Высокочувствительный электрохимический ДНК-биосенсор из нанокомпозита акрил-золото для определения пола рыб арована

Фон

Азиатская арована ( Scleropages formoss ), пресноводная рыба, [1] широко распространена в сельской местности региона Юго-Восточной Азии, таких как Малайзия, Сингапур, Таиланд, Индонезия, Камбоджа, Вьетнам, Лаос, Мьянма и Филиппины. Кроме того, рыба арована также встречается в Австралии и Новой Гвинее [1,2,3,4]. Он широко известен как рыба-дракон, азиатский костистый язык, келиса или баджу-рантай [5, 6]. Он до сих пор сохранился как примитивный вид рыб юрского периода [7, 8]. Народы Китая и Азии считали его символом удачи и счастья, как и многие другие культуры [6]. Обычно арована в зрелом возрасте имеет вес около 7 кг и длину 1 м [9]. Эта декоративная рыба обладает привлекательной окраской и морфологией и может быть идентифицирована по ее отличительным физическим характеристикам, таким как сравнительно длинный размер тела, большой грудной плавник, а спинной и анальный плавники расположены далеко позади тела. Существует три основных цветовых варианта:золотой, красный и зеленый у близкородственных пресноводных рыб азиатских видов арованы. Есть также несколько других различных видов, происходящих из разных частей Юго-Восточной Азии и являющихся региональными для многих речных систем [8].

Из-за своей высокой популярности и большого спроса в декоративных целях на азиатскую аровану яростно охотились с целью получения прибыли [6], что привело к быстрому сокращению ее популяции. Учитывая высокий спрос в декоративной промышленности, чрезмерную эксплуатацию природных популяций и редкость естественных местообитаний из-за изменений в среде обитания, азиатская арована была классифицирована как находящийся под угрозой исчезновения вид с 1980 года в соответствии с Конвенцией о международной торговле. в «Вымирающие виды дикой фауны и флоры» (СИТЕС) и недавно внесен в Красный список МСОП 2006 г. как находящиеся под угрозой исчезновения [1, 3, 8, 10, 11]. Однако коммерческая торговля этим исчезающим видом запрещена СИТЕС, за исключением некоторых стран, например, Индонезии, Сингапура и Малайзии. [2, 3, 12]. В Азии имеется ряд зарегистрированных в СИТЕС земледельцев, активно занимающихся разведением и продажей арованы [2, 12]. Эта азиатская пресноводная рыба состоит из географически изолированных штаммов, и это единственный представитель вида с разными цветовыми вариациями, основанными на различном географическом распределении по рекам Юго-Восточной Азии. В настоящее время ареал вида стал гораздо более распространенным и простирается до реки Нил в Африке, реки Амазонки в Южной Америке, Австралии и Новой Гвинеи [1, 4, 8].

Среди различных окрасов азиатской арованы красная и золотая рыба арована являются самыми дорогими и популярными декоративными домашними животными в инкубатории по сравнению с разновидностями черного, зеленого, серебристого и других окрасов [1, 5, 10, 13]. Феномен кражи яиц у азиатской арованы нетипичен по сравнению с другими видами рыб. Как правило, рыбы арована созревают в возрасте 3–4 лет и откладывают всего несколько яиц (30–100) [14, 15] очень большого размера (около 1 см в диаметре) [16]. Интересно, что оплодотворенные яйца и личинки затем защищаются и выращиваются во рту самцов рыб арована, и они проявляют высокую родительскую заботу. Определить пол на основе визуального наблюдения за младенцем арованой сложно, потому что нет четкого фенотипического органа полового диморфизма [14, 15]. Только один из родителей (предположительно самец) может быть идентифицирован, поскольку потомство извлекается из его рта. Другой родитель не может быть идентифицирован среди ряда потенциальных родителей [16].

