄ -PNIPAAm-2) and physical addition (Fe₃ О ₄ -PNIPAAm-3). Both Fe₃ О ₄ -PNIPAAm-1 and Fe₃ О ₄ -PNIPAAm-2 showed higher values for surface charge and thermal stability, indicating a stable colloidal system. At room temperature, Fe₃ О ₄ -PNIPAAm-3 displayed highest magnetisation saturation. Presence of Fe₃ О ₄ -PNIPAAm nanocomposites at both low and high concentrations caused significant damage to both E. coli и С. золотистый DNA, even after short exposure, and led to a decrease in cell viability. Overall, we suggest that Fe₃ О ₄ -PNIPAAm-1, prepared through emulsion polymerisation, is the most appropriate method for producing a magnetic nanocomposite with high antimicrobial activity towards Gram-negative E. coli and Gram-positive S. золотистый .

Сокращения

Fe₃ О ₄ -PNIPAAm:

Magnetic poly(N-isopropylacrylamide)

MNPs:

Magnetite nanoparticles