Экзосомная микроРНК-18b-3p, полученная из мезенхимальных стволовых клеток пуповины человека, подавляет возникновение преэклампсии, воздействуя на LEP

Введение

Преэклампсия (ПЭ), характеризующаяся протеинурией и гипертонией [1], является основной причиной материнской и материнской смертности и заболеваемости при беременности человека [2]. Этиология и патогенез ПЭ не ясны [3], которая, как сообщается, связана с аномальной инвазией трофобластов, приводящей к дисфункции эндотелия у матери, хронической недостаточности перфузии плаценты и гипертонии с неблагоприятными исходами [4]. За исключением родов плода и плаценты, специфической терапии ПЭ не существует [5]. Поэтому необходимо срочно изучить терапевтические цели, чтобы улучшить прогноз этого заболевания.

Пуповина человека (huc) является подходящим источником мезенхимальных стволовых клеток (МСК), которые секретируют множество трофических факторов и цитокинов, а также обладают сильными противовоспалительными и иммуномодулирующими свойствами [6]. Исследование подтвердило, что PE ускоряет экспрессию нейроглиальных маркеров в MSCs Wharton пуповинного желе [7]. Сообщалось также о защитном эффекте экзосом hucMSCs (Exos) на морфологию плаценты и ангиогенез у PE крыс [8]. Экзосомы представляют собой небольшие (50–100 нм) секреторные везикулы, которые обеспечивают связь между клетками в микроокружении опухоли посредством инкапсуляции и передачи канцерогенных факторов в отдаленные участки или окружающие клетки посредством циркуляции [9]. Исследование выявило повреждение функций сосудов и осложнения, вызванные эффективным переносом sFlt-1 и sEng в эндотелиальные клетки у пациентов с ПЭ с помощью экзосом [10]. МикроРНК (миРНК) представляют собой эндогенные некодирующие РНК длиной 18–25 нуклеотидов и регулируют экспрессию гена на посттранскрипционном уровне [11]. Данные исследования показали, что экспрессия miR-18b влияет на клеточную инвазию, жизнеспособность и миграцию клеток трофобласта при PE [12]. Кроме того, Wu et al. предположили, что miR-18b ослабляет пролиферацию эндотелиальных клеток сетчатки человека, индуцированную высоким содержанием глюкозы, что может предложить новое понимание механизма патогенеза диабетической ретинопатии [13]. Однако роль происходящей из hucMSC экзосомальной miR-18b-3p в PE остается неизвестной. Лептин (LEP) оказывает плейотропное действие на дифференцировку / пролиферацию клеток и иммунитет к физиологическим состояниям и в основном выделяется из адипоцитов в дополнение к другим тканям, включая плаценту [14]. Исследование подтвердило, что аномальное метилирование промотора LEP участвует в прогрессии PE [15]. Другое исследование показало, что плацента является основным местом экспрессии LEP во время беременности [16]. Тем не менее, связь связывания между miR-18b-3p и LEP все еще неуловима. Таким образом, мы стремились изучить роль происходящей из hucMSC экзосомальной miR-18b-3p в ПЭ с участием LEP, и мы пришли к выводу, что происходящая из hucMSC экзосомная miR-18b-3p может ингибировать прогрессию PE посредством нацеливания на LEP.

Материалы и методы

Этическое одобрение

Исследование было одобрено институциональным наблюдательным советом Народной больницы Уханьского университета. Все участники подписали документ об информированном согласии. Все эксперименты на животных проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных Международного комитета Народной больницы Уханьского университета.

Изолированность, культура и идентификация HucMSC

Пуповину плода, доставленную здоровым родильницей, собирали, нарезали на фарш и фильтровали через сито, затем смешивали с фосфатно-солевым буфером (PBS). Ткани пуповины центрифугировали при 1500 об / мин в течение 5 мин с радиусом центрифуги 10 см. Ткани суспендировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) / F12, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (FBS), и переносили в колбу для культивирования. Жидкости меняли через 4 дня, а затем меняли каждые 3 дня. Клетки субкультивировали, когда конфлюэнтность достигала около 90%. Адгезивный рост и морфологию hucMSCs наблюдали под световым микроскопом. Клетки окрашивали окрашивающим раствором масляным красным О (Beyotime Institute of Biotechnology, Шанхай, Китай) для выявления остеогенной дифференцировки hucMSC и окрашивали окрашивающим раствором щелочной фосфатазы (ALP) (Beyotime) для выявления адипогенной дифференцировки hucMSC. Проточный цитометр (Beckman Coulter Life Sciences, Бреа, Калифорния, США) был адаптирован для тестирования CD73, CD166 (оба 1:10, BD Biosciences, Франклин Лейкс, Нью-Джерси, США) и CD105 (1:20, AbD Serotec, Оксфорд, США). Великобритания).