Обычно любители держат маленьких рыбок арована для декоративных целей в аквариуме, а также для выращивания на рыбоводной ферме. Однако все виды мальков арованы продаются по одинаковой цене из-за отсутствия вспомогательных технологий для дифференциации по полу и цвету. До настоящего времени не существует опубликованных методов определения пола и окраски аровановых рыб на стадии молоди. Вместо этого были проведены сотни исследований с использованием анализа ДНК, основанного на генетической структуре и биографии рыб арована, в попытке определить пол и цвет в их раннем возрасте. Традиционный метод, основанный на оценке размеров тела и полости рта, может быть выполнен только в возрасте около 3 месяцев младенческой арованы для определения пола и цвета кожи [17]. Однако этот традиционный метод визуального осмотра требует много времени и часто дает неточный результат. С другой стороны, широко используемые стандартные методы, основанные на секвенировании ДНК, то есть полимеразная цепная реакция (ПЦР) и гель-электрофорез, требуют труда, времени и ресурсов. Альтернативный алгоритм решения изобретательских задач (АРИЗ) ранее использовался для определения пола арованы [18]. АРИЗ - это альтернативный инструмент для определения пола, состоящий из девяти различных частей и в общей сложности 40 сложных шагов. Это требует очень долгого времени для обучения и практики, а также требует для работы высококвалифицированного персонала. Например, применялось применение АРИЗ в различных инженерных системах, но в большинстве случаев не учитывались все требования и процессы АРИЗ.

В этом исследовании микросферы из акрилового полимера, модифицированные сукцинимидными функциональными группами через N-акрилоксисукцинимидные (NAS) фрагменты, использовались в качестве матрицы для иммобилизации ДНК-зонда. Как ранее сообщалось Chen and Chiu 2000 и Chaix et al. 2003 [19, 20], сукцинимидная функциональная группа может реагировать с аминогруппами с образованием ковалентной связи. Включение функциональности NAS в акриловые микросферы для применения в ДНК-микробиосенсоре обеспечивает преимущества простого метода подготовки, при котором сферы могут быть синтезированы и функционализированы с помощью одностадийной процедуры с использованием фотополимеризации за короткий промежуток времени (несколько минут). Кроме того, микросферы обладают преимуществом небольшого размера и обеспечивают большую площадь поверхности для иммобилизации ДНК-зонда, тем самым снижая барьер для диффузии реагентов и продуктов. Это позволяет улучшить характеристики биосенсора с точки зрения более короткого времени отклика и более широкого линейного диапазона отклика, что будет продемонстрировано в работе, представленной здесь.

В этом исследовании предлагается метод электрохимического ДНК-биосенсора, который является высокочувствительным, простым, легким в изготовлении и низкой стоимостью, для определения пола молоди рыбы арованы с высокой точностью. Биосенсор ДНК был построен из угольного электрода с трафаретной печатью (SPE), модифицированного наночастицами коллоидного золота (AuNP) и полиакрилатных микросфер, функционализированных функциональной группой NAS. AuNP были иммобилизованы на поверхности углеродного SPE посредством электростатистического взаимодействия и играли важную роль в повышении проводимости электрода и облегчении переноса электронов, в то время как акриловые микросферы (AcMP) были непосредственно нанесены на SPE, модифицированный AuNP, посредством физической адсорбции. Аминированный ДНК-зонд арованы затем ковалентно присоединяли к иммобилизованному композиту AcMP-AuNP на экспонированной сукцинимидной группе AcMP. Гибридизацию зонд-мишень выявляли с помощью окислительно-восстановительной метки антрахинона с помощью дифференциальной импульсной вольтамперометрии (DPV). Включение AcMP небольшого и однородного размера позволило удерживать большую нагрузочную способность ДНК и повысить чувствительность и предел обнаружения электрохимического биосенсора ДНК арованы.

Методы

Аппарат и электроды

Все электрохимические измерения были выполнены с DPV с использованием потенциостата / гальваностата Autolab PGSTAT 12 (Metrohm) при ступенчатом потенциале 0,02 В в диапазоне потенциалов от -1,0 В до -0,1 В. В качестве рабочий электрод. Платиновый (Pt) электрод в форме стержня и электрод Ag / AgCl, заполненный 3,0 М внутреннего раствора KCl, использовали в качестве вспомогательного и контрольного электродов соответственно. Для приготовления гомогенных растворов использовалась ультразвуковая ванна Elma S30H.

