Новый метод целевого нанопрепарата без органического растворителя для повышения противоопухолевой эффективности

Фон

В течение последних двух десятилетий исследования были сосредоточены на улучшении субоптимальных фармакокинетических свойств химиотерапии для повышения ее эффективности [1, 2]. Был достигнут значительный прогресс, и были успешно приготовлены многие многофункциональные системы доставки лекарств на основе наночастиц, которые демонстрируют широкий спектр комбинированных свойств, таких как длительная циркуляция [3, 4], нацеливание [5,6,7], визуализация [8 , 9,10], чувствительность к pH [11, 12] и замедленное высвобождение лекарства [9, 13].

В последние годы несферическая форма частиц привлекает все больше внимания из-за их потенциального воздействия на доставку лекарств [14,15,16,17,18,19]. Уже были доказательства того, что форма влияет на многие свойства частиц, такие как биораспределение и деградация [20,21,22]. Прежде всего, было доказано, что клеточная интернализация сильно зависит от формы [23,24,25]. Потому что частицы должны иметь возможность проникать в раковые клетки и воздействовать на свои терапевтические цели, чтобы убить их. Многие исследования показали, что раковые клетки предпочитают частицы с высоким соотношением сторон [10, 26].

Однако большинство этих методов в значительной степени полагаются на органические растворители, в основном из-за гидрофобной группы, необходимой в процессах получения наночастиц [27]. Эти органические растворители могут оставаться внутри частиц и не могут быть полностью удалены обычными методами, такими как перегонка при пониженном давлении или сублимационная сушка. В результате в лекарстве остаются следовые количества органических растворителей, которые называются остаточными растворителями. Хотя остаточных растворителей очень мало и они могут соответствовать специальным указаниям, опубликованным в фармакопеях, которые строго контролируют максимально допустимые количества остаточных растворителей в фармацевтических продуктах, остаточные растворители будут накапливаться в организме и могут усугубить болезнь или вызвать другие серьезные вопросы. Следовательно, производители стремились свести к минимуму количество органических растворителей, используемых в процессе производства лекарств. Следовательно, использование «зеленой» химии в фармацевтической промышленности станет значительным шагом вперед для медицины, здоровья человека и окружающей среды, хотя и столкнется с рядом трудностей.

В этом исследовании мы разработали НСРТ-модифицированные фолиевой (FA) наноиглы (HFND) с высоким соотношением сторон и острыми концами с помощью полностью экологичного метода без использования какого-либо органического растворителя. PH-контролируемое осаждение HCPT и хитозана, модифицированного FA (CS-FA), приводит к зарождению наноигл с нанокристаллическим HCPT в качестве ядра, обернутого CS-FA в качестве стерических стабилизаторов. Было обнаружено, что HFND обладают хорошими свойствами нацеливания и визуализации. Затем были систематически изучены исследования in vitro и in vivo. Эти результаты подчеркивают большой потенциал модифицированных FA наноигл с функцией визуализации для высокоэффективной химиотерапии, а также для диагностики рака.

Методы

Материалы

Все химические вещества имеют аналитическую чистоту и используются без дополнительной очистки. Во всех экспериментах использовалась деионизированная (ДИ) вода. FA был приобретен у Bio Basic Inc. 10-гидроксикамптотецин (HCPT; чистота> 99%) был приобретен у Lishizhen Pharmaceutical Co., Ltd. Хитозан (Mw =70 000, степень деацетилирования 90%) был получен от Zhejiang Aoxing. N -Гидроксисукцинимид (NHS) и гидрохлорид 1- (3-диметиламинопропил) -3-этилкарбодиимида (EDC) были приобретены у Sigma-Aldrich.

Синтез конъюгата FA-хитозан

FA (10 мг), хитозан (20 мг), EDC (4 мг) и NHS (4 мг) добавляли в 2 мл буферного раствора PBS (pH 5,5) и перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов для получения суспензии CS-FA. . Затем суспензию диализовали против буферного раствора (pH 10) для удаления избыточных молекул ЖК. Оставшуюся суспензию центрифугировали (5000 об / мин) и лиофилизировали в течение 24 часов для получения сухого порошка CS-FA.

