HDAC1 регулирует miR-124-5p и NPY, модулируя обучение и память в депрессивных моделях крыс

Аннотация

Исследования, фокусирующиеся на гистоndeацетилазах (HDAC) при депрессии, проводились обширно, но мало внимания уделялось HDAC1. Настоящее исследование направлено на раскрытие механизма оси HDAC1/микроРНК (miR)-124-5p/нейропептид Y (NPY) при депрессии. Крысам линии Sprague-Dawley индуцировали хроническим непредсказуемым слабым стрессом (ХНСС) для моделирования депрессии. Депрессивным крысам вводили ингибитор HDAC1 или супрессор miR-124-5p для изучения их роли в массе тела, способностях к обучению и памяти, окислительном стрессе и воспалении в сыворотке крови, а также экспрессии нейромедиаторов в гиппокампе. Определяли экспрессию miR-124-5p, HDAC1 и NPY в гиппокампе. Также подтверждали взаимодействия между экспрессией miR-124-5p, HDAC1 и NPY. В гиппокампе депрессивных крыс обнаруживали повышенную экспрессию miR-124-5p и HDAC1 и пониженную — NPY. Ингибирование miR-124-5p или подавление HDAC1 улучшали способности к обучению и памяти и увеличивали массу тела депрессивных крыс. Нокаут miR-124-5p или ингибирование HDAC1 подавляли окислительный стресс и воспаление и стимулировали экспрессию нейромедиаторов у депрессивных крыс. HDAC1 посредничал в регуляции NPY через miR-124-5p. Нокаут NPY устранил защитные эффекты ингибирования miR-124-5p на депрессивных крысах. Наше исследование показывает, что подавление либо miR-124-5p, либо HDAC1 повышает регуляцию NPY, улучшая память и способности к обучению у депрессивных мышей, что может обновить существующие знания о депрессии и предоставить новый ориентир для лечения депрессии.

Введение

Депрессия — это тяжелое ослабляющее психозное расстройство, вызывающее серьезные экономические бремена и социальные последствия во всем мире [1]. Депрессия характеризуется физиологическими, когнитивными и поведенческими изменениями, угрожающими общему здоровью пациентов [2]. Доступные методы лечения депрессии развиваются с применением кетамина как быстродействующего антидепрессанта и уточнением оборудования, способного селективно воздействовать на активность популяций нейронных подтипов [3]. Более того, универсальные наноархитектуры, такие как карбидные точки, применимы для неврологических расстройств [4]. Однако неадекватное лечение депрессии может приводить к низкой производительности, поведенческим нарушениям, соматическим заболеваниям, злоупотреблению веществами и даже суициду [5]. Таким образом, существует острая необходимость в обнаружении инновационных агентов для лечения депрессии.

Ранее документировано, что уровень микроРНК (miR)-124 повышается в плазме при депрессии и приеме антидепрессантов [6]. В ходе депрессии, индуцированной хроническим непредсказуемым слабым стрессом (ХНСС), экспрессия miR-124 в гиппокампе демонстрирует динамические вариации, указывающие на различные патологические изменения на разных стадиях депрессии [7]. Кроме того, miR-124 является кандидатом для улучшения депрессивного поведения при мажорном депрессивном расстройстве [8]. Также подавление miR-124 в префронтальной коре служит антидепрессантом, что отражается в ослаблении депрессивного поведения у мышей [9]. Гистондеацетилаза 1 (HDAC1) является медиатором miR-124 [10], образующим многобелковый комплекс для транскрипционной регуляции и эпигенетических модификаций [11]. Нам известно, что нарушение активности HDAC1 способствует резистентности при мажорном депрессивном расстройстве [12]. Более того, подавление HDAC1 в мозге может улучшать аффективные расстройства и другие нейропластически измененные заболевания мозга [13]. Ингибиторы HDAC могут ослаблять тревожное поведение и потребление алкоголя, а также повышать экспрессию NPY [14]. Также нарушение активности HDAC может приводить к увеличению экспрессии NPY в центральном ядре миндалевидного тела и медиальном ядре миндалевидного тела [15]. NPY — это гипоталамический орексигенный нейропептид, который достаточен для предотвращения тревоги, социальных расстройств и депрессивных симптомов [16]. Кроме того, NPY и его рецепторы доказали антивоспалительные и антидепрессивные эффекты на моделях депрессии у крыс, индуцированной липополисахаридами [17]. В совокупности, совместное взаимодействие оси HDAC1/miR-124-5p/NPY при депрессии остается неясным. Таким образом, данное исследование предназначено для выявления механизма этой оси для исследования терапевтического кандидата для терапии депрессии.

Материалы и методы

Этическое заявление

Животные эксперименты в данном исследовании соответствовали требованиям экспериментальной животноводческой этики Первой пригородной больницы Харбинского медицинского университета. Эксперименты оптимизировали для улучшения условий содержания лабораторных животных, сокращения количества используемых животных и уменьшения их страданий.