Химические вещества

2–2-Диметокси-2-фенилацетофенон (DMPP) был приобретен у Fluka. 1,6-гександиолдиакрилат (HDDA), н-бутилакрилат (nBA) и тригидрат хлорида Au (III) были поставлены Sigma-Aldrich. Коллоидные AuNP были синтезированы в соответствии с методом, описанным Grabar et al. (1995). Додецилсульфат натрия (SDS) и NaCl были получены от Systerm. NAS и натриевая соль моногидрата антрахинон-2-сульфоновой кислоты (AQMS) были закуплены у Acros. Вода Milli-Q (18 мОм) использовалась для приготовления всех химических и биологических растворов. Исходный раствор ДНК-зонда разбавляли 0,05 М K-фосфатного буфера (pH 7,0), в то время как растворы комплементарной ДНК (кДНК) и некомплементарной (нкДНК) готовили с 0,05 M Na-фосфатным буфером при pH 7,0, содержащим 1,0 мМ AQMS. K-фосфатный буфер способствует максимальной иммобилизации ДНК-зонда на акриловом материале, функционализированном сукцинимидом, тогда как Na-фосфатный буфер обеспечивает оптимальные условия для реакции гибридизации ДНК [21, 22].

Синтез акриловой микросферы

АкМФ получали по методикам, описанным ранее, с небольшими модификациями [22]. Вкратце, смесь 450 мкл HDDA, 0,01 г SDS, 0,1 г DMPP, 7 мл мономера nBA и 6 мг NAS растворяли в 15 мл воды Milli-Q и обрабатывали ультразвуком при комнатной температуре (25 ° C. ) в течение 10 мин. После этого раствор эмульсии фотоотверждался УФ-светом в течение 600 с в непрерывном потоке N ₂ . газ. Затем полученные микросферы поли (nBA-NAS) собирали центрифугированием при 4000 об / мин в течение 30 минут с последующей промывкой в ​​K-фосфатном буфере (0,05 M, pH 7,0) три раза и оставляли сушиться при температуре окружающей среды.

Изготовление ДНК-биосенсора с использованием акриловых микросфер

Перед модификацией поверхности углеродный ТФЭ тщательно промывали деионизированной водой, покрывали по каплям микросферами акрилового полимера при концентрации 3 мг / мл и давали высохнуть на воздухе при условиях окружающей среды с последующим литьем по капле с 5 мг / мл коллоидные AuNPs. Электрохимические характеристики углеродного ТПЭ до и после модификации AcMP и AuNP исследовали методом CV. На рис. 1 изображен метод, который состоит из трехэтапного изготовления электрохимического ДНК-биосенсора и одноэтапного обнаружения кДНК арована. Около 10 мкл коллоидных AuNP (1 мг / 300 мкл) сначала наносили на углеродный SPE и сушили на воздухе при 25 ° C. Поскольку AcMP (1 мг) легко суспендировали в этаноле (100 мкл) с образованием стабильной дисперсии, 10 мкл суспензии AcMP наносили по каплям на SPE, модифицированный AuNP. Затем модифицированный AcMP-AuNP углеродный SPE погружали в 300 мкл 5 мкМ раствора ДНК-зонда арована на 6 часов для проведения процесса иммобилизации ДНК и тщательно промывали K-фосфатным буфером (0,05 M, pH 7,0) три раза для удалите несвязанный зонд захвата. Затем иммобилизованный ДНК-зонд погружали в 300 мкл раствора целевой ДНК, содержащего 2 М NaCl и 1 мМ AQMS, чтобы в течение часа происходили реакции гибридизации и интеркаляции ДНК, с последующей последовательной промывкой водой Milli-Q и Na-фосфатом. буфер (0,05 М, pH 7,0) для удаления негибридизованных фрагментов ДНК и специфического связывания электрохимической метки AQMS. Все измерения DPV проводились в 4,5 мл 0,05 М K-фосфатного буфера при pH 7,0 и комнатной температуре.

