Экзосомальный miR-18b-3p из МСХ человеческой пуповины снижает риск преэклампсии, таргетируя лептин

Аннотация

Экзосомы, полученные из мезенхимальных стволовых клеток человеческой пуповины (hucMSC), экспрессирующие микРНК, привлекали внимание в человеческих заболеваниях. Однако детальный молекулярный механизм экзосомального miR-18b-3p, полученного из hucMSC, при преэклампсии (ПЭ) требует дальнейшего исследования. Мы стремились изучить эффект экзосом и miR-18b-3p/лептин (LEP) на возникновение ПЭ. Морфологию hucMSC и экзосом hucMSC (Exos) идентифицировали. Экзосомы инфицировали различными лентивирусами, экспрессирующими miR-18b-3p, для изучения роли miR-18b-3p при ПЭ. Модель ПЭ у крыс создавали внутрибрюшинной инъекцией N-нитро-L-аргинина метиловым эфиром. Экспрессию LEP и miR-18b-3p тестировали в плацентарных тканях крыс с ПЭ. Также определяли эффект экзосом на экспрессию LEP и miR-18b-3p. Измеряли систолическое артериальное давление (САД), протеинурию, воспалительные факторы, массу плодных крыс и плаценты и а폽тоз клеток у крыс с ПЭ. Наконец, связь между miR-18b-3p и LEP верифицировали с помощью анализа двойного люциферазного репортерного гена и RNA pull-down анализа. Экзосомы, восстанавливающие miR-18b-3p или ингибирующие LEP, снижали САД и протеинурию крыс с ПЭ, а также увеличивали массу плодных крыс и плаценты, снижали уровень воспалительных факторов в сыворотке и подавляли а폽тоз клеток у крыс с ПЭ, оказывая подавляющий эффект на прогрессирование ПЭ. miR-18b-3p был снижен, а LEP повышен в плацентарных тканях крыс с ПЭ. LEP был прямой мишенью miR-18b-3p. Ап-регуляция miR-18b-3p или лечение экзосомами подавляли экспрессию LEP и снижали возникновение ПЭ, в то время как даун-регуляция miR-18b-3p имела противоположные эффекты. Даун-регуляция LEP обратила эффект снижения miR-18b-3p на крысах с ПЭ. Экзосомальный miR-18b-3p, полученный из hucMSC, таргетирует LEP для участия в возникновении и развитии ПЭ. Это исследование может предоставить новую теоретическую базу для механизма и исследования ПЭ.

Введение

Преэклампсия (ПЭ), характеризующаяся протеинурией и гипертензией [1], является основной причиной плодной и материнской смертности и заболеваемости при человеческой беременности [2]. Этиология и патогенез ПЭ неясны [3], о чем сообщалось, что это ассоциировано с аномальной инвазией трофобласта, приводящей к эндотелиальной дисфункции матери, хронической плацентарной малперфузии и гипертензии с неблагоприятными исходами [4]. За исключением родов плода и плаценты, специфической терапии для ПЭ не существует [5]. Поэтому срочно необходимо изучить терапевтические мишени для улучшения прогноза этого заболевания.

Человеческая пуповина (huc) является подходящим источником мезенхимальных стволовых клеток (МСХ), которые секретируют множество трофических факторов и цитокинов, а также демонстрируют сильные противовоспалительные и иммуномодуляторные способности [6]. Исследование подтвердило, что ПЭ ускоряет экспрессию нейроглиальных маркеров в МСХ желе Вирттона пуповины [7]. Также сообщался защитный эффект экзосом hucMSC (Exos) на плацентарную морфологию и ангиогенез у крыс с ПЭ [8]. Экзосомы — это малые (50–100 нм) секреторные везикулы, медиаторы коммуникации между клетками в микросреде опухоли путем инкапсуляции и передачи канцерогенных факторов в далекие места или окружающим клеткам через кровоток [9]. Исследование раскрыло повреждение сосудистых функций и осложнения, индуцированные эффективной передачей sFlt-1 и sEng в эндотелиальные клетки у пациентов с ПЭ экзосомами [10]. МикРНК (микРНК) — это эндогенные некодирующие РНК длиной 18–25 нуклеотидов, регулирующие экспрессию гена на посттранскрипционном уровне [11]. Данные исследования сообщили, что экспрессия miR-18b влияет на инвазию, живучесть и миграцию трофобласта при ПЭ [12]. Кроме того, У и соавт. предложили, что miR-18b ослабляет пролиферацию в человеческих ретинальных эндотелиальных клетках, индуцированную высоким глюкозом, что может предложить новое понимание механизма патогенеза диабетической ретинопатии [13]. Однако роль экзосомального miR-18b-3p, полученного из hucMSC, при ПЭ остается неизвестной. Лептин (LEP) имеет плейотропные эффекты на дифференциацию/пролиферацию клеток и иммунитет физиологических состояний и в основном поступает из адипоцитов, بالإضافة к другим тканям, включая плаценту [14]. Исследование подтвердило, что аномальная метилировка промотора LEP вовлечена в прогрессирование ПЭ [15]. Другое исследование предположило, что плацента является основным местом экспрессии LEP при беременности [16]. Тем не менее, связывающая связь между miR-18b-3p и LEP все еще неясна. Поэтому мы стремились изучить роль экзосомального miR-18b-3p, полученного из hucMSC, при ПЭ с вовлечением LEP, и мы предполагали, что экзосомальный miR-18b-3p из hucMSC может ингибировать прогрессирование ПЭ через таргетирование LEP.