Экспериментальные животные

Самцы крыс линии Sprague-Dawley (SD) специфически патогенно- свободного (SPF) класса, массой 200–220 г, предоставлены Центром животных исследований Первой пригородной больницы Харбинского медицинского университета (Харбин, Китай). Крыс содержали в SPF-среде (22–24 °C, влажность 60–64%, 12-часовые циклы света и темноты). За исключением периода моделирования и других конкретных временных точек, крысы имели свободный доступ к воде и корму.

Группировка крыс и создание модели

Смоделированные крысы случайно разделили на 8 групп (n = 10): нормальная группа (крысы без какого-либо воздействия), группа ХНСС (крысы с депрессией, индуцированной ХНСС), группа sh-негативный контроль (НК) (крысы с ХНСС, инъецированные лентивирусом sh-HDAC1 НК), группа sh-HDAC1 (крысы с ХНСС, инъецированные лентивирусом sh-HDAC1), группа anti-miR-NK (крысы с ХНСС, инъецированные лентивирусом anti-miR-124-5p НК), группа anti-miR-124-5p (крысы с ХНСС, инъецированные лентивирусом anti-miR-124-5p), группа anti-miR-124-5p + sh-NK (крысы с ХНСС, инъецированные лентивирусом anti-miR-124-5p и лентивирусом sh-NPY НК) и группа anti-miR-124-5p + sh-NPY (крысы с ХНСС, инъецированные лентивирусом anti-miR-124-5p и лентивирусом sh-NPY).

Модели депрессии у крыс, индуцированные ХНСС, создавали по методу Уиллнера [18]. Крысы в нормальной группе кормили кормом и водой без стимулов, в то время как крысы в остальных 7 группах подвергали 35-дневному ХНСС в отдельных клетках. Эти крысы стимулировали: плаванием в ледяной воде при 4 °C в течение 5 мин в емкости (глубина воды 30 см), инверсией дня и ночи (крысы в темноте 12 ч днем и в ярко освещенном пространстве лампами накаливания 12 ч ночью), зажимом хвоста ласточкой хвоста на 30 с, 1-минутной тряской, 24-часовым голодованием и лишением воды, 30-минутной ультразвуковой стимуляцией (50 Гц), влажной подстилкой и кондиционированием при 17 °C. Крысы случайно стимулировали одним из этих стимулов ежедневно, и один и тот же стимул применяли не более 5 раз всего.

Крыс анестезировали 2% натрия пентобарбитала (50 мг/кг) и двусторонне инъецировали в гиппокамп (антеро-пosterior диаметр = 4,8 мм, медио-латеральное расстояние = ± 2,5 мм, расстояние между задней полостью и передним фонтанеллю = − 3,5 мм) лентивирус со скоростью 1 мкл/мин гамильтоновым микрошприцем с иглой 26 G. Иглу держали в месте инъекции 5 мин для предотвращения рефлюкса. Череп запечатывали костным воском, швы накладывали, и крыс давали восстанавливаться 7 дней [19]. Лентивирус sh-HDAC1 и его НК, лентивирус anti-miR-124-5p и его НК, а также sh-NPY и его НК (титр: 10⁸ TU/мл) приобрели у GenePharma Co. Ltd. (Шанхай, Китай).

Поведенческие функциональные тесты

Крыс взвешивали за день до моделирования ХНСС (день 0), после моделирования ХНСС (день 36) и после лентивирусной интерференции (день 52).

Тест в открытом поле (OFT) позволял обнаруживать автономное и исследовательское поведение крыс в новой среде, что широко использовалось для оценки депрессивного поведения. Тест проводили в черном деревянном ящике открытого поля (100 см × 100 см × 50 см) с системой видеотрекинга над ящиком для записи активности крыс. Дно ящика делили на 25 клеток (20 см × 20 см) белыми линиями. Крыс помещали в центральную клетку в заранее заданном случайном порядке и видеосистемой регистрировали количество переходов через клетки (крысы входят в клетку с конечностями или двумя передними и одной задней лапой) и случаи вставания на задние лапы (крысы поднимают передние лапы и встают вертикально на одной задней лапе). Тест проводили в тихой и полутемной помещении. После каждого теста ящик открытого поля очищали 75% спиртом для удаления запахов.

Ангедония — одно из ключевых симптомов депрессии. Тест на предпочтение сахарозы (SPT) позволял оценивать депрессивное поведение крыс. Перед SPT каждой крысе предоставляли 2 бутылки сахарной воды (1% сахарозы, масс.%) на 24 ч, а затем 1 бутылку стерильной воды и 1 бутылку сахарной воды на еще 24 ч. После этого определяли процент предпочтения сахарозы (SPP) крыс следующим образом: после 23-часового голодования и лишения воды крысам разрешали 1 бутылку стерильной воды и 1 бутылку сахарной воды (1% сахарозы) на 30 мин. Через 1 ч расположение двух бутылок инвертировали, и крысы имели свободный доступ к этим двум бутылкам еще на 30 мин. В течение этого 1 часа измеряли потребление (мл) этих двух бутылок стерильной воды и сахарной воды (1% сахарозы) и рассчитывали SPP. SPP = потребление сахарной воды / (потребление сахарной воды + потребление стерильной воды) × 100%.