Подготовка HFND

HCPT (10 мкг) растворяли в 200 мкл водного раствора NaOH (0,1 M) для получения раствора A, а CS-FA (10 мкг) растворяли в 200 мкл HCl (0,1 M), чтобы получить раствор B. и раствор B добавляли по каплям в чистую воду (1 мл) при интенсивном перемешивании в течение 30 с, и смесь обрабатывали ультразвуком (200 Вт) на ледяной бане в течение 6 минут. Суспензию центрифугировали (10000 об / мин, 5 мин) и лиофилизировали в течение 24 ч. Для приготовления НА раствор хитозана использовали вместо раствора Б.

Характеристика

Морфологию HFND исследовали с помощью SEM (UV-70) при 15 кВ. Значения размера и дзета-потенциала определяли с помощью прибора Malvern Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments, Malvern). Для определения средних значений были проведены три параллельных измерения. Кристалличность HFND анализировали с помощью XRD (X’pert PRO). Содержание ЖК в HFND определяли методом УФ-спектрофотометрии (Beckman DU800). Все образцы анализировали при 281 нм. Стандартная кривая была построена заранее для определения концентрации ЖК. Содержание HCPT в HFND определяли флуоресцентной спектрофотометрией при 383 нм. Стандартная кривая была построена заранее для определения концентрации HCPT. Содержание и эффективность улавливания рассчитывались по формулам. (1, 2, 3 и 4):

Исследование выпуска лекарств in vitro

Изучение высвобождения HFND лекарственного средства in vitro проводили с использованием диализной техники. HFND диспергировали в буферном растворе PBS (10 мл) и помещали в предварительно набухший диализный мешок (MWCO 3500 Да). Затем диализный мешок погружали в PBS (0,1 M, 200 мл, pH 7,4) и непрерывно колебали в шейкере-инкубаторе (100 об / мин) при 37 ° C. Все образцы были проанализированы флуоресцентной спектрофотометрией.

Конфокальная визуализация клеток

Конфокальная визуализация клеток выполнялась с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа Leica. Визуализацию HCPT проводили при возбуждении лазером с длиной волны 382 нм, а эмиссию собирали в диапазоне 500–550 нм. Клетки HeLa засевали и предварительно инкубировали при 37 ° C в течение 24 часов (5% CO ₂ ) перед инкубацией с HFND в течение 8 ч.

Поглощение в клетке, измеренное с помощью измерения флуоресценции

Клетки HeLa высевали в 24-луночный планшет (1 × 10 ⁶ мл / лунку). Затем планшет инкубировали при 37 ° C в течение 24 часов во влажной атмосфере (5% CO ₂ ). Затем клетки инкубировали с ND и HFND при эквивалентных концентрациях HCPT. Клетки, обработанные лекарственным средством, инкубировали в течение 6 часов при 37 ° C, затем дважды промывали PBS и расщепляли обработкой трипсином (0,05%) / EDTA. Суспензии центрифугировали (1000 об / мин, 4 ° C) в течение 4 мин. Осадки клеток промывали PBS для удаления фоновой флуоресценции в среде. После двух циклов промывки и центрифугирования клетки ресуспендировали в 2 мл PBS и полностью разрушали с помощью мощной обработки ультразвуком. Количество HCPT в обработанной ультразвуком смеси анализировали флуоресцентной спектроскопией (возбуждение при 382 нм). Для определения уровня аутофлуоресценции клеток в качестве контроля измеряли холостые клетки в отсутствие лекарственного средства.

Анализы цитотоксичности

Цитотоксичность HFND определяли с помощью МТТ-анализа. Вкратце, адекватное количество клеток HeLa с экспоненциальной фазой высевали в пяти повторностях в 96-луночный планшет с плоским дном и инкубировали в течение 24 ч в присутствии лекарства / частиц. В этом исследовании 20 мкл раствора 3- (4,5-диметил-2-тиазолил) -2,5-дифенил-2-H-тетразолийбромида (МТТ) (5 мг / мл в PBS) добавляли в каждую лунку. и планшеты инкубировали при 37 ° C еще 4 часа. После этого добавляли 150 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) и планшет перемешивали на водяной бане при 37 ° C в течение 30 минут. Поглощение при 570 нм измеряли с помощью считывающего устройства для микропланшетов (модель 680; Bio-Rad).