Материалы и методы

Этическое одобрение

Исследование одобрено Этический комитетом Народной больницы Уханьского университета. Все участники подписали документ информированного согласия. Все животные эксперименты соответствовали Руководству по уходу и использованию лабораторных животных Международными комитетами Народной больницы Уханьского университета.

Изоляция, культивирование и идентификация hucMSC

Плодная пуповина, родом здоровая пуэрперальная, собирали, измельчали и фильтровали через сито, затем смешивали с фосфатно-буферизованным раствором (ФСР). Ткани пуповины центрифугировали при 1500 об/мин 5 мин с радиусом центрифуги 10 см. Ткани взвешивали в среде DMEM/F12, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (ФТС), и переносили в колбу для культивирования. Жидкость меняли через 4 дня, затем раз в 3 дня. Клетки пассажировали при конфлюэнтности около 90%. Прилипающий рост и морфологию hucMSC наблюдали под световым микроскопом. Клетки окрашивали раствором ойл ред О (Beyotime Institute of Biotechnology, Шанхай, Китай) для определения остеогенного дифференцирования hucMSC и окрашивали раствором щелочной фосфатазы (ЩФ) (Beyotime) для определения адрогенного дифференцирования hucMSC. Потоковый цитометр (Beckman Coulter Life Sciences, Бреа, Калифорния, США) использовали для тестирования CD73, CD166 (оба 1:10, BD Biosciences, Франклин-Лейкс, Нью-Джерси, США) и CD105 (1:20, AbD Serotec, Оксфорд, Великобритания).

Извлечение и идентификация hucMSC-Exos

Хорошо растущие hucMSC культивировали. Супернатант собирал и центрифугировали при 28 500 об/мин 1 ч с радиусом центрифуги 10 см. Супернатант удаляли, клетки фиксировали 2% глютаральдегидом и 1% осмиевой кислотой, дегидратировали этанолом, импрегнировали оксидом пропилена, сушили 2 ч, встраивали в Epon812 и резали. Срезы окрашивали ураном и свинцом соответственно. Наконец, экзосомы наблюдали под электронным микроскопом. Детектор Nanosight (Malvern Instruments, Малверн, Великобритания) использовали для обнаружения брауновского движения нанчастиц экзосом и их размера. Поверхностные маркеры hucMSC-Exos идентифицировали вестерн-блоттингом, результаты показывали, что hucMSC-Exos экспрессировали CD9, CD81 и CD63.

Метод инфекции лентивирусом

hucMSC инфицировали лентивирусом, содержащим вектор с низкой экспрессией miR-18b-3p и вектор НК с низкой экспрессией miR-18b-3p (Shanghai GenePharma Co, Ltd, Шанхай, Китай). В итоге получали стабильно экспрессирующие hucMSC-antagomir НК и hucMSC-miR-18b-3p antagomir. Клетки культивировали 48 ч, затем супернатант собирал и центрифугировали ультрацентрифугацией для получения соответствующих Exos-antagomir НК и Exos-miR-18b-3p antagomir.

Экспериментальные животные

Крысы линии Wistar (масса 200–250 г, возраст 8 недель, независимо от пола) в состоянии здоровой чистоты и половой зрелости отбирали (Центр экспериментальных животных Уханьского университета, Ухань, Китай). Крыс содержали в барьерной системе при температуре 18–28 °C, относительной влажности 40–70% и достаточном корме и воде.

Создание модели ПЭ у крыс

Модель ПЭ у крыс создавали внутрибрюшинной инъекцией 50 мг/кг ингибитора оксид азота синтазы, N(G)-нитро-L-аргинина метиловым эфиром (L-NAME, Beyotime) со ссылкой на статью [17]. Успешное создание модели ПЭ основывалось на повышении артериального давления на 20 мм рт.ст. и выше 115 мм рт.ст., а также усиленном протеинурии.