Тест лабиринта Морриса (MWM) широко применяли для оценки пространственных способностей к обучению и памяти крыс. Тест MWM проводили в круговой водной ванне (диаметр 150 см, высота 60 см) с глубиной воды 40 см. Температуру воды поддерживали при 22 ± 1 °C, а воду окрашивали в черный цвет нетоксичным и легко удаляемым красителем. Ванну и поверхность воды делили на 4 квадранта (ЮВ, ЮЗ, СЗ и СВ) с соответствующими яркими значками особой формы на внутренней стене. Целевая платформа была круглой прозрачной платформой (диаметр 11 см), расположенной в центре СВ квадранта и погруженной на 1,5 см ниже поверхности воды. Систему видеотрекинга устанавливали над центром ванны для записи скорости плавания, траектории и времени, затраченного крысами на попадание на целевую платформу и плавание в квадрантах. Крыс помещали в воду из 4 квадрантов в случайном порядке и разрешали им исследовать и выбраться на целевую платформу в течение 60 с. Время, затраченное крысами на попадание на платформу, записывали как латентность побега. Если крысы не могли выбраться на целевую платформу в течение 60 с, их направляли, и латентность побега записывали как 60 с. После каждого теста крыс оставляли на целевой платформе на 15 с, а обучение проводили 4 раза в день в течение 5 дней. Конечная латентность побега была средней латентностью побега на 3–5 дни. На 6-й день теста MWM проводили тест пространственного исследования. Целевую платформу удаляли из ванны, а крыспускали в воду из ЮЗ квадранта. Время плавания крыс в СВ квадранте в течение 60 с записывали как время пространственного исследования.

Хронология эксперимента показана на Рис. 1.

Рис. 1. Хронология настоящего исследования

Сбор образцов

За день после последнего теста MWM крыс эвтаназировали и внутрибрюшинно инъецировали 2% натрия пентобарбитала (50 мг/кг). Грудную клетку открывали для получения сердечной крови шприцем, которую центрифугировали 3 раза при 3500 об/мин в течение 15 мин, и supernatант хранили при −20 °C. После сбора крови катетер вводили из левого желудочка в аорту и перфузировали 500 мл физиологического раствора для промывки всей крови. Ткани гиппокампа отделяли и помещали в 1,5-мл центрифужные пробирки, взвешивали и хранили при −80 °C. Часть гиппокампа фиксировали 4% параформальдегидом на 2 ч, дегидратировали градиентным сахарозой и встраивали в парафин.

Определение индексов окислительного стресса и воспаления

Сыворотку разогревали для определения концентрации супероксиддисмутазы (СОД), малондиальдегида (МДА), глутатиона (ГШ), интерлейкина (IL)-β, фактора некроза опухоли-α (TNF-α) и оксида азота (NO). Наборы для определения СОД, МДА и ГШ предоставил Институт биотехнологии Бейотим (Шанхай, Китай), а наборы иммуноферментного анализа (ИФА) для определения IL-β, TNF-α и NO — Наньцзинский институт биоинженерии (Нанкин, Китай).

ГЕ-окрашивание (гемоксилин-эозин)

Парафиновые срезы депарафинизировали, гидратировали этанолом, промывали дистиллированной водой и окрашивали раствором гемоксилина 20 мин. После этого промывали водопроводной водой до синего цвета срезов. Затем помещали срезы в 1% этанольный раствор соляной кислоты на 10 с, промывали водопроводной водой и дегидратировали этанолом, за чем следовала окраска эозином 2 мин, дегидратация высококонцентратным спиртом и проясняние ксилолом. Наконец, срезы монтировали и наблюдали под биологическим микроскопом.

Определение экспрессии нейромедиаторов

Ткани гиппокампа взвешивали и гомогенизировали ультразвуком в физиологическом растворе (100 мкл/10 мг). Гомогенат держали при 4 °C 30 мин, центрифугировали при 12 000 об/мин (4 °C) 3 мин для сбора supernatанта. Белковую концентрацию supernatанта определяли набором для определения белка методом бихиноновой кислоты (BCA) (CWBIO, Пекин, Китай), а уровни экспрессии норадреналина (NA), серотонина (5-HT) и дофамина (DA) — наборами ИФА. Наборы ИФА для NA, 5-HT и DA предоставила компания Liweiping Biotechnology Co., Ltd. (Пекин, Китай).

Обратная транскрипция количественная ПЦР (RT-qPCR)

РНК извлекали из тканей гиппокампа набором для извлечения РНК (Promega, Мэдисон, Висконсин, США), а концентрацию и чистоту РНК определяли ультрафиолетовым спектрофотометром. Следуя инструкциям набора для обратной транскрипции (DRR047S, Takara, Далянь, Китай), выполняли обратную транскрипцию РНК в комплементарную ДНК (кДНК). мРНК обратной транскрибировали в кДНК набором GoldScript one-step RT-PCR Kit (Applied Biosystems, Карлсбад, Калифорния, США), а микРНК — набором Hairpin-it™ miRNA quantitative detection kit (GenePharma). Для определения экспрессии HDAC1, miR-124-5p и NPY в тканях применяли набор RT-qPCR (Promega). U6 использовали как внутренний контроль для miR-124-5p, а β-актин — для HDAC1 и NPY. ПЦР-праймеры получали от Sangon Biotech Co., Ltd. (Шанхай, Китай) (Таблица 1). Относительную экспрессию целевых генов рассчитывали методом 2^−ΔΔCt.