Методика изготовления электрохимического арованового ДНК-биосенсора на основе электрода, модифицированного AcMP-AuNP

Оптимизация электрохимического ДНК-биосенсора Arowana

ДНК-электроды, модифицированные соответствующим композитом AcMP, AuNP и AcMP-AuNP, использовали в тестировании кДНК (5 мкМ) и нкДНК (5 мкМ) с помощью электроаналитического метода DPV в присутствии 1 мМ AQMS и 2 М NaCl при скорость сканирования 0,5 В / с относительно электрода сравнения Ag / AgCl. Продолжительность иммобилизации ДНК-зонда определяли путем раздельного вымачивания девяти единиц SPE, модифицированных AcMP-AuNP, в 300 мкл 5 мкМ раствора ДНК-зонда арована в течение 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 12 и 18 ч перед реакция с 5 мкМ кДНК в буфере для гибридизации ДНК (0,05 М Na-фосфатного буфера при pH 7,0), содержащем 1 мМ антрахинонового окислительно-восстановительного интеркалятора и 2 М NaCl. Время гибридизации ДНК исследовали путем погружения ДНК-электрода в 300 мкл 5 мкМ раствора кДНК в присутствии 2 М NaCl и 1 мМ AQMS на 10–100 мин. Влияние температуры на продолжительность гибридизации ДНК оценивали путем измерения ответа биосенсора ДНК арованы при 4, 25, 40 и 50 ° C в течение экспериментального периода 5–90 мин в измерительном буфере с использованием метода DPV. Для исследования влияния pH биосенсор ДНК арованы погружали в 5 мкМ раствора кДНК, приготовленного из 0,05 М Na-фосфатного буфера, кондиционированного 2 М NaCl и 1 мМ AQMS между pH 5,5 и pH 8,0, с последующим измерением DPV. Влияние различных положительно заряженных ионов (например, Ca ²⁺ , Na ⁺ , K ⁺ , и Fe ³⁺ ионы) на электрохимический ответ биосенсора арованной ДНК осуществляли путем добавления CaCl ₂ , NaCl, KCl и FeCl ₃ в 0,05 М Na-фосфатного буфера (pH 7,0) перед реакцией гибридизации ДНК и измерением DPV. Ионную силу гибридизационного буфера оптимизировали путем изменения концентраций Na-фосфатного буфера и NaCl от 0,002–0,1000 М до 1,52–5,50 М соответственно. Затем была построена линейная калибровочная кривая биосенсора ДНК арованы путем количественного измерения серии концентраций кДНК от 1,0 × 10 ^-18 до 2,0 × 10 ⁻² мкМ методом DPV. Все эксперименты были выполнены в трех экземплярах.

Извлечение ДНК и анализ ДНК Arowana

Всего 15 образцов тканей рыбы арованы были любезно предоставлены Научно-исследовательским институтом рыболовства (FRI) Департамента рыболовства Малайзии. Все образцы тканей рыб хранили в 70% этаноле в холодильнике при 4 ° C и отправляли в лабораторию. Образцы тканей рыб промывали водой Milli-Q, разрезали на мелкие кусочки и сушили в условиях окружающей среды перед хранением в морозильной камере при -20 ° C. Затем ДНК Arowana из каждого образца ткани (по 35-40 мг) экстрагировали отдельно с помощью набора для очистки QIAquick PCR Purification kit (Манчестер, Великобритания) в соответствии с протоколом производителя и хранили при -20 ° C, когда не использовали. Затем проводили ПЦР-амплификацию фрагмента геномной ДНК с использованием термоциклера Bio-Rad PCR (PTC-100, Hercules, США). Затем фрагменты ДНК продукта ПЦР разделяли электрофорезом в 1,5% агарозном геле. Экстракты ДНК арованы также были проанализированы электрохимическим ДНК-биосенсором для определения пола. Полученные ответы DPV сравнивали с исходным током, полученным без присутствия ДНК арованы. А т Тест был применен для определения значительной разницы между ответом ДНК-биосенсора и исходным током при 4 степенях свободы и уровне достоверности 95%. Ответ ДНК-биосенсора, полученный при токе, значительно превышающем исходный, показал, что был обнаружен самец рыбы арована, и наоборот.

Результаты и обсуждение

Синтезированные AcMPs наблюдали (рис. 2) под растровым электронным микроскопом (SEM, LEO 1450VP). Распределение размеров акриловых мискропсфер, полученных фотополимерацией, показано на рис. 3.

СЭМ-изображение микросфер из акрилового полимера

Распределение размеров акриловых микросфер, полученных фотополимеризацией

Влияние различных скоростей сканирования углеродного ТФЭ, содержащего AcMPs-AuNPs, в присутствии K ₃ Fe (CN) ₆ показали, что пиковые токи окисления и восстановления увеличиваются с увеличением скорости сканирования от 0,05 до 0,30 В / с (рис. 4). Таким образом, ожидается, что процесс переноса электрона на поверхности электрода будет обратимым [22,23,24,25].