Группировка животных

Самку и самца крыс случайно соединяли в соотношении 1:1, и двух крыс держали в индивидуальной специальной клетке в 17–18 часов предыдущего дня. Сперму в влагалищных секрециях самок крыс наблюдали вагинальным пробником и микроскопом на следующий день. Если результат был положительным одновременно, день записывали как 0-й день беременности. С 13-го дня беременности крыс делили на 6 групп (по 10 крыс в каждой): нормальная группа (тот же объем физраствора инъецировали внутрибрюшинно с 13 по 20 день беременности), группа ПЭ (L-NAME [50 мг/кг в сутки] инъецировали внутрибрюшинно с 13 по 20 день беременности, и 20 мкл физраствора инъецировали в плаценту с 16 по 19 день беременности), группа ПЭ + miR-NK (L-NAME [50 мг/кг в сутки] инъецировали внутрибрюшинно с 13 по 20 день беременности, и 20 мкл 4 нмоль miR-NK инъецировали в плаценту с 16 по 19 день беременности), группа ПЭ + miR-18b-3p agomir (L-NAME [50 мг/кг в сутки] инъецировали внутрибрюшинно с 13 по 20 день беременности, и 20 мкл 4 нмоль miR-18b-3p agomir инъецировали в плаценту с 16 по 19 день беременности), группа ПЭ + miR-18b-3p antagomir (L-NAME [50 мг/кг в сутки] инъецировали внутрибрюшинно с 13 по 20 день беременности, и 20 мкл 4 нмоль miR-18b-3p antagomir инъецировали в плаценту с 16 по 19 день беременности), группа ПЭ + miR-18b-3p antagomir + small interfering RNA (si)-LEP (L-NAME [50 мг/кг в сутки] инъецировали внутрибрюшинно с 13 по 20 день беременности, и 20 мкл 4 нмоль miR-18b-3p antagomir и si-LEP инъецировали в плаценту с 16 по 19 день беременности) и группа ПЭ + si-LEP (L-NAME [50 мг/кг в сутки] инъецировали внутрибрюшинно с 13 по 20 день беременности, и 20 мкл 4 нмоль si-LEP инъецировали в плаценту с 16 по 19 день беременности). Крыс лечили экзосомами и экзосомами, несущими лентивирусы. Крыс распределяли на 5 групп (по 10 крыс в каждой): нормальная группа (тот же объем физраствора инъецировали внутрибрюшинно с 13 по 20 день беременности), группа ПЭ (L-NAME (50 мг/кг в сутки) инъецировали внутрибрюшинно с 13 по 20 день беременности, и 20 мкл физраствора инъецировали в плаценту с 16 по 19 день беременности), группа ПЭ + Exos (L-NAME (50 мг/кг в сутки) инъецировали внутрибрюшинно с 13 по 20 день беременности, и 20 мкл Exos (80 мкг экзосом взвесили в 20 мкл физраствора) инъецировали в плаценту с 16 по 19 день беременности), группа ПЭ + Exos-antagomir NK (L-NAME (50 мг/кг в сутки) инъецировали внутрибрюшинно с 13 по 20 день беременности, и 20 мкл Exos-antagomir NK (80 мкг экзосом взвесили в 20 мкл физраствора) инъецировали в плаценту с 16 по 19 день беременности) и группа ПЭ + Exos-miR-18b-3p antagomir (L-NAME (50 мг/кг в сутки) инъецировали внутрибрюшинно с 13 по 20 день беременности, и 20 мкл Exos-miR-18b-3p antagomir (80 мкг экзосом взвесили в 20 мкл физраствора) инъецировали в плаценту с 16 по 19 день беременности).

Определение систолического артериального давления (САД) и 24-часовой протеинурии

Давление крыс измеряли измерением артериального давления хвостовой артерии. Хвостовое манжетное САД всех беременных крыс измеряли на 10-й, 13-й, 16-й и 19-й день беременности с помощью детектора хвостового артериального давления крыс (Tensys (R) Medical Inc., Сан-Диего, Калифорния, США). Давление измеряли 3 раза за короткое время, затем усредняли значение как артериальное давление.

При свободном питании и воде 24-часовую мочу беременных крыс собирали на 10-й, 13-й, 16-й и 19-й день беременности, а белковое содержание определяли в нефрологическом отделении Народной больницы Уханьского университета.

Сбор образцов

Беременных крыс анестезировали 3% натрия пентобарбитала на 21-й день беременности. Периферическую кровь крыс сохраняли, центрифугировали для получения сыворотки и хранили в холодильнике при –20 °C для резерва. Затем плодных крыс и плаценту извлекали кесаревым сечением, удаляли плодную оболочку и соединенную пуповину, перерезали пуповину, соединенную с плодной крысой. Плаценту и плодную крысу клали на стерильную марлю для сушки крови и амниотической жидкости соответственно, затем клали на аналитические весы для взвешивания массы. Часть плацентарных тканей фиксировали 4% параформальдегидом, дегидратировали этанолом, проясняли ксилолом, встраивали в парафин и последовательно поперечно резали (5 мкм) для гемоксилин-эозинового (ГЕ) окрашивания и терминальной деоксинуклеотидил-трансферазной медиаторной деоксиуридинтрифосфат-биотин-ник-энд-лейблинг (TUNEL) окрашиванию. Остаток хранили при -80 °C для RT-qPCR, вестерн-блоттинга и ИФА.

ИФА

Содержание фактора некроза опухоли-α (TNF-α), интерлейкина (IL)-1β и IL-6 в сыворотке тестировали ИФА. Концентрации TNF-α, IL-1β и IL-6 определяли следуя инструкциям набора (R&D Systems, Миннеаполис, Миннесота, США). Оптическую плотность (OD) значения (490 нм) тестировали микропластинчатым ридером (Thermo Fisher Scientific, Массачусетс, США). Соответствующую стандартную кривую получали, используя значение OD как абсциссу и концентрацию соответствующего стандартного образца как ординату. Концентрации TNF-α, IL-1β и IL-6 рассчитывали из стандартной кривой.

ГЕ-окрашивание

Парафиновые образцы плацентарных тканей проясняли ксилолом, дегидратировали обычным градиентным спиртом, окрашивали гемоксилином, дифференцировали 1% соляной кислотой в спирте и возвращали к синему 1% аммиачной водой. Затем ткани контрастно окрашивали 1% эозиновым раствором, дегидратировали (75%, 90%, 95% этанол соответственно, абсолютный этиловый спирт) и проясняли ксилолом, сушили, монтировали и наблюдали под электронным микроскопом.