Вестерн-блоттинг

Ткани гиппокампа на льду измельчали и лизировали раствором для радиоиммунoprecипитации (Beijing Solarbio Science & Technology Co. Ltd., Пекин, Китай) для извлечения белка. Белковую концентрацию определяли методом BCA. Общий белок (50 мкг) смешивали с 5× буфером загрузки SDS в соотношении 1:4 и нагревали в кипящей водяной бане 5 мин. Затем белок подвергали электрофрезу в полиакриламидном геле с SDS, электроэлюировали на мембрану и блокировали 5% молоком 1 ч. После этого пробовали первичными антителами против HDAC1 (1:1000, Cell Signaling Technology, Беверли, Массачусетс, США), NPY (1:800, NeoMakers, Фремонт, Калифорния, США) и β-актин (1:1000, Abcam, Кембридж, Массачусетс, Великобритания) на ночь, затем повторно пробовали конъюгированным с перекисным окислителем вторичным антителом. Мембрану развивали усиленной хемолюминесценцией, а оптическую плотность рассчитывали программой Quantity One для анализа серого. Белковая экспрессия целевого гена выражали как отношение значения серого к значению серого β-актина.

Хроматиновый иммунпреципитационный анализ (ChIP)

ChIP-анализ проводили в соответствии с инструкциями набора EZ-ChIP (Millipore, Бедфорд, Массачусетс, США). Клетки HEK293T инкубировали с 1% формальдегидом 10 мин и останавливали глицином. Затем клетки центрифугировали при 2000 об/мин 5 мин и добавляли буфер лизиса SDS для ультразвуковой обработки. Центрифугировали при 10 000 g при 4 °C 10 мин, клетки (100 мкл) реагировали с 900 мкл буфера разбавления ChIP, 20 мкл 50× PIC и 60 мкл ProteinA Agarose/Salmon Sperm DNA при 4 °C 1 ч, и оставляли на 10 мин. Осадок центрифугировали при 700 об/мин 1 мин, 20 мкл брали как вход. В одну пробирку добавляли антитело к HDAC1 (1 мкл) и антитело иммуноглобулина G, в другую — без антитела. Образцы в двух пробирках инкубировали на ночь, элюировали и декрестировали. После извлечения ДНК образец тестировали RT-qPCR.

Анализ двойного люциферазного репортерного гена

Биоинформатический веб-сайт (https://cm.jefferson.edu/rna22/Precomputed/) анализировал места связывания miR-124-5p и NPY. Плазмиды NPY-дикий тип (WT) и NPY-мутант (MUT) сгенерировала компания Huayueyang Biotechnology Co., Ltd. (Пекин, Китай). В сочетании с мимиком НК или мимиком miR-124-5p плазмиды трансфектировали в клетки HEK293T. Люциферазную активность клеток определяли набором для детектирования люциферазы (BioVision) и люминометром Glomax20/20 (Promega).

Статистический анализ

Для анализа данных использовали статистическое ПО SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, USA). Результаты выражали как среднее ± стандартное отклонение. Сравнения между двумя группами тестировали t-критерием Стьюдента. Сравнения среди множества групп оценивали односторонним дисперсионным анализом (ANOVA), после чего попарные сравнения проводили пост-хок тестом Тьюки. P представлял двусторонние тесты, а P < 0,05 считалось статистически значимым.

Результаты

Ингибирование либо HDAC1, либо miR-124-5p увеличивает массу тела депрессивных крыс

Крыс взвешивали за 1 день до моделирования ХНСС (день 0), за 1 день после прекращения моделирования (день 36) и за 7 дней после лентивирусной интерференции (день 52). Различий в массе тела крыс в каждой группе до моделирования не выявлено (все P > 0,05). После моделирования масса крыс снизилась в группе ХНСС, sh-NK, sh-HDAC1, anti-miR-NK и anti-miR-124-5p относительно нормальной группы (все P < 0,05). Несоответствия в массе крыс между группами ХНСС, sh-NK, sh-HDAC1, anti-miR-NK и anti-miR-124-5p не замечено (все P > 0,05). После интерференции масса крыс снизилась в группе ХНСС относительно нормальной группы (все P < 0,05). Несоответствия в массе крыс между группами ХНСС, sh-NK и anti-miR-NK не замечено (все P > 0,05). Масса крыс увеличилась в группах sh-HDAC1 и anti-miR-124-5p относительно их НК-групп (оба P < 0,05), что указывает на то, что ингибирование HDAC1 или miR-124-5p увеличивает массу тела депрессивных крыс (Рис. 2a).