Биораспространение

Для получения изображений флуоресценции in vivo DiR инкапсулировали в ND и HFND. DiR-ND и DiR-HFND внутривенно вводили голым мышам с опухолью HeLa через хвостовые вены в эквивалентной дозе DiR-HCPT на килограмм веса тела мыши. Через заранее определенные интервалы времени мышей анестезировали и визуализировали с помощью системы визуализации Maestro in vivo (Cambridge Research &Instrumentation, Woburn, MA, США). Через 24 часа мышей умерщвляли и вырезали опухоль, а также основные органы (селезенку, печень, почки, легкие и сердце) с последующей промывкой поверхности 0,9% NaCl для визуализации ex vivo. P>

Подавление опухоли in vivo

Когда объем опухоли HeLa у мышей с опухолью HeLa составлял приблизительно 60 мм ³ мышей случайным образом разделили на четыре группы и лечили внутривенной инъекцией 0,9% NaCl, свободных HCPT, ND и HFND каждые 3 дня в дозе 80 мкг HCPT на мышь. Объем опухоли и массу тела контролировали каждые 3 дня. Объем опухоли рассчитывали по следующей формуле:объем опухоли =0,5 × длина × ширина ² .

Через 21 день мышей умерщвляли, затем вырезали опухоли и взвешивали. Затем опухоли фиксировали в 4% параформальдегиде в течение ночи при 4 ° C, заливали парафином, делали срезы (4 мкм), окрашивали гематоксилином и эозином (H&E) и наблюдали с помощью системы цифровой микроскопии.

Статистический анализ

Статистическая значимость результатов лечения оценивалась с помощью t Стьюдента. тестовый (двусторонний); P <0,05 считалось статистически значимым во всех анализах (уровень достоверности 95%).

Результаты и обсуждение

Синтез конъюгата FA-хитозан

Сначала мы конъюгировали ЖК с хитозаном путем реакции амидирования между карбоксильной концевой группой ЖК и амидогеном хитозана (рис. 1). Структура конъюгации (CS-FA) была подтверждена инфракрасной спектроскопией с преобразованием Фурье (FT-IR). Как показано на фиг. 2, пик при 1605 / см стал более сильным в ИК-спектре CS-FA, чем пик хитозана, что соответствует валентному колебанию C =O новой амидной связи. Результат показал, что ЖК успешно конъюгирована с амидогеном хитозана через амидную связь. Чтобы исследовать процентное содержание FA в конъюгации, с помощью ультрафиолетовой спектрофотометрии строили стандартную кривую. И процент FA был рассчитан как 23,4 ± 2,5%.

Синтетический путь конъюгата CS-FA

ИК-Фурье спектры ( a ) FA, ( b ) хитозан и ( c ) CS-FA

Подготовка HFND

Общеизвестно, что растворимость HCPT в воде крайне мала, но он может растворяться в щелочи. У хитозана все наоборот:он растворим в кислотах и ​​не растворим в воде. И CS-FA показал растворимость, аналогичную хитозану. Следовательно, HCPT и CS-FA были растворены в щелочи и кислотах соответственно. Когда два раствора смешиваются, происходит реакция нейтрализации. Полученная смесь должна быть нейтральной, что будет плохим растворителем как для HCPT, так и для CS-FA. Уменьшение растворимости, вызванное изменением pH, предоставило возможность для зарождения наноигл HCPT и сопутствующего соосаждения CS-FA на растущие наноиглы HCPT (рис. 3a). Динамическое зарождение и осаждение наноигл под действием ультразвука, плюс активная окклюзия мягкого ингредиента CS-FA, привели к образованию HFND вместо объемного кристалла HCPT. Для оптимизации условий приготовления был разработан эксперимент с условиями для изучения влияния отношения HCPT к CS-FA, мощности ультразвука, pH полученной смеси и концентрации полученной смеси на морфологию HFND (Таблица 1).