Извлечение и идентификация HucMSC-Exos

Выращивали хорошо растущие hucMSC. Супернатант собирали и центрифугировали при 28 500 об / мин в течение 1 ч с радиусом центрифуги 10 см. Супернатант отбрасывали, клетки фиксировали 2% глутаровым альдегидом и 1% осмиевой кислоты, дегидратировали этанолом, погружали в оксид пропилена, сушили в течение 2 часов, заливали Epon812 и нарезали ломтиками. Срезы окрашивали ураном и свинцом соответственно. Наконец, экзосомы наблюдали под электронным микроскопом. Детектор Nanosight (Malvern Instruments, Малверн, Великобритания) использовался для обнаружения броуновского движения наночастиц экзосом и их размера. Поверхностные маркеры hucMSC-Exos были идентифицированы с помощью вестерн-блоттинга, и результаты показали, что hucMSC-Exos экспрессирует CD9, CD81 и CD63.

Метод заражения лентивирусом

HucMSC инфицировали лентивирусом, содержащим низкую экспрессию вектора miR-18b-3p и низкую экспрессию отрицательного контроля (NC) вектора miR-18b-3p (Shanghai GenePharma Co, Ltd, Шанхай, Китай). Наконец, были получены стабильно экспрессируемые NC hucMSC-антагомир и антагомир hucMSC-miR-18b-3p. Клетки культивировали в течение 48 часов, супернатант собирали и центрифугировали с ультрацентрифугированием, чтобы получить соответствующий экзос-антагомир NC и экзос-miR-18b-3p антагомир.

Экспериментальные животные

Были отобраны крысы Wistar (массой 200–250 г, возрастом 8 недель, независимо от пола) по здоровому уровню и половой зрелости (Центр экспериментальных животных Уханьского университета, Ухань, Китай). Крыс кормили в барьерной системе с температурой 18–28 ° C, относительной влажностью 40–70% и адекватным питанием и водой.

Создание моделей Rat PE

Модель ПЭ у крыс была создана путем внутрибрюшинной инъекции 50 мг / кг ингибитора синтетазы оксида азота, метилового эфира N (G) -нитро-1-аргинина (L-NAME, Beyotime) со ссылкой на статью [17]. Успешное создание модели ПЭ было основано на повышении артериального давления с 20 мм рт.ст. и выше 115 мм рт.ст., а также усилении протеинурии.

Группировка животных

Самка крысы и самец случайным образом проживали вместе в соотношении 1:1, и две крысы содержались в отдельной специальной клетке в 17–18 часов. предыдущий день. Сперму в вагинальном секрете самок крыс наблюдали с помощью вагинальной пробки и микроскопа на следующий день. Если результат был положительным в то же время, этот день записывали как 0-й день беременности. С 13-го ^rd В день беременности крысы были разделены на 6 групп (по 10 крыс в каждой группе):нормальная группа (такое же количество физиологического раствора вводили внутрибрюшинно с 13 по 20 день беременности), группа PE (L-NAME [50 мг / кг в день] вводили внутрибрюшинно с 13 по 20 день беременности, а 20 мкл физиологического раствора вводили в плаценту с 16 по 19 день беременности), группа PE + miR-NC (L-NAME [50 мг / кг в день] вводили внутрибрюшинно с 13 по 20 день беременности, и 20 мкл 4 нмоль miR-NC вводили в плаценту с 16 по 19 день беременности), PE + miR-18b-3p группа агомира (L-NAME [50 мг / кг в день] вводили внутрибрюшинно с 13 по 20 день беременности, а 20 мкл агомира miR-18b-3p 4 нмоль вводили в плаценту с 16 по 19 день беременности) , Группа антагомира PE + miR-18b-3p (L-NAME [50 мг / кг в день] вводили внутрибрюшинно с 13 по 20 день беременности, а 20 мкл 4 нмоль антагомира miR-18b-3p вводили в п Lacenta с 16 по 19 день беременности), PE + miR-18b-3p антагомир + небольшая интерферирующая РНК (si) -LEP группе (L-NAME [50 мг / кг в день] вводили внутрибрюшинно с 13 по 20 день. беременности, и 20 мкл 4 нмоль антагомира miR-18b-3p и si-LEP вводили в плаценту на 16-19 день беременности) и группе PE + si-LEP (L-NAME [50 мг / кг на день] вводили внутрибрюшинно с 13 по 20 день беременности, а 20 мкл 4 нмоль si-LEP вводили в плаценту с 16 по 19 день беременности). Крыс лечили экзосомами и экзосомами, несущими лентивирусы. Крысы были разделены на 5 групп (по 10 крыс в каждой группе):нормальная группа (такое же количество физиологического раствора вводили внутрибрюшинно с 13 по 20 день беременности), группа PE (L-NAME (50 мг / кг в день). ) вводили внутрибрюшинно с 13 по 20 день беременности, а 20 мкл физиологического раствора вводили в плаценту с 16 по 19 день беременности), группа PE + Exos (L-NAME (50 мг / кг в день) вводили внутрибрюшинно с 13 по 20 день беременности, и 20 мкл Exos (80 мкг экзосом суспендировали в 20 мкл физиологического раствора) вводили в плаценту с 16 по 19 день беременности), PE + Exos-antagomir NC группе (L-NAME (50 мг / кг в день) вводили внутрибрюшинно с 13 по 20 день беременности, и 20 мкл экзос-антагомира NC (80 мкг экзосом суспендировали в 20 мкл физиологического раствора) вводили в плаценту. с 16 по 19 день беременности) и группе антагомира PE + Exos-miR-18b-3p (L-NAME (50 мг / кг в день) вводили внутрибрюшинно с 13 дня на 20-й день гестации и 20 мкл антагомира Exos-miR-18b-3p (80 мкг экзосом суспендировали в 20 мкл физиологического раствора) вводили в плаценту на 16-19-й день беременности).