Циклические вольтамперограммы 1,0 мМ K ₃ Fe (CN) ₆ в 0,05 М Na-фосфатном буфере с pH 7,0 с различными скоростями сканирования (0,05, 0,10, 0,15, 0,20, 0,25 и 0,30 В / с) для модифицированного углеродного ТФЭ, содержащего материал AcMP-AuNP на поверхности электрода

На основе уравнения Рэндлса – Севчика

была обнаружена хорошая линейность между током пика окислительно-восстановительного потенциала и квадратным корнем из скорости сканирования с коэффициентом корреляции ( R ² ) 0,996 в диапазоне 50–300 мВ / с, как показано формулой. 2 и рис. 5а.

График пиковых токов окисления (ip / мкА) в зависимости от квадратного корня из скорости сканирования ((мВ / с) ^1/2 ) ( а ) и график зависимости пиковых токов окисления (ip / мкА) от логарифма скоростей сканирования (log (мВ / с)) ( b )

Это указывает на то, что реакция на поверхности модифицированного электрода была реакцией, контролируемой диффузией [22,23,24,25].

Кроме того, на основе рис. 5b, когда логарифмическое значение тока окисления было построено в зависимости от логарифмического значения скорости сканирования, была получена линейная линия с наклоном 0,65, которая была близка к теоретическому значению 0,50 для процесса, контролируемого диффузией. . Таким образом, исследование показало, что реакция на поверхности модифицированного ТФЭ в основном контролируется диффузией.

Для идеального случая быстрого, обратимого и одноэлектронного процесса переноса ΔEp =0,059 В при 298 К. Однако сдвиги потенциала пиков, которые увеличивались со скоростью сканирования, демонстрировали большее разделение потенциалов пиков, превышающее 0,059 В (рис. ). Это означает, что процесс переноса электрона на поверхности электрода идет медленно [22, 25, 26], вероятно, из-за сопротивления, создаваемого присутствием материала AcMP, покрывающего поверхность электрода.

На рис. 6 показан DPV-ответ ДНК-биосенсора арованы на основе AcMP, AuNP и AcMP-AuNP-модифицированных углеродных SPE. Значительная разница в токе DPV, наблюдаемая между экспериментами (а) и (с), показывает, что ДНК-зонды арованы были успешно привиты к AcMP за счет сильных ковалентных связей между сукцинимидной функциональной группой AcMP и аминогруппой аминированного ДНК-зонда, а также иммобилизованной ДНК-зонд arowana был селективен только к своей кДНК [19, 20]. AuNP играют роль в обеспечении электронной проводимости от интеркалированного AQMS к поверхности изготовленного электрода. Без включения AuNP в композиционный материал (f), только наночастицы золота (e), а также наночастицы золота и композит AcMP (d), можно наблюдать только очень слабый отклик по току. Низкие токи DPV, полученные в эксперименте (b), были связаны с отсутствием реакции гибридизации ДНК с нкДНК, что также указывает на отсутствие специфического поглощения окислительно-восстановительного индикатора AQMS на поверхности электрода [27, 28].

Сигнал DPV от ДНК-электрода на основе AcMP-AuNP при гибридизации с кДНК ( a ) и некомплементарная ДНК ( b ), DPV-ответ AcMP ( f ) и SPE, модифицированный AuNP ( e ) и композитный модифицированный SPE AcMP-AuNP, а также ответ ДНК-биосенсора на основе композитного модифицированного зонда AcMP-AuNP DNA SPE ( c ) перед реакцией с кДНК в присутствии 1 мМ AQMS при скорости сканирования 0,5 В / с по сравнению с электродом сравнения Ag / AgCl