TUNEL-окрашивание

Парафиновые срезы рутинно депарафинизировали и дегидратировали согласно инструкциям, затем а폽тоз детектировали набором TUNEL (Nanjing Kejin Biotechnology Co., Ltd., Цзянсу, Китай). 4,6-диамино-2-фенилиндол (Shanghai Baitai Biotechnology Co., Ltd., Шанхай, Китай) использовали для наблюдения TUNEL-позитивных клеток с помощью флуоресцентного микроскопа (Nikon, Токио, Япония) [18].

RT-qPCR

Плацентарные ткани взвешивали. На 50–100 мг плацентарных тканей добавляли 1 мл TRIzol (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США) и полностью растворяли. Ткани добавляли 200 мкл хлороформа и центрифугировали при 4 °C, 12 000 об/мин для извлечения общей РНК. Концентрацию и чистоту РНК определяли спектрофотометром белок/нуклеиновая кислота DU-800 (Beckman). U6 и β-актин использовали как контрольные загрузки. ПЦР-праймеры проектировали и синтезировали Shanghai Sangon Biotechnology Co. Ltd. (Шанхай, Китай). Последовательности праймеров приведены в Таблице 1. РНК обращали в кДНК на основе инструкций набора для обратной транскрипции РНК (Sangon). ПЦР амплифицировали, продукты верифицировали агарозным гель-электрофрезом. Данные вычисляли методом 2^−ΔΔCt.

Вестерн-блоттинг

Общий белок плацентарных тканей извлекали буфером лизиса клеток для радиоиммунoprecипитации (Beyotime). hucMSC-Exo использовали для абстракции буфера, который центрифугировали при 14 000 об/мин. Супернатант сохраняли для тестирования белковой экспрессии экзосомальных маркерных белков (CD81, CD63 и CD9) в сыворотке. Белковую концентрацию определяли набором бихиноновой кислоты (Beyotime, P0010). Образец загружали согласно количественным результатам белка, обрабатывали 10% SDS-PAGE и трансферировали на мембрану. Мембрану блокировали 5% обезжиренным молоком, пробовали первичными антителами LEP, CD63, CD81, CD9 и β-актин (4 мл, 1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Inc, Санта-Крус, Калифорния, США), повторно пробовали 4 мл вторичным антителом goat anti-rabbit IgG/перекисным окислителем, экспонировали и развивали. β-актин использовали как внутренний референс. Серое значение анализировали программой Image Lab для анализа гелевых графиков.

Анализ двойного люциферазного репортерного гена

Онлайн-программное обеспечение для предсказания https://cm.jefferson.edu/ использовали для предсказания целевой связи между miR-18b-3p и LEP, а также места связывания miR-18b-3p и LEP 3′нетранслируемой области (UTR). Последовательность промоторной области LEP 3′UTR, содержащая место связывания miR-18b-3p, составляли. Плазмиды LEP 3′UTR дикого типа (WT) и LEP 3′UTR мутантного типа (MUT) конструировали. Рекомбинантные плазмиды назвали LEP 3′UTR-WT и LEP 3′UTR-MUT соответственно. Культивированные клетки 293T ко-трансфектили с miR-18b-3p мимиком и LEP 3′UTR-WT, miR-18b-3p мимиком и LEP 3′UTR-MUT, мимиком НК и LEP 3′UTR-WT, мимиком НК и LEP 3′UTR-MUT на 30 ч. Затем клетки 293T собирал. Активность светлячкового и рениллового люцифераза в клетках измеряли люминесцентными измерениями согласно набору для детектирования двойного люциферазного репортерного гена (Promega, Мэдисон, Висконсин, США).

RNA pull-down анализ

Биотинилированные РНК-пробы (Bio-miR-NK, Bio-miR-18b-3p и Bio-miR-18b-3p-Mut) инкубировали с лизатом клеток 293T и экстрагировали магнитными бусинами, конъюгированными со стрептомицином. Эксперимент проводили по инструкциям наборов Pierce magnetic RNA pull-down kits (Pierce, Иллинойс, США). РНК элюировали и очищали TRIzol (Pierce). Обогащение LEP в РНК-комплексе kvantифицировали RT-qPCR, как описано ранее [19].

Статистический анализ

Все данные анализировали ПО SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, USA). Измерительные данные указывали как среднее ± стандартное отклонение. Данные проводили независимым t-тестом для сравнений двух групп, в то время как сравнения среди множества групп оценивали односторонним дисперсионным анализом (ANOVA) с последующим пост-хок тестом Тьюки. Критерий статистической значимости устанавливали при p < 0,05.

Результаты

Морфология и идентификация hucMSC и hucMSC-Exos

Тканевые массы пуповины наблюдали под инвертированным микроскопом. Видно, что клетки вылезали из тканевой массы на 3-й день; клетки показывали спинделивидную форму и нитевидность, а также росли как колонии примерно на 5-й день. При культивировании до 3-го пассажа морфология клеток была однородной длинной веретенообразной и похожей на фибробластную, а расположение регулярное (Рис. 1a). После 2 недель адрогенного дифференцирования hucMSC в цитоплазме формировались липидные капли, которые показывали структуру Кранца под инвертированным микроскопом (Рис. 1b), что указывает на то, что изолированные культивированные hucMSC имели способность к адрогенному дифференцированию. После 2 недель остеогенного дифференцирования под инвертированным микроскопом видели большое количество коричневых кальциевых нодулей (Рис. 1c), указывающее на то, что изолированные культивированные hucMSC имели способность к остеогенному дифференцированию. Потоковым цитометром тестировали иммунофенотип клеток, результаты включали то, что клетки сверхэкспрессировали поверхностные маркеры CD73, CD105 и CD166 МСХ (Рис. 1d).