Определение систолического артериального давления (САД) и определение 24-часовой протеинурии

Давление у крыс измеряли путем измерения артериального давления в хвостовой артерии крыс. САД в хвостовой манжете всех беременных крыс измеряли на 10, 13, 16 и 19 день беременности с использованием детектора давления в хвостовой артерии крысы (Tensys® Medical Inc., Сан-Диего, Калифорния, США). Давление было измерено 3 раза за короткое время; затем за артериальное давление принималось среднее значение.

В случае бесплатного питания и воды суточная моча беременных крыс собиралась на 10, 13, 16 и 19 день беременности, а содержание белка определялось в нефрологическом отделении Народной больницы Уханьского университета.

Образец коллекции

Беременных крыс анестезировали 3% пентобарбиталом натрия на 21-й день беременности. Периферическую кровь крыс консервировали, центрифугировали для взятия сыворотки и хранили в холодильнике при -20 ° C для ожидания. Затем плод крысы и плаценту извлекали путем кесарева сечения, плодную оболочку и соединенную пуповину удаляли, и пуповину, соединенную с плодом крысы, отрезали. Плаценту и плод крысы помещали на асептическую марлю для сушки крови и околоплодных вод соответственно, а затем помещали на аналитические весы для взвешивания веса. Одна часть тканей плаценты была зафиксирована 4% параформальдегидом, дегидратирована этанолом, очищена ксилолом, залита парафином и подвергнута непрерывному поперечному срезу (5 мкм) для окрашивания гематоксилин-эозином (HE) и терминального дезоксинуклеотидилтрансферазо-опосредованного дезоксиуридинтрифосфат-биотина. окрашивание по метке конца никеля (TUNEL). Остальные хранили при -80 ° C для определения количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (RT-qPCR), вестерн-блоттинга и иммуноферментного анализа (ELISA).

ELISA

Содержание фактора некроза опухоли-α (TNF-α), интерлейкина (IL) -1β и IL-6 в сыворотке крови исследовали с помощью ELISA. Концентрации TNF-α, IL-1 и IL-6 определяли в соответствии с инструкциями набора (R&D Systems, Миннеаполис, Миннесота, США). Значения оптической плотности (OD) (490 нм) тестировали с помощью считывающего устройства для микропланшетов (Thermo Fisher Scientific, MA, США). Соответствующая стандартная кривая была получена с использованием значения OD в качестве абсциссы и концентрации соответствующего стандартного образца в качестве ординаты. Концентрации TNF-α, IL-1β и IL-6 рассчитывались по стандартной кривой.

Окрашивание HE

Образцы парафина тканей плаценты очищали в ксилоле, обезвоживали обычным градиентным спиртом, окрашивали гематоксилином, дифференцировали 1% -ным спиртом соляной кислоты и возвращали в голубой цвет 1% -ным раствором аммиачной воды. Затем ткани контрастировали 1% раствором эозина, обезвоживали (75%, 90%, 95% этанол, соответственно, абсолютный этиловый спирт) и очищали ксилолом, сушили, блокировали и наблюдали под электронным микроскопом.

Окрашивание TUNEL

Залитые парафином срезы обычно депарафинизировали и обезвоживали в соответствии с инструкциями, а затем апоптоз выявляли с помощью набора TUNEL (Nanjing Kejin Biotechnology Co., Ltd., Цзянсу, Китай). 4,6-Диамино-2-фенилиндол (Shanghai Baitai Biotechnology Co., Ltd., Шанхай, Китай) использовали для наблюдения TUNEL-положительных клеток с помощью флуоресцентного микроскопа (Nikon, Токио, Япония) [18].

RT-qPCR

Ткани плаценты взвешивали. На 50–100 мг тканей плаценты добавляли 1 мл TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) и полностью растворяли. К тканям добавляли 200 мкл хлороформа и центрифугировали при 4 ° C, 12000 об / мин для экстракции общей РНК. Концентрацию и чистоту РНК определяли на спектрофотометре нуклеиновых кислот белка DU-800 (Beckman). U6 и β-актин использовали в качестве контроля загрузки. Праймеры для ПЦР были разработаны и составлены компанией Shanghai Sangon Biotechnology Co. Ltd. (Шанхай, Китай). Последовательности праймеров перечислены в таблице 1. РНК была преобразована в кДНК на основе инструкций набора для обратной транскрипции РНК (Sangon). ПЦР амплифицировали, и продукты проверяли электрофорезом в агарозном геле. Данные были рассчитаны с помощью 2 ^−ΔΔCt метод.