а Иллюстрация полностью зеленого метода приготовления HFND. б , c СЭМ-изображения HFND

На рис. 4 показана морфология частиц в различных условиях. Когда CS-FA было слишком много, избыток CS-FA будет прикрепляться к поверхности произведенных частиц (рис. 4a). Хотя CS-FA было слишком мало, CS-FA не смог остановить рост наноигл HCPT, которые были склонны к агрегированию (рис. 4b). Поскольку зародышеобразование инициировалось изменениями pH, pH полученной смеси играл важную роль в процессе приготовления. Уровень pH должен быть нейтральным, иначе кристаллизация может быть нарушена (рис. 4c). Мощность ультразвука также оказала большое влияние на морфологию HFND. Наноиглы будут агрегироваться при малой мощности (рис. 4d) и разрушаться на фрагменты при высокой мощности (рис. 4e). Кроме того, было обнаружено, что концентрация полученной смеси сильно влияет на размер HFND. Размер уменьшился при увеличении концентрации (рис. 3b и 4f).

а - е СЭМ-изображения HFND в различных условиях (подробности см. В таблице 1). г Гранулометрический состав HFND. ч Дзета-потенциал HFND

На рис. 3b, c показана оптимизированная игольчатая морфология HFND со средней длиной около 800 нм и шириной около 80 нм. Результат измерения DLS показывает размер 104,3 ± 5,7 нм (рис. 4g) и дзета-потенциал +16,3 ± 1,9 мВ (рис. 4h). Более того, дисперсия 2 мас.% HFND показала хорошую стабильность в течение как минимум 2,5 суток. Поскольку нет сигналов флуоресценции от CS-FA, мы можем измерить содержание HCPT, загружающее лекарство, HFND, используя характеристики флуоресценции HCPT. Содержание HCPT-лекарственного средства в HFND составляло 70,2 ± 3,1%, а эффективность инкапсуляции составляла 83,1%. А содержание FA в HFND составляло 7,0%, что было рассчитано через процентное содержание FA в CS-FA.

XRD-анализ

Как известно, форма лекарства сильно влияет на свойства наночастиц. Следовательно, очень важно понять форму HCPT в HFND. Для обнаружения формы HCPT в HFNDs использовали дифракцию рентгеновских лучей (рис. 5). Ясно, что чистый HCPT показывает множество острых кристаллических пиков, представляющих характеристики высокой кристалличности. Хотя широкие пики полукристаллического хитозана все еще присутствовали на рентгенограмме HFND, большинство пиков принадлежало HCPT, что свидетельствует о высокой кристалличности HCPT. Короче говоря, результаты XRD предполагают, что HCPT находится в кристаллическом состоянии в HFND. Более того, кинетика роста HCPT внутри HFND была изменена, в основном из-за активной окклюзии и ограничивающих эффектов CS-FA. Чтобы исследовать влияние CS-FA на процесс кристаллизации, кристаллы HCPT были приготовлены без наличия CS-FA. На рис. 6 показана морфология кристаллов HCPT. Они имели форму стержня, длиной более 10 мкм, что полностью отличалось от HFND. Это дополнительно продемонстрировало, что CS-FA изменил кинетику роста HCPT внутри HFND.

Диаграммы XRD ( a ) хитозан, ( b ) HCPT и ( c ) MHNDs

СЭМ-изображение объемных кристаллов HCPT

Исследования высвобождения лекарств in vitro

Поскольку поведение высвобождения лекарственного средства является важным свойством для системы доставки лекарственного средства, исследования высвобождения HFND in vitro были выполнены с использованием диализной техники наряду с порошками свободных HCPT. Все образцы были проанализированы с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Профили высвобождения показаны на рис. 7. Профиль свободного HCPT показал, что не менее 30% препарата высвобождалось при первом взятии пробы в 1 час и почти 100% через 18 часов. Однако профиль высвобождения HFND, по-видимому, представляет собой заметное пролонгированное и устойчивое высвобождение двух препаратов в течение 48 часов. Продолжительное высвобождение лекарства можно объяснить тем, что полимерная оболочка CS-FA может ограничивать высвобождение лекарства в ядре. Эти преимущества могут способствовать применению HFND для устойчивой системы доставки лекарств.