Рис. 1. Морфология и идентификация hucMSC и hucMSC-Exos. a Морфология hucMSC под инвертированным микроскопом, b hucMSC протестирован ойл ред О окрашиванием. c hucMSC протестирован ЩФ окрашиванием. d Потоковая цитометрия использовалась для детектирования иммунофенотипа. e Форма и размер hucMSC-Exos, наблюдаемые через ТЭМ. f Детектирование распределения размера частиц экзосом с помощью анализа Nanosight. g Белковая экспрессия CD9, CD81 и CD63 в hucMSC-Exos детектирована вестерн-блоттингом

Морфологию hucMSC-Exos наблюдали ТЭМ, результаты показывали, что экзосомы были круглыми или овальными с низкой центральной плотностью и густым окрашиванием по бокам (Рис. 1e). Анализ Nanosight использовали для анализа размера частиц экзосом, результаты показывали, что размер частиц преимущественно распределялся между 40 и 100 нм, более концентрированно около 80 нм (Рис. 1f). Вестерн-блоттинг раскрыл, что все поверхностные маркеры CD81, CD63 и CD9 экспрессировались в hucMSC-Exos (Рис. 1g).

Восстановление miR-18b-3p ослабляет патологические характеристики крыс с ПЭ

Результаты САД и 24-часовой протеинурии показывали: существенной разницы в SAD и 24-часовой протеинурии в 6 группах до администрирования (10-й день беременности) не было. SAD и 24-часовая протеинурия на 19-й день беременности не показывали явной разницы у нормальных крыс. У крыс с ПЭ или крыс с ПЭ, леченных miR-NK, miR-18b-3p agomir, miR-18b-3p antagomir, miR-18b-3p antagomir + si-LEP, si-NK или si-LEP, SAD и 24-часовая протеинурия начинали повышаться на 13-й день беременности. В 16-й и 19-й день беременности у крыс с ПЭ, леченных miR-18b-3p agomir и si-LEP, не было явной разницы в SAD и 24-часовой протеинурии. Крысы с ПЭ имели повышенные SAD и 24-часовую протеинурию на 19-й день беременности; это повышение снижалось повышением miR-18b-3p, но усиливалось ингибированием miR-18b-3p; снижение LEP отменяло роль даун-регуляции miR-18b-3p в SAD и 24-часовой протеинурии на 19-й день беременности у крыс с ПЭ (Рис. 2a, b).

Рис. 2. Восстановление miR-18b-3p ослабляет патологические характеристики крыс с ПЭ. a Результаты SAD у крыс. b Результаты 24-часовой протеинурии у крыс. c Изменения массы плодных крыс. d Изменения массы плаценты у крыс. e Изменения воспалительных факторов в сыворотке детектированы ИФА. n = 10, *p < 0,05 относительно нормальной группы. ^p < 0,05 относительно группы ПЭ + miR-NK. @p < 0,05 относительно группы ПЭ + miR-18b-3p antagomir. &p < 0,05 относительно группы ПЭ + si-NK. Измерительные данные изображены как среднее ± стандартное отклонение, сравнения среди множества групп оценивали односторонним ANOVA с последующим тестом Тьюки

Масса плодной крысы и плаценты снижалась у крыс с ПЭ; ап-регуляция miR-18b-3p или даун-регуляция LEP увеличивали, в то время как даун-регуляция miR-18b-3p снижала массу плодной крысы и плаценты у крыс с ПЭ; silencing LEP обратил эффект ингибирования miR-18b-3p на массу плодной крысы и плаценты у крыс с ПЭ (Рис. 2c, d).

Воспалительные факторы в сыворотке крыс с ПЭ детектировали. Устанавливали, что содержание TNF-α, IL-1β и IL-6 повышалось у крыс с ПЭ; повышение miR-18b-3p или ингибирование LEP подавляли, в то время как снижение miR-18b-3p способствовало содержанию TNF-α, IL-1β и IL-6; эффект ингибированного miR-18b-3p на содержание TNF-α, IL-1β и IL-6 отменялся истощением LEP (Рис. 2e).

Сверхэкспрессированный miR-18b-3p улучшает гистопатологические изменения плацентарных тканей крыс с ПЭ

У нормальных крыс плацентарные хорионические ворсинки были богаты сосудами и имели четкую структуру, синциоти trobласты были основными трофобластами в хорионических ворсинках, а цитотробласты было меньше. У крыс с ПЭ или крыс с ПЭ, леченных miR-NK, miR-18b-3p antagomir, si-NK или miR-18b-3p antagomir + si-LEP, число хорионических ворсинок снижалось, структура была размытой и атродированной, некоторые ворсинки проходили фибриноидный некроз, а число синциотиробластных нодулов в хорионических ворсинках увеличивалось, и большинство ворсинок были незрелыми. Число трофоцитов снижалось, а патологические изменения ослаблялись у крыс с ПЭ, леченных miR-18b-3p agomir и si-LEP (Рис. 3a).