Вестерн-блоттинг

Общий белок тканей плаценты экстрагировали с помощью буфера для лизиса клеток для анализа радиоиммунопреципитации (Beyotime). HucMSC-Exo использовали для извлечения буфера, который центрифугировали при 14000 об / мин. Супернатант сохраняли для тестирования экспрессии белка экзосомального маркерного белка (CD81, CD63 и CD9) в сыворотке. Концентрацию белка определяли с помощью набора бицинхониновой кислоты (Beyotime, P0010). Образец загружали в соответствии с количественными результатами белка, обрабатывали электрофорезом в 10% -ном додецилсульфат-полиакриламидном геле и переносили на мембрану. Мембрану блокировали 5% обезжиренным молоком, зондировали первичными антителами LEP, CD63, CD81, CD9 и β-актином (4 мл, 1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Inc, Санта-Крус, Калифорния, США), повторно зондировали с 4 мл вторичных антител козы против кроличьего IgG / пероксидазы хрена, экспонирование и проявление. β-Актин использовался в качестве внутреннего стандарта. Значение серого анализировали с помощью программного обеспечения для гель-графического анализа Image Lab.

Анализ репортерного гена с двойной люциферазой

Программное обеспечение для онлайн-прогнозирования https://cm.jefferson.edu/ было адаптировано для прогнозирования целевого отношения между miR-18b-3p и LEP, а также сайта связывания miR-18b-3p и 3'-нетранслируемой области LEP (UTR ). Была составлена ​​последовательность промоторной области LEP 3'UTR, содержащая сайт связывания miR-18b-3p. Были сконструированы плазмида LEP 3'UTR дикого типа (WT) и мутантный тип LEP 3'UTR (MUT). Рекомбинантные плазмиды были названы LEP 3'UTR-WT и LEP 3'UTR-MUT соответственно. Культивированные клетки 293T котрансфицировали миметиком miR-18b-3p и миметиком LEP 3′UTR-WT, миметиком miR-18b-3p и миметиком LEP 3′UTR-MUT, миметиком NC и LEP 3′UTR-WT, миметиком NC и ЛЭП 3'УТР-МУТ на 30 ч. Затем были собраны клетки 293T. Активность люциферазы светлячков и рениллы в клетках измеряли с помощью измерений люминесценции в соответствии с набором для обнаружения репортерного гена двойной люциферазы (Promega, Мэдисон, Висконсин, США).

Анализ РНК с понижением давления

Биотинилированные РНК-зонды (Bio-miR-NC, Bio-miR-18b-3p и Bio-miR-18b-3p-Mut) инкубировали с лизатом клеток 293T и экстрагировали с использованием магнитных шариков, конъюгированных с антибиотиком стрептомицином. Эксперимент проводился в соответствии с инструкциями наборов для раскрытия магнитной РНК Pierce (Pierce, IL, USA). РНК элюировали и очищали с использованием TRIzol (Pierce). Обогащение LEP комплексом РНК количественно оценивали с помощью RT-qPCR, как описано ранее [19].

Статистический анализ

Все данные были эксплицированы с помощью программного обеспечения SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, США). Данные измерений были указаны как среднее ± стандартное отклонение. Данные были получены по независимой выборке t тест для сравнения двух групп, тогда как сравнения между несколькими группами оценивали с помощью одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим апостериорным тестом Тьюки. Критерий статистической значимости был установлен на уровне p <0,05.

Результаты

Морфология и идентификация HucMSC и HucMSC-Exos

Массы ткани пуповины наблюдали под инвертированным микроскопом. Видно, что клетки выползали из тканевой массы на 3-е сутки; клетки проявляли форму веретена и нитевидность, а также росли как колония примерно через 5 дней. При культивировании до пассажа 3 морфология клеток была однородной, длинной веретенообразной и сходной с морфологией фибробластов, а расположение было правильным (рис. 1а). После 2 недель адипогенной дифференцировки hucMSC в цитоплазме образовались липидные капли, и липидные капли показали структуру Кранца под инвертированным микроскопом (рис. 1b), что позволяет предположить, что изолированный культивированный hucMSC обладал способностью адипогенной дифференцировки. Через 2 недели после остеогенной дифференцировки большое количество коричневых кальциевых узелков можно было увидеть под инвертированным микроскопом (рис. 1c), что указывает на то, что изолированные культивируемые hucMSC обладают способностью к остеогенной дифференцировке. Проточный цитометр был адаптирован для проверки иммунофенотипа клеток, и результаты показали, что клетки сверхэкспрессируют поверхностный маркер CD73, CD105 и CD166 МСК (рис. 1d).