Что касается продолжительности иммобилизации ДНК-зонда, рис. 7a демонстрирует, что ответ ДНК-биосенсора медленно увеличивается в течение первых 1-3 часов иммобилизации ДНК-зонда, а резкое увеличение ответа ДНК-биосенсора можно наблюдать между 3 и 6 часами продолжительности иммобилизации ДНК-зонда. . Это было связано с тем, что требовалось более длительное время иммобилизации, чтобы способствовать прикреплению большего количества ДНК-зондов к электроду, модифицированному AcMP-AuNP. При дальнейшем увеличении времени иммобилизации ДНК-зонда не было обнаружено заметных изменений в ответе ДНК-биосенсора, поскольку сайты связывания иммобилизованных AcMP полностью связались с ДНК-зондами. Ответ биосенсора ДНК арованы также зависит от времени гибридизации ДНК. Профиль ответа биосенсора, проиллюстрированный на фиг. 7b, показывает тенденцию увеличения текущего ответа DPV с продолжительностью гибридизации ДНК от 10 до 60 мин, после чего текущий ответ становится почти плато. На этом этапе иммобилизованные ДНК-зонды на электроде полностью гибридизуются с кДНК [29].

Влияние времени иммобилизации ДНК-зонда ( a ) и время гибридизации ДНК ( b ) на ответ биосенсора ДНК арована с использованием 5 мкМ ДНК-зонда и кДНК в присутствии 1 мМ AQMS при ионной силе 2 М

Также следует отметить, что время гибридизации ДНК изготовленного биосенсора ДНК арованы зависело от температуры, и, как большое преимущество, мы получили максимальный отклик по току при комнатной температуре в течение 30 мин (рис. 8). При низкой температуре, то есть 4 ° C, требовалось много времени для полной реакции гибридизации ДНК, поскольку низкая температура замедляла скорость реакции гибридизации ДНК. Более быстрое время гибридизации ДНК может быть достигнуто при температуре выше 25 ° C, что приписывается более высокой скорости реакции гибридизации ДНК, происходящей между иммобилизованным ДНК-зондом и кДНК с образованием дуплекса ДНК при высоких температурах. Однако высокая температура может необратимо деформировать двойную спиральную структуру ДНК, и регенерация молекулы ДНК невозможна даже после корректировки температуры до оптимального значения [28, 30].

Влияние температуры на время гибридизации ДНК биосенсора ДНК арована. Ответ DPV измеряли в 0,05 M K-фосфатном буфере (pH 7,0) при 4, 25, 40 и 50 ° C в течение экспериментального периода 5–90 минут

В рамках оптимизации ответа биосенсора ДНК арованы было исследовано влияние рН раствора на реакцию гибридизации ДНК. Биосенсор ДНК показал незначительное изменение тока в диапазоне от pH 5,5 до pH 6,5 из-за протонирования фосфодиэфирного остова ДНК, что снижает растворимость молекул ДНК в водной среде (рис. 9). Дальнейшее увеличение pH среды для гибридизации ДНК, реакция биосенсора ДНК арованы резко возросла при pH 7,0, после чего было заметно резкое снижение тока DPV, поскольку среда pH изменилась до основного состояния из-за необратимой денатурации ДНК при более высоком pH. диапазон [23, 24, 31,32,33]. Поскольку максимальный ответ DPV был получен при нейтральном pH, следующая электрохимическая оценка ответа биосенсора arowana ДНК поддерживалась при pH 7,0 с использованием 0,05 M Na-фосфатного буфера.

DPV-ответ ДНК-биосенсора arowana на основе композитного модифицированного углеродного SPE AcMP-AuNP между pH 5,5 и pH 8,0. Измерение DPV проводилось в 0,05 M K-фосфатном буфере (pH 7,0) при 25 ° C и скорости сканирования 0,5 В / с по сравнению с электродом сравнения Ag / AgCl

Влияние валентности катионов на реакцию гибридизации ДНК проводили с использованием различных катионов солей, например Ca ²⁺ , Na ⁺ , K ⁺ , и Fe ³⁺ ионы в буфере для гибридизации ДНК. Положительно заряженные ионы могут электростатически взаимодействовать с отрицательно заряженной фосфодиэфирной цепью молекулы ДНК для преодоления стерических препятствий и электростатического отталкивания между иммобилизованным ДНК-зондом и ДНК-мишенью, тем самым облегчая процесс гибридизации ДНК [34]. Рисунок 10 демонстрирует, что реакция гибридизации ДНК была благоприятной в присутствии катионов порядка Na ⁺ .> K ⁺ > Fe ³⁺ > Ca ²⁺ . Наличие Ca ²⁺ и Fe ³⁺ Было замечено, что ионы вызывают заметное снижение токовой реакции биосенсора ДНК арованы по сравнению с Na ⁺ и K ⁺ ионы. Эти явления были приписаны образованию труднорастворимых солей фосфата кальция и фосфата железа (III) в буфере для гибридизации ДНК [22], которые снижали содержание ионов в растворе и вызывали сильное электростатическое отталкивание между молекулами ДНК. В результате скорость гибридизации ДНК снизилась, что привело к плохой работе биосенсора. Самый высокий ответ ДНК-биосенсора был получен, когда Na ⁺ ионы были добавлены к фосфатному буферу для гибридизации ДНК из-за их небольшого размера и сильного сродства к фосфодиэфирной связи ДНК.