Рис. 2. Ингибирование либо HDAC1, либо miR-124-5p увеличивает массу и улучшает способности к обучению и памяти депрессивных крыс. a Эффекты ингибирования HDAC1 или miR-124-5p на массу тела депрессивных крыс; b SPP до и после ингибирования HDAC1 или miR-124-5p; c Частота переходов через сетку в OFT до и после ингибирования HDAC1 или miR-124-5p; d Частота вставаний в OFT до и после ингибирования HDAC1 или miR-124-5p; e Латентность побега в тесте MWM до и после ингибирования HDAC1 или miR-124-5p; f Время пространственного исследования в тесте MWM до и после ингибирования HDAC1 или miR-124-5p; n = 10; a P < 0,05 по сравнению с нормальной группой; b P < 0,05 по сравнению с группой sh-NK; c P < 0,05 по сравнению с группой anti-miR-NK. Сравнения среди множества групп оценивали односторонним ANOVA, попарные сравнения — пост-хок тестом Тьюки

Ингибирование либо HDAC1, либо miR-124-5p улучшает способности к обучению и памяти у депрессивных крыс

Применяли SPT, OFT и тест MWM для определения SPP, частоты переходов через сетку и вставаний, а также латентности побега и времени пространственного исследования. Устанавливалось, что (Рис. 2b–f) до интерференции, по сравнению с нормальной группой, SPP, частота переходов через сетку, частота вставаний и время пространственного исследования снижались, тогда как латентность побега удлинялась в группах ХНСС, sh-NK, sh-HDAC1, anti-miR-NK и anti-miR-124-5p (все P < 0,05), что указывает на развитие депрессивного поведения у крыс. Несоответствий в SPP, частоте переходов через сетку, частоте вставаний, времени пространственного исследования и латентности побега среди групп ХНСС, sh-NK, sh-HDAC1, anti-miR-NK и anti-miR-124-5p не было (все P > 0,05). После интерференции, относительно групп sh-NK и anti-miR-NK, SPP, частота переходов через сетку, частота вставаний и время пространственного исследования увеличивались, а латентность побега сокращалась в группах sh-HDAC1 и anti-miR-124-5p (все P < 0,05). Различий в SPP, частоте переходов через сетку, частоте вставаний, времени пространственного исследования и латентности побега среди групп ХНСС, sh-NK и anti-miR-NK не наблюдалось (все P > 0,05), что указывает на то, что silencing HDAC1 или подавление miR-124-5p может ослабить депрессивное поведение и улучшить способности к обучению и памяти у крыс.

Ингибирование либо HDAC1, либо miR-124-5p ослабляет патологическое повреждение нейронов у депрессивных крыс

Наблюдение гиппокампальных поражений ГЕ-окрашиванием (Рис. 3a) показало, что аккуратно расположенные нейроны в гиппокампе крыс нормальной группы демонстрировали четкую морфологию, нормальную структуру, плотные слои, четкие ядра ядер и явные нуклеолы. Нейроны крыс группы ХНСС были усушены, уменьшены в числе и рыхло расположены с неравномерно распределенным хроматином и утонченным слоем. Крысы в группах sh-NK и anti-miR-NK показывали ту же картину, что и группа ХНСС. Крысы в группах sh-HDAC1 и anti-miR-124-5p демонстрировали увеличенное количество нейронов в порядке и ослабленное повреждение по сравнению с их НК-группами. Это указывало на то, что нокаут HDAC1 или ингибирование miR-124-5p ослабляли гиппокампальные поражения у депрессивных крыс.

Рис. 3. Ингибирование либо HDAC1, либо miR-124-5p ослабляет патологическое повреждение гиппокампа и повышает экспрессию нейромедиаторов у депрессивных крыс. a ГЕ-окрашивание гиппокампальных поражений депрессивных крыс; b ИФА экспрессии NA в тканях гиппокампа; c ИФА экспрессии 5-HT в тканях гиппокампа; d ИФА экспрессии DA в тканях гиппокампа; n = 6; a P < 0,05 по сравнению с нормальной группой; b P < 0,05 по сравнению с группой sh-NK; c P < 0,05 по сравнению с группой anti-miR-NK. Сравнения среди множества групп оценивали односторонним ANOVA, попарные сравнения — пост-хок тестом Тьюки

Ингибирование либо HDAC1, либо miR-124-5p повышает экспрессию нейромедиаторов у депрессивных крыс

Депрессия связана с нарушениями нейромедиаторов мозга. Поэтому измеряли уровни DA, NA и 5-HT в гиппокампе крыс методом ИФА. Результаты показывали (Рис. 3b–d), что по сравнению с нормальной группой, сниженные уровни DA, NA и 5-HT обнаруживались у крыс групп ХНСС, sh-NK, sh-HDAC1, anti-miR-NK и anti-miR-124-5p (все P < 0,05). Различий в экспрессии нейромедиаторов в группах ХНСС, sh-NK и anti-miR-NK не выявлено (все P > 0,05). Относительно групп sh-NK и anti-miR-NK уровни DA, NA и 5-HT увеличивались у крыс групп sh-HDAC1 и anti-miR-124-5p (все P < 0,05), что подразумевает, что даун-регуляция HDAC1 или снижение miR-124-5p могли повысить уровни DA, NA и 5-HT в гиппокампе депрессивных крыс.