Морфология и идентификация hucMSC и hucMSC-Exos. а Морфология hucMSC под инвертированным микроскопом, b hucMSC тестировали путем окрашивания масляным красным О. c hucMSC тестировали окрашиванием ALP. г Для определения иммунофенотипа использовали проточную цитометрию. е Форма и размер hucMSC-Exos, наблюдаемые с помощью ПЭМ. е Обнаружение гранулометрического состава экзосом с помощью анализа Nanosight. г Экспрессия белков CD9, CD81 и CD63 в hucMSC-Exos была обнаружена с помощью вестерн-блоттинга

Морфологию hucMSC-Exos наблюдали с помощью ПЭМ, и результаты показали, что экзосомы были круглыми или овальными с низкой центральной плотностью и густым окрашиванием с обеих сторон (рис. 1e). Для анализа размера частиц экзосом использовался анализ с помощью нанозрения, и результаты показали, что размер частиц в основном распределялся между 40 и 100 нм, более концентрированным около 80 нм (рис. 1f). Вестерн-блоттинг показал, что все поверхностные маркеры CD81, CD63 и CD9 экспрессируются в hucMSC-Exos (рис. 1g).

Восстановление miR-18b-3p снижает патологические характеристики крыс с PE

Результаты САД и 24-часовой протеинурии показали, что:не было существенной разницы в САД и 24-часовой протеинурии в 6 группах до введения (10-й день беременности). САД и 24-часовая протеинурия на 19-й день беременности не показали очевидных различий у нормальных крыс. У PE крыс или PE крыс, получавших miR-NC, miR-18b-3p агомир, miR-18b-3p антагомир, miR-18b-3p антагомир + si-LEP, si-NC или si-LEP, SBP и 24 ч. протеинурия стала нарастать на 13-й день беременности. Не было четкой разницы в уровне САД и 24-часовой протеинурии на 16-й и 19-й день беременности у крыс с PE, получавших агомир miR-18b-3p и si-LEP. Крысы PE имели повышенное САД и 24-часовую протеинурию на 19-й день беременности; это увеличение снижалось за счет повышения miR-18b-3p, но дополнительно усиливалось ингибированием miR-18b-3p; Снижение LEP отменяет роль подавления miR-18b-3p в SBP и 24-часовой протеинурии на 19 день беременности у крыс с PE (рис. 2a, b).

Восстановление miR-18b-3p снижает патологические характеристики крыс с PE. а Результаты САД у крыс. б Результаты суточной протеинурии у крыс. c Изменение веса плодов крысы. г Изменение веса плаценты у крыс. е Изменения воспалительных факторов в сыворотке крови выявляли с помощью ИФА. нет =10, * p <0,05 по сравнению с нормальной группой. ^ p <0,05 по сравнению с группой PE + miR-NC. ^@ p <0,05 по сравнению с группой антагомира PE + miR-18b-3p. ^& p <0,05 по сравнению с группой PE + si-NC. Данные измерений были представлены как среднее ± стандартное отклонение, а сравнения между несколькими группами оценивались с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим тестом Тьюки

У крыс PE снизилась масса плода крысы и плаценты; повышенная регуляция miR-18b-3p или пониженная регуляция LEP увеличивалась, тогда как пониженная регуляция miR-18b-3p снижала вес плода крысы и плаценты у крыс PE; Подавление LEP обратило вспять эффект ингибирования miR-18b-3p на вес плода крысы и плаценты у крыс PE (рис. 2c, d).

Воспалительных факторов в сыворотке крови крыс PE не обнаружено. Было обнаружено, что содержание TNF-α, IL-1β и IL-6 увеличивалось у крыс PE; Повышение miR-18b-3p или ингибирование LEP подавлялось, тогда как уменьшение miR-18b-3p способствовало содержанию TNF-α, IL-1β и IL-6; Эффект ингибированной miR-18b-3p на содержание TNF-α, IL-1β и IL-6 был отменен истощением LEP (рис. 2e).

Избыточная экспрессия miR-18b-3p улучшает гистопатологические изменения тканей плаценты у крыс с PE

У нормальных крыс ворсинки плаценты были богаты кровеносными сосудами и имели четкую структуру, синцитиотрофобласты были основными трофобластами в ворсинах плаценты, а цитотрофобластов было меньше. У крыс PE или крыс PE, получавших miR-NC, miR-18b-3p антагомир, si-NC или miR-18b-3p антагомир + si-LEP, количество ворсин плаценты уменьшилось, структура была размытой и атрофированной, некоторые ворсинки был проведен фибриноидный некроз, и количество узелков синцитиотрофобластов в ворсинах плаценты увеличилось, и большинство ворсинок были незрелыми. Количество трофоцитов было уменьшено, и патологические изменения были облегчены у крыс с PE, получавших агомир miR-18b-3p и si-LEP (рис. 3a).