Эффект Ca ²⁺ , Na ⁺ , K ⁺ , и Fe ³⁺ ионы в буфере для гибридизации ДНК (0,05 M Na-фосфатный буфер при pH 7,0) на ответ DPV ДНК-биосенсора arowana

Концентрация NaCl и Na-фосфатного буфера (pH 7,0) также должна быть оптимизирована для обеспечения оптимальной ионной силы для буфера для гибридизации. Рисунок 11b показывает, что ионная сила ниже и выше 2 M не может преодолеть сильное электростатическое отталкивание между нитями ДНК. Было обнаружено, что около 0,05 M Na-фосфатного буфера (фиг. 11a) и 2 M NaCl обеспечивают оптимальную ионную силу для анализа ДНК-мишени arowana с максимальной производительностью биосенсора. Оптимальные буферные условия для гибридизации с точки зрения pH, буферной емкости и ионной силы позволили бы реакции гибридизации ДНК протекать с минимальными стерическими препятствиями [30].

Тенденции реакции биосенсора ДНК арованы как a Концентрация Na-фосфатного буфера и b ионная сила гибридизационного буфера варьировалась от 0,002–0,100 М и 1,52–5,50 М соответственно

Затем оптимизированный ДНК-биосенсор использовали для обнаружения серии концентраций кДНК арованы от 1,0 × 10 ^-12 и 1,0 × 10 ⁻² мкМ. Биосенсор ДНК показал широкий линейный диапазон ответа от 1,0 × 10 ^-18 до 1,0 × 10 ⁻⁸ M ( R ² =0,99). Предел обнаружения (LOD), полученный при 1.0 × 10 ⁻¹⁸ M рассчитывали на основе трехкратного стандартного отклонения ответа биосенсора на кривой отклика, аппроксимирующего LOD, деленного на наклон линейной калибровки. Размер гомогенных частиц AcMP в микрометровом диапазоне оказывает значительное влияние на чувствительность и воспроизводимость ДНК-биосенсора (RSD =5,6%). Большая площадь поверхности связывания иммобилизованных NAS-функционализированных AcMPs позволила большому количеству молекул ДНК ковалентно связываться с поверхностью электрода, тем самым увеличивая аналитические характеристики ДНК-биосенсора в отношении динамического линейного диапазона и предела обнаружения биосенсора ДНК арована (рис. . 12).

The arowana DNA biosensor response curve (a ) and linear calibration range (b ) and the DPV voltammogram (c ) obtained using 1.0 × 10 ⁻¹⁸ to 1.0 × 10 ⁻² μM cDNA at pH 7.0

Determination of Arowana Fish Gender with DNA Biosensor

The developed electrochemical DNA biosensor has been validated with the standard PCR-based method to determine the gender of Asian arowana fish. With the results tabulated in Table 2, both methods provided the same result for the gender determination of arowana fish. This indicates that the proposed DNA biosensor can be used for accurate determination of arowana gender in a simple and fast way.

Conclusions

The electrochemical DNA biosensor developed in this study demonstrated good sensitivity, wide linear response ranges, and low detection limit in the determination of arowana target DNA. In addition, the DNA biosensor showed a good response towards arowana cDNA, which implies that the electrochemical DNA biosensor could be used to successfully detect the arowana DNA segments. The developed arowana DNA biosensor can be further redesigned into a point-of-use device prototype that offers a great potential for the application in the fish culture for early identification of arowana gender and colour, which is economically advantageous in fishery and aquaculture sectors.