Ингибирование либо HDAC1, либо miR-124-5p подавляет окислительный стресс и воспаление у депрессивных крыс

Измеряли экспрессию окислительного стресса и воспалительных факторов в сыворотке. Относительно нормальной группы активности СОД и ГШ были нарушены, в то время как уровни МДА, IL-1β, TNF-α и NO увеличивались в других группах модели депрессии (все P < 0,05). Активности СОД и ГШ, а также уровни МДА, IL-1β, TNF-α и NO среди групп ХНСС, sh-NK и anti-miR-NK не отличались (все P > 0,05). Относительно групп sh-NK и anti-miR-NK замечено увеличение активностей СОД и ГШ и снижение уровней МДА, IL-1β, TNF-α и NO в группах sh-HDAC1 и anti-miR-124-5p (все P < 0,05) (Рис. 4a–f), что указывает на то, что деплеция HDAC1 или даун-регуляция miR-124-5p могли ослабить окислительный стресс и воспаление у депрессивных крыс.

Рис. 4. Ингибирование либо HDAC1, либо miR-124-5p подавляет окислительный стресс и воспаление у депрессивных крыс. a–c Эффект ингибирования HDAC1 или miR-124-5p на концентрацию СОД, МДА и ГШ в сыворотке депрессивных крыс; d–f Эффект ингибирования HDAC1 или miR-124-5p на концентрацию IL-1β, TNF-α и NO в сыворотке депрессивных крыс; n = 10; a P < 0,05 по сравнению с нормальной группой; b P < 0,05 по сравнению с группой sh-NK; c P < 0,05 по сравнению с группой anti-miR-NK. Сравнения среди множества групп оценивали односторонним ANOVA, попарные сравнения — пост-хок тестом Тьюки

HDAC1 посредничает miR-124-5p для регуляции NPY

Для определения HDAC1, miR-124-5p и NPY в гиппокампе применяли RT-qPCR и вестерн-блоттинг. Устанавливалось, что (Рис. 5a, b) относительно нормальной группы, HDAC1 и miR-124-5p увеличивались, а NPY снижалась в группе ХНСС (все P < 0,05). Экспрессия HDAC1, miR-124-5p и NPY не варьировалась в группах ХНСС и sh-NK (все P > 0,05). Относительно группы sh-NK, группа sh-HDAC1 характеризовалась снижением HDAC1 и miR-124-5p и повышением экспрессии NPY (все P < 0,05). Вышеуказанные выводы свидетельствовали об успешной лентивирусной интерференции и положительной связи между экспрессией miR-124-5p и HDAC1.

Рис. 5. HDAC1 посредничает miR-124-5p для регуляции NPY. a Экспрессия мРНК HDAC1, miR-124-5p и NPY в тканях гиппокампа после ингибирования HDAC1 методом RT-qPCR (n = 6); b Белковая экспрессия HDAC1 и NPY в тканях гиппокампа после ингибирования HDAC1 методом вестерн-блоттинга (n = 6); c Экспрессия мРНК miR-124-5p и NPY в тканях гиппокампа после ингибирования miR-124-5p методом RT-qPCR (n = 6); d Белковая экспрессия NPY в тканях гиппокампа после ингибирования miR-124-5p методом вестерн-блоттинга (n = 6); a P < 0,05 по сравнению с нормальной группой; c P < 0,05 по сравнению с группой sh-NK. Сравнения среди множества групп оценивали односторонним ANOVA, попарные сравнения — пост-хок тестом Тьюки

Также определяли экспрессию miR-124-5p и NPY после подавления miR-124-5p, результаты (Рис. 5c, d) демонстрировали, что относительно нормальной группы, в группе ХНСС наблюдались повышенная miR-124-5p и сниженная NPY (оба P < 0,05). Напротив, группа anti-miR-124-5p показывала тенденцию к снижению miR-124-5p и повышению NPY относительно группы anti-miR-NK (оба P < 0,05). Несоответствий в экспрессии miR-124-5p и NPY в группах ХНСС и anti-miR-NK не признавали (оба P > 0,05). Результаты указывали на успешную лентивирусну интерференцию и негативную связь между NPY и miR-124-5p.

ChIP-анализ проводили для проверки, может ли HDAC1 связываться с промотором miR-124-5p, результаты показывали (Рис. 6a, b), что HDAC1 был связан только с промотором miR-124-5p (P < 0,001), что указывает на то, что HDAC1 может напрямую регулировать miR-124-5p.