Сверхэкспрессия miR-18b-3p улучшает патологические изменения и подавляет апоптотические клетки тканей плаценты у PE крыс. а Окрашивание HE использовали для проверки патологических свойств тканей плаценты. б Окрашивание TUNEL применяли для определения апоптотических клеток тканей плаценты у крыс PE. c Скорость апоптоза клеток определяли окрашиванием TUNEL. нет =10, * p <0,05 по сравнению с нормальной группой. ^ p <0,05 по сравнению с группой miR-NC. ^@ p <0,05 по сравнению с группой антагомира miR-18b-3p. ^& p <0,05 по сравнению с группой si-NC. Данные измерений были представлены как среднее ± стандартное отклонение, а сравнения между несколькими группами оценивались с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим тестом Тьюки

Окрашивание TUNEL показало, что можно было увидеть небольшое количество апоптотических клеток. Крысы PE имели повышенное количество апоптозных клеток, которое снижалось за счет повышения miR-18b-3p и подавления LEP, и дополнительно усиливалось ингибированием miR-18b-3p; Подавление LEP также обращает вспять эффект ингибирования miR-18b-3p на количество апоптотических клеток у PE крыс (рис. 3b, c).

Взятые вместе, крысы с повышенной регуляцией miR-18b-3p или ингибированным LEP имели пониженную степень прогрессирования PE в гистологии, а замалчивание LEP могло отменить терапевтический эффект ингибированного miR-18b-3p.

miR-18b-3p подавляется, в то время как LEP активируется в тканях плаценты PE крысы, а miR-18b-3p нацеливается на LEP

Основываясь на приведенных выше результатах, подавление LEP обращало терапевтический эффект подавления miR-18b-3p на крыс с PE в патологии и гистологии; Таким образом, мы предположили, что miR-18b-3p может быть связана с LEP.

Вестерн-блоттинг и RT-qPCR показали, что у крыс PE снизились уровни экспрессии miR-18b-3p и увеличились уровни экспрессии LEP; обработка агомиром miR-18b-3p активировала miR-18b-3p и подавляла LEP у крыс PE, тогда как обработка антагомира miR-18b-3p увеличивала экспрессию LEP; Подавление LEP обращает вспять промоторный эффект снижения miR-18b-3p на экспрессию LEP у крыс PE (рис. 4a – c).

miR-18b-3p подавляется, а LEP активируется в тканях плаценты крыс PE. а Экспрессию мРНК miR-18b-3p и LEP в тканях плаценты определяли с помощью RT-qPCR. б Белковая полоса LEP в тканях плаценты. c Был проведен вестерн-блоттинг для определения экспрессии белка LEP в тканях плаценты. г Экспрессию мРНК miR-18b-3p и LEP в тканях плаценты после обработки экзосом выявляли с помощью RT-qPCR. е Белковая полоса LEP в тканях плаценты после обработки экзосомами. е Проводили вестерн-блоттинг для обнаружения экспрессии белка LEP после обработки экзосом. г Сайты связывания miR-18b-3p и LEP рассчитаны с помощью онлайн-программного обеспечения. ч Целевые отношения между miR-18b-3p и LEP подтверждены анализом двойного люциферазного репортерного гена. я Направляющая взаимосвязь между miR-18b-3p и LEP подтверждена анализом РНК с понижением. нет =10, * p <0,05 по сравнению с нормальной группой. ^ p <0,05 по сравнению с группой miR-NC. ^@ p <0,05 по сравнению с группой антагомира miR-18b-3p. ^& p <0,05 по сравнению с группой si-NC. ^# p <0,05 по сравнению с группой PE. ^$ p <0,05 по сравнению с группой ПЭ + экзос-антагомир NC. Данные измерений были представлены как среднее ± стандартное отклонение, а сравнения между несколькими группами оценивались с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим тестом Тьюки

Вестерн-блоттинг и RT-qPCR использовали для изучения роли экзосом у PE крыс. Результаты показали, что экзосомы активировали miR-18b-3p и подавляли LEP у PE крыс, что указывает на подавляющий эффект экзосом на развитие PE. Более того, экзосомы, передающие антагомир miR-18b-3p, индуцировали подавление miR-18b-3p и активацию LEP у PE крыс (рис. 4d-f).

Целевое соотношение между miR-18b-3p и LEP было предсказано программой онлайн-прогнозирования биоинформатики https://cm.jefferson.edu/ (рис. 4g). Анализ двойного люциферазного репортерного гена показал, что миметик miR-18b-3p снижает люциферазную активность LEP 3'UTR-WT, но не влияет на активность LEP 3'UTR-MUT (фиг. 4h). Кроме того, анализ РНК pull-down показал, что обогащение LEP увеличивалось WT-биотинилированным miR-18b-3p (фиг. 4i). Эти данные показали, что LEP является целевым геном miR-18b-3p.

hucMSC-Exos ослабляет патологические характеристики крыс с PE

Результаты САД и 24 ч показали, что не было значительной разницы в САД и 24-часовой протеинурии в 5 группах до введения (10 день беременности). САД и 24-часовая протеинурия на 19-й день беременности не показали четких различий у нормальных крыс. У крыс с PE САД и суточная протеинурия начали повышаться на 13-й день беременности. Не было четкой разницы в уровне САД и 24-часовой протеинурии на 16-й и 19-й день беременности у крыс с PE, получавших hucMSC-Exos и hucMSC-Exos, передающих антагомир NC. САД и 24-часовая протеинурия усилились на 19 день беременности у крыс PE, тогда как это повышение было снижено путем инъекции hucMSC-Exos. Ингибирование miR-18b-3p обращало эффект hucMSC-Exos на САД и 24-часовую протеинурию на 19 день беременности у крыс с PE (рис. 5a, b).