Рис. 3. Сверхэкспрессированный miR-18b-3p улучшает патологические изменения и подавляет а폽тотические клетки плацентарных тканей у крыс с ПЭ. a ГЕ-окрашивание использовалось для тестирования патологических признаков плацентарных тканей. b TUNEL-окрашивание реализовали для определения а폽тотических клеток плацентарных тканей у крыс с ПЭ. c Скорость а폽тоза клеток детектировалась TUNEL-окрашиванием. n = 10, *p < 0,05 относительно нормальной группы. ^p < 0,05 относительно группы miR-NK. @p < 0,05 относительно группы miR-18b-3p antagomir. &p < 0,05 относительно группы si-NK. Измерительные данные изображены как среднее ± стандартное отклонение, сравнения среди множества групп оценивали односторонним ANOVA с последующим тестом Тьюки

TUNEL-окрашивание предполагало, что небольшое количество а폽тотических клеток можно увидеть. Крысы с ПЭ имели увеличенные а폽тотические клетки, которые снижались повышением miR-18b-3p и silencing LEP, и усиливались ингибированием miR-18b-3p; silencing LEP также обратил эффект ингибирования miR-18b-3p на количество а폽тотических клеток у крыс с ПЭ (Рис. 3b, c).

В совокупности, крысы с ап-регулированным miR-18b-3p или ингибированным LEP имели сниженную степень прогрессирования ПЭ в гистологии, и silencing LEP мог отменить терапевтический эффект ингибированного miR-18b-3p.

miR-18b-3p даун-регулирован, в то время как LEP ап-регулирован в плацентарных тканях крыс с ПЭ и miR-18b-3p таргетирует LEP

Основываясь на вышеуказанных результатах, даун-регуляция LEP обратила терапевтический эффект даун-регуляции miR-18b-3p на крысах с ПЭ в патологии и гистологии; следовательно, мы предположили, что miR-18b-3p может быть связан с LEP.

Вестерн-блоттинг и RT-qPCR раскрыли, что крысы с ПЭ имели сниженные miR-18b-3p и повышенные уровни экспрессии LEP; лечение miR-18b-3p agomir ап-регулировало miR-18b-3p и даун-регулировало LEP у крыс с ПЭ, в то время как лечение miR-18b-3p antagomir повышало экспрессию LEP; silencing LEP обратило стимулирующий эффект снижения miR-18b-3p на экспрессию LEP у крыс с ПЭ (Рис. 4a–c).

Рис. 4. miR-18b-3p даун-регулирован и LEP ап-регулирован в плацентарных тканях крыс с ПЭ. a Экспрессия мРНК miR-18b-3p и LEP в плацентарных тканях детектирована RT-qPCR. b Белковая полоса LEP в плацентарных тканях. c Вестерн-блоттинг проведен для детектирования белковой экспрессии LEP в плацентарных тканях. d Экспрессия мРНК miR-18b-3p и LEP в плацентарных тканях после лечения экзосомами детектирована RT-qPCR. e Белковая полоса LEP в плацентарных тканях после лечения экзосомами. f Вестерн-блоттинг выполнен для детектирования белковой экспрессии LEP после лечения экзосомами. g Места связывания miR-18b-3p и LEP, предсказанные онлайн-программным обеспечением. h Целевая связь между miR-18b-3p и LEP верифицирована анализом двойного люциферазного репортерного гена. i Целевая связь между miR-18b-3p и LEP верифицирована RNA pull-down анализом. n = 10, *p < 0,05 относительно нормальной группы. ^p < 0,05 относительно группы miR-NK. @p < 0,05 относительно группы miR-18b-3p antagomir. &p < 0,05 относительно группы si-NK. #p < 0,05 относительно группы ПЭ. $p < 0,05 относительно группы ПЭ + Exos-antagomir NK. Измерительные данные изображены как среднее ± стандартное отклонение, сравнения среди множества групп оценивали односторонним ANOVA с последующим тестом Тьюки

Вестерн-блоттинг и RT-qPCR использовали для изучения роли экзосом при ПЭ у крыс. Результаты показывали, что экзосомы ап-регулировали miR-18b-3p и даун-регулировали LEP у крыс с ПЭ, указывая на подавляющий эффект экзосом на развитие ПЭ. Более того, экзосомы, переносящие miR-18b-3p antagomir, индуцировали даун-регуляцию miR-18b-3p и ап-регуляцию LEP у крыс с ПЭ (Рис. 4d–f).

Целевая связь между miR-18b-3p и LEP предсказывали биоинформатическим онлайн-программным обеспечением https://cm.jefferson.edu/ (Рис. 4g). Анализ двойного люциферазного репортерного гена предполагал, что miR-18b-3p мимик снижал люциферазную активность LEP 3′UTR-WT, в то время как не оказывал влияния на активность LEP 3′UTR-MUT (Рис. 4h). Более того, RNA pull-down анализ раскрыл, что обогащение LEP увеличивалось WT-биотинилированным miR-18b-3p (Рис. 4i). Эти находки указывали на то, что LEP является мишенью гена miR-18b-3p.

hucMSC-Exos ослабляют патологические характеристики крыс с ПЭ

Результаты SAD и 24 ч показывали, что существенной разницы в SAD и 24-часовой протеинурии в 5 группах до администрирования (10-й день беременности) не было. SAD и 24-часовая протеинурия на 19-й день беременности не показывали явной разницы у нормальных крыс. У крыс с ПЭ SAD и 24-часовая протеинурия начинали повышаться на 13-й день беременности. В 16-й и 19-й день беременности у крыс с ПЭ, леченных hucMSC-Exos и hucMSC-Exos, передающими antagomir NK, не было явной разницы в SAD и 24-часовой протеинурии. SAD и 24-часовая протеинурия повышались на 19-й день беременности в группе ПЭ, в то время как повышение снижалось инъекцией hucMSC-Exos. Ингибирование miR-18b-3p обратило эффект hucMSC-Exos на SAD и 24-часовую протеинурию на 19-й день беременности у крыс с ПЭ (Рис. 5a, b).