Рис. 6. HDAC1 связывается с промотором miR-124-5p. a Объем связывания HDAC1 и промоторной области miR-124-5p в клетках HEK293T методом ChIP (n = 3); b Объем связывания HDAC1 и несвязанных интергенных областей в клетках HEK293T методом ChIP (n = 3); c Место связывания miR-124-5p и NPY по данным биоинформатического веб-сайта; d Целевая связь между miR-124-5p и NPY методом двойного люциферазного репортерного гена (n = 3); Сравнения между двумя группами тестировали t-критерием

Целевая связь между miR-124-5p и NPY предсказывали и верифицировали через инструмент RNA22 и анализ двойного люциферазного репортерного гена (Рис. 6c, d). Относительно клеток ко-трансфекции с NPY-3′UTR-WT и мимиком НК, клетки с ко-трансфекцией NPY-3′UTR-WT и мимиком miR-124-5p показывали сниженную люциферазную активность (P < 0,05). Различий в люциферазной активности в клетках, ко-трансфицированных с NPY-3′UTR-MUT и мимиком НК, и клетках, ко-трансфицированных с NPY-3′UTR-MUT и мимиком miR-124-5p, не признавали (P > 0,05).

Нокаут NPY устраняет защитные эффекты ингибированного miR-124-5p на депрессивных крысах

Спонтанное истощение NPY и miR-124-5p программировали для исследования их взаимодействия у депрессивных крыс. Показывали, что (Рис. 7a, b) более низкий уровень экспрессии NPY замечали в группе anti-miR-124-5p + sh-NPY относительно группы anti-miR-124-5p + sh-NK (P < 0,05). Масса тела и поведенческие функциональные тесты иллюстрировали, что (Рис. 7c–f) по сравнению с группой anti-miR-124-5p + sh-NK, крысы в группе anti-miR-124-5p + sh-NPY демонстрировали сниженную массу, SPP, частоту переходов через сетку, частоту вставаний и время пространственного исследования с увеличенной латентностью побега (все P < 0,05). ГЕ-окрашивание гиппокампальных поражений показывало, что (Рис. 8a) по сравнению с группой anti-miR-124-5p + sh-NK, количество гиппокампальных нейронов снижалось, и гиппокампальные нейроны были темно окрашены, редко и беспорядочно расположены в неправильной форме с уменьшенными клеточными слоями в группе anti-miR-124-5p + sh-NPY. Более того, относительно группы anti-miR-124-5p + sh-NK, крысы в группе anti-miR-124-5p + sh-NPY сопровождались снижением DA, NA и 5-HT (все P < 0,05) (Рис. 8b). Кроме того, нарушенные активности СОД и ГШ, и повышенные уровни МДА, IL-1β, TNF-α и NO существовали у крыс группы anti-miR-124-5p + sh-NPY относительно группы anti-miR-124-5p + sh-NK (все P < 0,05) (Рис. 8c, d). Совокупно, нокаут NPY устранил защитные эффекты подавленного miR-124-5p на депрессивных крысах.

Рис. 7. Нокаут NPY устраняет эффекты ингибированного miR-124-5p на массу тела и поведенческую функцию депрессивных крыс. a Экспрессия мРНК miR-124-5p и NPY в тканях гиппокампа после ингибирования и miR-124-5p, и NPY методом RT-qPCR (n = 6); b Белковая экспрессия NPY в тканях гиппокампа после ингибирования и miR-124-5p, и NPY методом вестерн-блоттинга (n = 6); c Масса тела депрессивных крыс после ингибирования и miR-124-5p, и NPY (n = 10); d SPP депрессивных крыс после ингибирования и miR-124-5p, и NPY (n = 10); e Частота переходов через сетку и вставаний после ингибирования и miR-124-5p, и NPY (n = 10); f Латентность побега и время пространственного исследования после ингибирования и miR-124-5p, и NPY (n = 10); Сравнения между двумя группами тестировали t-критерием

Рис. 8. Нокаут NPY устраняет эффекты ингибированного miR-124-5p на гиппокампальные повреждения депрессивных крыс. a ГЕ-окрашивание гиппокампальных поражений крыс после ингибирования и miR-124-5p, и NPY (n = 6); b ИФА экспрессии NA, 5-HT и DA в тканях гиппокампа крыс после ингибирования и miR-124-5p, и NPY (n = 6); c Эффект ингибированного NPY и подавленного miR-124-5p на концентрацию СОД, МДА и ГШ в сыворотке (n = 10); d Эффект ингибированного NPY и подавленного miR-124-5p на концентрацию IL-1β, TNF-α и NO в сыворотке (n = 10). Сравнения между двумя группами тестировали t-критерием

Обсуждение

Депрессия — это вид психического расстройства, включающий различные состояния с разными симптомами [20]. Хотя новые исследования подразумевали роль микРНК в депрессии, точное действие miR-124-5p редко исследовалось. Поэтому настоящее исследование спроектировано для лучшего понимания механизма оси miR-124-5p/HDAC1/NPY при депрессии с основным результатом, уточняющим, что silencing HDAC1 или miR-124-5p повышает регуляцию NPY для улучшения памяти и способностей к обучению депрессивных крыс.