hucMSC-Exos ослабляет патологические характеристики крыс с PE. а Результаты САД у крыс после обработки экзосомами. б Результаты суточной протеинурии у крыс после обработки экзосомами. c Изменение веса плодов крысы после обработки экзосомами. г Изменение веса плаценты у крыс после обработки экзосомами. е Изменения факторов воспаления в сыворотке крови после обработки экзосом определяли с помощью ИФА. нет =10, * p <0,05 по сравнению с нормальной группой. ^# p <0,05 по сравнению с группой PE. ^$ p <0,05 по сравнению с группой ПЭ + экзос-антагомир NC. Данные измерений были представлены как среднее ± стандартное отклонение, а сравнения между несколькими группами оценивались с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим тестом Тьюки

Был измерен вес плода крысы и плаценты, и мы обнаружили, что у крыс PE уменьшился вес плода крысы и плаценты; Подавление miR-18b-3p устраняет роль hucMSC-Exos в массе плода крысы и плаценты у крыс с PE (рис. 5c, d).

Воспалительные факторы в сыворотке крови выявляли с помощью ИФА. Содержание TNF-α, IL-1β и IL-6 заметно увеличивалось у крыс PE. Обработка экзосом уменьшала содержание TNF-α, IL-1β и IL-6 в сыворотке PE крыс, которое было увеличено путем инъекции экзосом, ингибирующих miR-18b-3p (рис. 5e).

Экзосомы облегчают патологические изменения и подавляют апоптоз тканей плаценты у крыс с PE

У нормальных крыс ворсинки плаценты были обильны кровеносными сосудами с четкой структурой, синцитиотрофобласты были основным трофобластом ворсин плаценты, а цитотрофобластов было меньше. У крыс с PE и крыс с PE, получавших hucMSC-Exos-miR-18b-3p-антагомир, количество ворсин плаценты уменьшилось, структура была нечеткой и атрофированной, на некоторых ворсинках был представлен фибриноидный некроз, а количество узелков синцитиотрофобластов в плаценте ворсинки увеличены, и большинство ворсинок были незрелыми. Патологические изменения улучшились у PE крыс, получавших hucMSC-Exos или hucMSC-Exos-antagomir NC, по сравнению с PE крысами и PE крысами, получавшими антагомир hucMSC-Exos-miR-18b-3p (рис. 6a).

Экзосомы облегчают патологические изменения и уменьшают апоптоз клеток тканей плаценты у крыс PE. а Окрашивание HE использовали для тестирования патологических свойств тканей плаценты у крыс PE после обработки экзосомами. б Окрашивание TUNEL применяли для определения апоптотических клеток тканей плаценты у крыс PE после обработки экзосомами. c Скорость апоптоза клеток определяли окрашиванием TUNEL. нет =10, * p <0,05 по сравнению с нормальной группой. ^# p <0,05 по сравнению с группой PE. ^$ p <0,05 по сравнению с группой ПЭ + экзос-антагомир NC. Данные измерений были представлены как среднее ± стандартное отклонение, а сравнения между несколькими группами оценивались с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим тестом Тьюки

Окрашивание TUNEL показало, что у нормальных крыс можно было увидеть небольшое количество апоптотических клеток. Крысы PE имели повышенное количество апоптотических клеток, а снижение miR-18b-3p обращало воздействие hucMSC-Exos на количество апоптотических клеток в тканях плаценты крыс PE (рис. 6b, c).

Обсуждение

ПЭ представляет собой мультисистемное расстройство беременности, характеризующееся протеинурией и повышенным артериальным давлением или другими неблагоприятными состояниями, и связано с широким спектром материнской эндотелиальной дисфункции [20]. Сообщалось, что hucMSC-Exo улучшал морфологию плацентарной ткани у крыс PE за счет подавления апоптоза клеток и облегчения ангиогенеза в плацентарной ткани дозозависимым образом [8]. В исследовании сообщается, что экспрессия miR-18b влияет на миграцию, жизнеспособность и инвазию клеток при PE [12]. Более того, было подтверждено повышение материнской концентрации LEP и гипометилирование LEP в плаценте при раннем начале PE [21]. Настоящее исследование было разработано для изучения влияния экзосом и нацеленных на miR-18b-3p LEP на возникновение PE. Результаты этого исследования показали, что экзосомная miR-18b-3p, происходящая из hucMSC, ингибирует прогрессию PE за счет снижения LEP.