Рис. 5. hucMSC-Exos ослабляют патологические характеристики крыс с ПЭ. a Результаты SAD у крыс после лечения экзосомами. b Результаты 24-часовой протеинурии у крыс после лечения экзосомами. c Изменения массы плодных крыс после лечения экзосомами. d Изменения массы плаценты у крыс после лечения экзосомами. e Изменения воспалительных факторов после лечения экзосомами в сыворотке определены ИФА. n = 10, *p < 0,05 относительно нормальной группы. #p < 0,05 относительно группы ПЭ. $p < 0,05 относительно группы ПЭ + Exos-antagomir NK. Измерительные данные изображены как среднее ± стандартное отклонение, сравнения среди множества групп оценивали односторонним ANOVA с последующим тестом Тьюки

Массу плодной крысы и плаценты измеряли, и находили, что крысы с ПЭ имели сниженную массу плодной крысы и плаценты; даун-регуляция miR-18b-3p отменила роль hucMSC-Exos в массе плодной крысы и плаценты у крыс с ПЭ (Рис. 5c, d).

Воспалительные факторы в сыворотке детектировали ИФА. Содержание TNF-α, IL-1β и IL-6 заметно повышалось у крыс с ПЭ. Лечение экзосомами снижало содержание TNF-α, IL-1β и IL-6 в сыворотке крыс с ПЭ, которые повышались инъекцией экзосом, ингибирующих miR-18b-3p (Рис. 5e).

Экзосомы улучшают патологические изменения и ингибируют а폽тоз плацентарных тканей крыс с ПЭ

У нормальных крыс плацентарные хорионические ворсинки были обильны сосудами с четкой структурой, синциотиробласты были основными трофобластами в хорионических ворсинках, а цитотробластов было меньше. В крысах с ПЭ и крысах с ПЭ, леченных hucMSC-Exos-miR-18b-3p-antagomir, число хорионических ворсинок снижалось, структура была размытой и атродированной, некоторые ворсинки представлены фибриноидным некрозом, а число синциотиробластных нодулов в хорионических ворсинках повышалось, и большинство ворсинок были незрелыми. Патологическое изменение улучшалось у крыс с ПЭ, леченных hucMSC-Exos или hucMSC-Exos-antagomir NK относительно крыс с ПЭ и крыс с ПЭ, леченных hucMSC-Exos-miR-18b-3p antagomir (Рис. 6a).

Рис. 6. Экзосомы улучшают патологические изменения и снижают а폽тотические клетки плацентарных тканей у крыс с ПЭ. a ГЕ-окрашивание использовалось для тестирования патологических признаков плацентарных тканей у крыс с ПЭ после лечения экзосомами. b TUNEL-окрашивание реализовали для определения а폽тотических клеток плацентарных тканей у крыс с ПЭ после лечения экзосомами. c Скорость а폽тоза клеток детектировалась TUNEL-окрашиванием. n = 10, *p < 0,05 относительно нормальной группы. #p < 0,05 относительно группы ПЭ. $p < 0,05 относительно группы ПЭ + Exos-antagomir NK. Измерительные данные изображены как среднее ± стандартное отклонение, сравнения среди множества групп оценивали односторонним ANOVA с последующим тестом Тьюки

TUNEL-окрашивание указывало, что у нормальных крыс можно увидеть небольшое количество а폽тотических клеток. Крысы с ПЭ имели усиленные а폽тотические клетки, и сниженный miR-18b-3p обратил влияние hucMSC-Exos на количество а폽тотических клеток в плацентарных тканях от крыс с ПЭ (Рис. 6b, c).

Обсуждение

ПЭ — это мультисистемное расстройство беременности, характеризующееся протеинурией и либо высоким артериальным давлением, либо другими неблагоприятными условиями, и связанное с широким спектром материнской эндотелиальной дисфункции [20]. Сообщалось, что hucMSC-Exo улучшали морфологию плацентарных тканей у крыс с ПЭ через подавление аоптоза клеток и стимуляцию ангиогенеза в плацентарных тканях доза-зависимым образом [8]. Исследование сообщало, что экспрессия miR-18b влияла на миграцию, живучесть и инвазию клеток при ПЭ [12]. Более того, верифицировали повышенную материнскую концентрацию LEP и гипометилирование LEP в плаценте при раннем возникновении ПЭ [21]. Текущее исследование спроектировано для изучения эффекта экзосом и miR-18b-3p, таргетирующего LEP, на возникновение ПЭ. Находки в этом исследовании раскрыли, что экзосомальный miR-18b-3p, полученный из hucMSC, ингибировал прогрессирование ПЭ снижением LEP.