Во-первых, это исследование обнаружило экспрессию HDAC1 в тканях гиппокампа с выводами, указывающими на повышение экспрессии HDAC1. Затем, с целью расшифровки функциональных ролей HDAC1 у депрессивных крыс, выполняли loss-of-function анализы и раскрывали, что нокаут HDAC1 увеличивал массу тела, улучшал способности к обучению и памяти, ослаблял патологическое повреждение, повышал экспрессию нейромедиаторов и подавлял окислительный стресс и воспаление у депрессивных крыс. В настоящее время исследование подразумевало увеличение экспрессии HDAC1 в депрессивных и тревожных фенотипах, вызванных стрессом-потомством [21]. Более того, экспрессия HDAC1 документирована как повышающаяся в пенумбре при фототромботическом инсульте [22]. Кроме того, инкрементная мРНК экспрессия HDAC1 находится в гранулярных и пирамидных клетках при височной доли эпилепсии [23]. Что касается функциональной роли HDAC1, сообщалось, что вирус-опосредованная сверхэкспрессия нейронного HDAC1 в гиппокампе мышей оказывает влияние на потерю контекстуального страхового памяти в частности [24]. Механически ингибиторы HDAC обращают когнитивные дефициты, найденные в нейродегенеративных заболеваниях и возрастной потере памяти [25]. Фактически, принято, что подавление HDAC1 тиазептами продвинуло нейропластичность и усилило память [26]. Как упоминалось в предшествующем исследовании, заключено, что репрессия HDAC1 ингибирует патогенические процессы, ведущие к дегенерации мотонейронов при митохондриальных заболеваниях [27]. Экспериментально, silencing HDAC1 5-thienyl-substituted 2-aminobenzamide-type частично вовлечен в предотвращение нейронной гибели в моделях болезни Паркинсона [28]. Дополнительно поддерживаемые теми исследованиями, защитные эффекты silenced HDAC1 были свидетельствованы в заболеваниях мозга, включая, но не ограничиваясь депрессией.

Затем наше исследование обнаружило целевую связь между HDAC1 и miR-124-5p, что поддерживалось предшествующим исследованием, предполагающим, что транскрипция miR-124 находится в ведении EVI1, действующего через связь с деацетилазой HDAC1 [29]. miR-124-5p был сверхэкспрессированным геном у депрессивных крыс, и нокаут miR-124-5p имел похожие функции silenced HDAC1 у депрессивных крыс. Фактически, есть исследование, указывающее, что экспрессия miR-124 в гиппокампе повышается с 5 до 6 недель в фенотипах депрессивного поведения [7]. Другое исследование идентифицировало увеличение экспрессии miR-124 у женщин с расстройством употребления кокаина [30]. Также ранее описывалось, что miR-124-3p высоко экспрессируется у стрессированных грызунов при мажорном депрессивном расстройстве [31]. Относительно эффектов, нокаут miR-124 в префронтальной коре сообщается как ослабляющий депрессивное поведение мышей [9]. Кроме того, нокаут miR-124 верится как служащий антидепрессивным агентом хронического кортикостерон-индуцированных гипеносидов у мышей [32]. Из предшествующего исследования следует, что нокаут miR-124 может привести к улучшению поведенческой восприимчивости к более мягкой стрессовой парадигме [33]. Сообщается, что подавление miR-124 лентивирусной трансфекцией в гиппокампе может защищать от кетамин-индуцированной нейродегенерации in vivo и in vitro [34]. В любом случае, подавление miR-124-5p — активный актер для ослабления депрессии.

Более того, экспрессия NPY верифицирована как регулируемая HDAC1 и miR-124-5p. Ухудшенные дефициты, ассоциированные с HDAC2 в гистоновой ацетилировании, могут быть связаны со сниженной экспрессией NPY и использованы для контроля тревожного и пьянствующего поведения [14]. NPY была даун-регулирована у депрессивных крыс, и ап-регуляция NPY способствовала восстановлению способностей к обучению и памяти у депрессивных крыс. В развитии депрессивного поведения крысы-модели проявлялись сниженной экспрессией NPY [17]. Академически, экспрессия NPY доказалась снижающейся у мышей с депрессией [35]. Последовательно, вышеупомянутые выводы исследования совпадают с предыдущей литературой в некоторой степени.

Новые выводы исследования предложили, что ингибированный miR-124-5p или подавленный HDAC1 ослабили способности к обучению и памяти и увеличили массу тела депрессивных крыс. Кроме того, нокаут miR-124-5p или ингибирование HDAC1 подавили окислительный стресс и воспаление и способствовали экспрессии нейромедиаторов депрессивных крыс. Более того, HDAC1 посредничал miR-124-5p для регуляции NPY. В спасательных экспериментах нокаут NPY устранил защитные эффекты ингибированного miR-124-5p на депрессивных крысах.

Заключение

Подводя итог, это исследование подсвечивает эффект оси HDAC1/miR-124-5p/NPY при депрессии с основными выводами, указывающими, что ингибированный miR-124-5p или подавленный HDAC1 ослабили способности к обучению и памяти, увеличили массу тела, подавили окислительный стресс и воспаление, а также способствовали экспрессии нейромедиаторов у депрессивных крыс. Ось HDAC1/miR-124-5p/NPY может дать ориентир для лечения неврологических расстройств, что также может обновить существующие знания о депрессии. Однако дальнейшие исследования все еще необходимы для глубокого понимания сложного механизма оси HDAC1/miR-124-5p/NPY при депрессии.