Профили высвобождения лекарств in vitro из MHND в PBS (pH 7,4) при 37 ° C. ( а ) Бесплатный HCPT; ( b ) HFNDs

Использование сотовой связи

Независимо от того, как система доставки лекарств достигает места опухоли-мишени, при системном введении или при прямом местном введении, очень важно, чтобы они могли проникнуть в область опухоли и воздействовать на свою внутриклеточную мишень. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (CLSM) была проведена для оценки клеточного поглощения HFND. Чтобы оценить их эффективность клеточного поглощения клетками HeLa, HFND и нагруженные HCPT наноиглы (ND; загрузка лекарственного средства =64,7%) инкубировали с клетками HeLa в течение 8 часов при 37 ° C (ND были получены с помощью HCPT и хитозана с помощью тот же метод, что и HFND). Как показано на рис. 8, гораздо более интенсивное флуоресцентное излучение HCPT было обнаружено у клеток, подвергшихся воздействию HFND, чем у клеток, подвергшихся воздействию ND через 8 часов инкубации, что свидетельствует о том, что FA на поверхности частиц может значительно увеличивать поглощение клетками.

Внутриклеточная доставка лекарств в течение 8 ч при 37 ° C. Изображения с конфокальной лазерной сканирующей микроскопии клеток HeLa, инкубированных с a HFND и b НД

Чтобы дополнительно подтвердить, что скорость интернализации клетками HFND была выше, были выполнены измерения флуоресценции для количественной оценки разницы в интенсивности излучения флуоресценции HCPT в клетках HeLa. В соответствии с наблюдениями CLSM, HFNDs были намного более предпочтительны, чем NDs в процессе клеточной интернализации (Fig. 9). Это дополнительно подтвердило свойство таргетинга HFND.

Измерения флуоресценции клеток HeLa, инкубированных с HFND ( a ) и ND ( b ) в течение 8-часового инкубационного периода при 37 ° C; P <0,05

Анализы цитотоксичности

Чтобы дополнительно изучить возможность использования HFND для местной доставки лекарств, мы проверили способность HFND уничтожать раковые клетки. Цитотоксичность HFND оценивали с помощью анализа МТТ с клетками HeLa. Свободные HCPT и ND, содержащие эквивалентные концентрации HCPT, использовали в качестве контроля. Концентрации HCPT составляли 0,50, 1,00, 2,00, 4,00, 8,00 и 16 мкг / мл. Как показано на фиг. 10, цитотоксичность HCPT была выше, чем у ND, в основном из-за гораздо более высокой скорости высвобождения лекарства HCPT, чем у ND. Тем не менее цитотоксичность HFND была выше, чем у HCPT. Вероятно, это было связано со свойством нацеливания FA на поверхность HFND, что могло помочь частицам проникать в клетки и убивать их. Таким образом, HFND проявляли удивительно хорошую способность убивать раковые клетки. Эти результаты подтверждают, что ЖК на поверхности HFND могут увеличивать клеточное поглощение частиц и, таким образом, увеличивать их способность уничтожать раковые клетки за счет связывания с рецепторами ЖК.

Жизнеспособность клеток HeLa, обработанных ( a ) бесплатный HCPT, ( b ) ND и ( c ) HFND через 24 ч инкубации. P <0,05

Биораспространение

Чтобы оценить способность нанести двойных лекарственных средств к опухоли мишенью, DiR использовали в качестве зонда флуоресценции в ближнем инфракрасном диапазоне, который нужно инкапсулировать в свободные HCPT, ND и HFND при эквивалентной концентрации DiR. 0,9% NaCl, DiR-ND и DiR-HFND вводили внутривенно мышам, несущим опухоли, полученные из клеток HeLa карциномы шейки матки человека, и исследовали их биораспределение in vivo.