Основываясь на наших выводах, miR-18b-3p снижал, а LEP повышал в тканях плаценты крыс PE. Подобно нашему исследованию, экспрессия мРНК miR-18b была заметно подавлена ​​в тканях плаценты PE по сравнению с таковой в нормальных тканях плаценты [12]. Кроме того, исследование показало, что содержание miR-18b резко снижено в тканях злокачественной меланомы по сравнению с соответствующими соседними неопухолевыми тканями [22]. Другое исследование подтвердило, что экспрессия LEP в плаценте была повышена у недоношенных PE по сравнению с контролем [23]. Более того, исследование показало, что экспрессия LEP явно повышена в преэклампсической плаценте [15]. Эта литература предоставила нам теоретическую основу для изучения аномальной экспрессии miR-18b-3p и LEP при PE. Более того, с помощью биоинформатического программного обеспечения было предсказано, что LEP нацелен на miR-18b-3p, и эта связь нацеливания была дополнительно подтверждена анализом двойного люциферазного репортерного гена в нашем исследовании. Исследование показало, что LEP является мишенью для всех трех miRNAs (miR-1301, miR-223 и miR-224) при раннем начале PE [16]. Другое исследование показало, что LEP снижает экспрессию miR-93 при остеоартрите и ревматоидном артрите [24]. Однако связывание miR-18b-3p и LEP при заболеваниях человека, особенно при PE, остается малоизученным, что является новизной данного исследования. Более того, результаты нашего исследования показали, что экзосомы увеличивают miR-18b-3p и снижают LEP в тканях плаценты PE. Ранее было задокументировано, что экспрессия miR-18b-5p заметно повышается в экзосомах плазмы колоректального рака [25], в то время как взаимосвязь между hucMSC-Exos и miR-18b-3p / LEP при ПЭ требует дальнейшего изучения.

Кроме того, результаты нашего исследования показали, что восстановление miR-18b-3p снижает САД и 24-часовую протеинурию у крыс PE, увеличивает вес плаценты, снижает содержание TNF-α, IL-1β и IL-6 в сыворотке и тканях плаценты. а также подавление апоптоза клеток. Эти данные показали, что повышение уровня miR-18b-3p способствует облегчению симптомов и патологических изменений при ПЭ. Было продемонстрировано, что стабильная повышающая регуляция miR-18b вызывает эффективную активность ингибитора опухоли, такую ​​как подавление жизнеспособности клеток меланомы, индукция апоптоза и уменьшение роста опухоли in vivo [26]. Другой результат нашего исследования заключался в том, что hucMSC-Exos снижал САД и 24-часовую протеинурию у крыс с PE, увеличивал вес плаценты, снижал содержание TNF-α, IL-1β и IL-6 в сыворотке и тканях плаценты, а также подавлял клеточную активность. апоптоз. Результаты настоящего исследования показали, что модели крыс с PE, обработанные экзосомами, показали увеличение количества и качества плодов, качества плаценты, но апоптоз клеток был значительно снижен [8]. Интересно, что предыдущее исследование продемонстрировало, что добавление экзосом плода крупного рогатого скота снижает содержание макрофагов TNF-α и IL-6 [27]. Исследование показало, что очищенные экзосомы подавляют продукцию IL-1β в макрофагах, стимулированных липополисахаридом / нигерицином [28]. Кроме того, Нонг и др. предположили, что воспалительные маркеры, такие как TNF-α и IL-6, резко снизились после введения экзосом, продуцируемых индуцированными человеком плюрипотентными стволовыми клетками МСК [29]. В статье говорится, что САД было заметно повышено в группе женщин, у которых позже развилась ПЭ [30, 31]. Было показано, что пациенты с ПЭ были положительно связаны с САД, диастолическим артериальным давлением и протеинурией [32]. Кроме того, недавнее исследование предоставило доказательство того, что протеинурия усиливается с приближением срока беременности у женщин с ПЭ [33]. Важным открытием было то, что крысы из группы PE имели повышенный TNF-α по сравнению с группой здоровых беременных [34]. Другое исследование подтвердило, что уровни IL-6 и IL-1β в сыворотке крови у женщин с ПЭ были явно повышены по сравнению с контрольной группой [35]. Вышеприведенные данные свидетельствуют о том, что у пациентов с ТЭЛА обычно наблюдается высокое САД, протеинурия и уровни воспалительных факторов. Таким образом, из наших результатов можно сделать вывод, что происходящий из hucMSC экзосомальный miR-18b-3p оказывает терапевтическое действие на ПЭ.

Заключение

В заключение, наше исследование предоставляет доказательства того, что происходящие из hucMSC экзосомы активируют miR-18b-3p, который нацелен на LEP, подавляя содержание воспалительных факторов и снижая скорость апоптоза клеток в тканях плаценты PE крыс, тем самым подавляя возникновение PE. Таким образом, экзосомальная miR-18b-3p может быть потенциальным кандидатом для лечения PE посредством нацеливания на LEP. Это исследование впервые выявило роль происходящей из hucMSC экзосомальной miR-18b-3p в нацеливании на LEP во время развития PE, что дало новое понимание лечения PE. Тем не менее, из-за ограниченности известных исследований, исследование необходимо строго контролировать и надлежащим образом сообщать в будущих клинических испытаниях.

Доступность данных и материалов

Не применимо.