Основываясь на наших находках, miR-18b-3p снижался, а LEP повышался в плацентарных тканях крыс с ПЭ. Похоже на наше исследование, мРНК экспрессия miR-18b была заметно подавлена в плацентарных тканях с ПЭ относительно нормальных плацентарных тканей [12]. Кроме того, исследование раскрыло, что содержание miR-18b было драматически снижено в тканях злокачественного меланомы в сравнении с их соответствующими смежными неопухолевыми тканями [22]. Другое исследование подтвердило, что плацентарная экспрессия LEP была повышена при предсрочной ПЭ по сравнению с контролями [23]. Более того, исследование показало, что экспрессия LEP очевидно повышалась в преэкламптических плацентах [15]. Эта литература предоставила теоретическую базу для нас для изучения аномальной экспрессии miR-18b-3p и LEP при ПЭ. Более того, предсказали с помощью биоинформатического ПО, что LEP таргетируется miR-18b-3p, и эта целевая связь была дополнительно подтверждена анализом двойного люциферазного репортерного гена в нашем исследовании. Исследование сообщило, что LEP является мишенью для всех трех микРНК (miR-1301, miR-223 и miR-224) при раннем возникновении ПЭ [16]. Другое исследование показало, что LEP снижал экспрессию miR-93 при остеоартрите и ревматоидном артрите [24]. Однако связывание между miR-18b-3p и LEP в человеческих заболеваниях, особенно при ПЭ, остается малоизученным, что является новизной этого исследования. Более того, результат, вытекающий из нашего исследования, сообщил, что экзосомы повышали miR-18b-3p и снижали LEP в плацентарных тканях ПЭ. Ранее документировали, что экспрессия miR-18b-5p заметно повышалась в экзосомах плазмы при раке толстой кишки [25], в то время как связь между hucMSC-Exos и miR-18b-3p/LEP при ПЭ требует дальнейшего исследования.

Дополнительно, находка из нашего исследования показала, что восстановленный miR-18b-3p снижал SAD и 24-часовую протеинурию крыс с ПЭ, увеличивал массу плаценты, снижал содержание TNF-α, IL-1β и IL-6 в сыворотке и плацентарных тканях, а также подавлял а폽тоз клеток. Эти данные указывали на то, что повышение miR-18b-3p способствует ослаблению симптомов и патологических изменений при ПЭ. Демонстрировали, что стабильная ап-регуляция miR-18b производила эффективную активность ингибитора опухоли, такую как ингибирование живучести клеток меланомы, индуцирование а폽тоза и снижение роста опухоли in vivo [26]. Другой результат в нашем исследовании был тем, что hucMSC-Exos снижали SAD и 24-часовую протеинурию крыс с ПЭ, увеличивали массу плаценты, снижали содержание TNF-α, IL-1β и IL-6 в сыворотке и плацентарных тканях, а также подавляли а폽тоз клеток. Находки текущего исследования раскрыли, что модели ПЭ крыс, леченные экзосомами, представили увеличение числа и качества плодов, качества плаценты, но а폽тоз клеток был значительно снижен [8]. Интересно, предшествующее исследование продемонстрировало, что добавление фетальных бычьих экзосом снижало содержание макрофажного TNF-α и IL-6 [27]. Исследование раскрыло, что очищенные экзосомы подавляли производство IL-1β в макрофажах, стимулированных липополисахаридом/нигерицином [28]. Более того, Нонг и соавт. предположили, что воспалительные маркеры, такие как TNF-α и IL-6, драматически снижались после администрирования экзосом, произведенных через человеческие индуцированные плюрипотентные стволовые клетки-МСХ [29]. Есть статья, находившая, что SAD было заметно повышено в группе женщин, которые позже развили ПЭ [30, 31]. Показывали, что пациенты с ПЭ позитивно ассоциированы с SAD и диастолическим артериальным давлением и протеинурией [32]. Также недавнее исследование предоставило доказательство, что протеинурия повышалась с продвижением беременности у женщин с ПЭ [33]. Важная находка была тем, что крысы из группы ПЭ имели повышенный TNF-α относительно нормальной беременной группы [34]. Другое исследование подтвердило, что сывороточный IL-6 и IL-1β очевидно повышались у женщин с ПЭ относительно контрольных [35]. Вышеуказанные находки предполагали, что пациенты с ПЭ обычно показывают высокий SAD, протеинурию и уровни воспалительных факторов. Таким образом, из наших результатов можно заключить, что экзосомальный miR-18b-3p, полученный из hucMSC, имел терапевтический эффект на ПЭ.

Заключение

Подводя итог, наше исследование предоставляет доказательства того, что экзосомы, полученные из hucMSC, ап-регулируют miR-18b-3p, который таргетирует LEP для подавления содержания воспалительных факторов и снижения скорости а폽тоза клеток в плацентарных тканях крыс с ПЭ, тем самым ингибируя возникновение ПЭ. Таким образом, экзосомальный miR-18b-3p может быть потенциальным кандидатом для лечения ПЭ через таргетирование LEP. Это исследование впервые идентифицировало роль экзосомального miR-18b-3p, полученного из hucMSC, таргетирующего LEP при развитии ПЭ, что предоставило новое понимание для лечения ПЭ. Однако, из-за ограничения известных исследований, исследование должно быть строго мониторировано и соответствующе отчитываться в будущих клинических испытаниях.