Как показано на фиг. 11а, хотя в группе DiR-ND флуоресцентные сигналы не были обнаружены на участках опухоли, в группе DiR-HFND визуализировался сильный флуоресцентный сигнал. Когда общее количество флуоресценции все время уменьшалось, интенсивность сигнала на участке опухоли увеличивалась с 1 до 12 часов, указывая на то, что HFND накапливались в опухолях в течение этого времени. Через 24 часа мышей умерщвляли и опухолевые ткани, а также нормальные ткани выделяли для визуализации и анализа ex vivo (рис. 11b, c). Интенсивность флуоресценции в опухолевой ткани мышей, обработанных DiR-HFNDs, была значительно выше. выше, чем у других мышей. Было подтверждено, что введение ФА дало наноиглам отличную эффективность нацеливания на опухоль, что привело к более высокому эффективному лечению рака.

а Распространение и накопление в опухоли DiR-наночастиц у мышей с опухолью HeLa, получавших внутривенные инъекции указанных составов. б Флуоресцентная визуализация ex vivo опухоли и нормальных тканей, полученных от умерщвленных голых мышей с опухолью HeLa. Снимки были сделаны через 24 часа после инъекции. H, Li, Lu, K, S и T представляют сердце, печень, легкое, почку, селезенку и опухоль соответственно. c Интенсивность флуоресценции DiR в опухолевых тканях, собранных через 24 ч после системной инъекции. P <0,05. ( а ) 0,9% NaCl, ( b ) DiR-ND и ( c ) DiR-HFND

Подавление опухоли in vivo

Чтобы оценить противоопухолевые эффекты in vivo, мы создали ксенотрансплантаты опухоли HeLa у мышей Kunming и оценили рост опухоли после внутривенного введения 0,9% NaCl, свободных HCPT, ND и HFND с той же концентрацией HCPT. По сравнению с мышами, получавшими 0,9% NaCl в качестве контроля, скорость роста опухолей у мышей, получавших свободные HCPT или ND, постепенно снижалась (фиг. 12a), что указывает на значительно эффективное ингибирование роста опухоли. Следует отметить, что HFND приводили к наиболее выраженному подавлению роста опухоли. В конце эксперимента опухоли вырезали и взвешивали. Как показано на рис. 12c, было обнаружено, что наноиглы с двойным лекарственным средством обладают более высокой терапевтической эффективностью по сравнению с другими группами ( P <0,05). Дополнительное свидетельство усиленного противоопухолевого эффекта двойных лекарственных наноигл было показано на гистологических изображениях (рис. 12d). Для любых систем доставки лекарств следует учитывать системную токсичность, которая обычно встречается при лечении с помощью бесплатного HCPT, чтобы гарантировать безопасность и эффективность. В этой работе введение бесплатного HCPT привело к вялости / лени и серьезной потере веса у мышей (рис. 12b), что свидетельствует о нежелательных побочных эффектах химиотерапии. Напротив, у мышей, получавших ND и HFND, явных побочных эффектов не наблюдалось. В целом было указано, что HFND с превосходным противоопухолевым действием, а также с меньшей токсичностью могут значительно улучшить эффективность терапии качества жизни.

Противоопухолевые эффекты различных (нано) препаратов. а Изменение объема опухоли у мышей во время лечения. б Изменение веса мышей с опухолью во время лечения. c Вес опухолей HeLa после лечения разными препаратами. г Гистологический срез опухоли мышей после лечения. ( а ) 0,9% водный раствор NaCl, ( b ) бесплатный HCPT, ( c ) NDs и ( d ) HFNDs. Во всех составах использовалась одинаковая концентрация HCPT на мышах с опухолью HeLa. P <0,05

Выводы

В данном исследовании представлен полностью зеленый подход к получению модифицированных FA, нагруженных HCPT наноигл для высокоэффективной химиотерапии с высокой загрузкой лекарственного средства, свойством нацеливания и возможностью визуализации. Профиль высвобождения лекарственного средства показал, что HFND показали замедленное и пролонгированное высвобождение. CLSM продемонстрировал более эффективную клеточную интернализацию HFND, чем ND. Эксперимент МТТ показал, что HFND не только показали гораздо более высокую цитотоксичность, чем отдельные лекарства и ND. Это проиллюстрировало хорошее целевое свойство HFND. Эта работа открывает двери для разработки новых дозировок наночастиц с использованием полностью экологически чистых методов, которые могут оказать сильное влияние на защиту окружающей среды в будущем.