Nec-1 смягчает нейротоксичность наночастиц диоксида титана в клетках SH-SY5Y через модуляцию RIP1

Аннотация

Наноматериалы из диоксида титана широко применяются благодаря уникальным физико-химическим свойствам, что создает потенциальную угрозу для здоровья. Недавние in vivo исследования показывают, что наночастицы TiO₂ (TNPs) могут проникать в мозг животных через различные пути воздействия, аккумулируясь там и нарушая функцию нейронов. In vitro подтверждена нейротоксичность TNPs, но механизмы неясны. Роль некроптоза (регулируемого некроза) в нейротоксичности TNPs не изучалась. В работе проведено in vitro исследование: TNPs дозазависимо индуцируют воспалительную повреждение в клетках SH-SY5Y, что смягчается предварительной обработкой некростатином-1 (Nec-1). Поскольку рецептор-взаимодействующий протеин-киназа 1 (RIP1) является мишенью Nec-1, его экспрессию подавили siRNA. В клетках с глушением RIP1 и диких типах после воздействия TNPs оценивали воспалительный ущерб. Глушение RIP1 ингибировало воспалительную повреждение, индуцированное TNPs. Таким образом, Nec-1 нейтрализует нейротоксичность TNPs через RIP1. Требуются дальнейшие исследования для комплексной оценки связи нейротоксичности TNPs и RIP1.

Введение

Благодаря уникальным свойствам TiO₂ наноматериалы массово синтезируются и применяются в косметике, промышленности, медицине. Однако массовое использование несет риск для здоровья. Основные пути вхождения: вдыхание и проглатывание. Поражаются дыхательная, пищеварительная, сердечно-сосудистая системы. Мозг также уязвим: TNPs из кровотока проникают через гематоэнцефалический барьер, вдохаемые частицы — через обонятельный путь. Накопление в мозге вызывает необратимые нарушения.

Эпидемиологических связей ТNPs с болезнями мозга нет, но множественные in vivo и in vitro работы подтверждают нейротоксичность. Ранее мы обзорно показали, что в нейротоксичности задействованы апоптоз и аутофагия (программируемые типы гибели клеток). Некроптоз — еще один вид ПГК, RIP1/RIP3-зависимый (в отличие от каспаза-зависимого апоптоза). Активированный RIP1 рекрутирует RIP3 → некрозом → активация MLKL → некроптоз. Некроптоз регулирует гибель клеток и нейровоспаление, оба задействованы в токсичности TNPs. Гипотеза: некроптоз участвует в нейротоксичности TNPs.

Для проверки провели in vitro исследование: измеряли жизнеспособность (CCK-8), LDH-утечку, цитокины (TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8) после воздействия TNPs. Этапы: 1) дозазависимость TNPs; 2) ко-инкубация с Nec-1 (ингибитор некроптоза); 3) глушение RIP1 siRNA, сравнение мутантных и диких типов. Работа проливает свет на молекулярные механизмы нейротоксичности TNPs.

Результаты

TNPs снижают жизнеспособность клеток

CCK-8: SH-SY5Y + TNPs (5–160 мкг/мл) 24/48/72 ч. При 24 ч жизнеспособность не меняется до 40 мкг/мл. При 48 и 72 ч — снижение только в группе 5 мкг/мл незначительно (p=0,45 и 0,10). При 80 мкг/мл — драматическое падение (p=0,0007 и 0,0008). Вывод: токсичность доза- и временизависима, длительное воздействие токсичнее (рис. 1).

TNPs нарушают мембранную целостность

LDH-утечка через 72 ч (рис. 1б): LDH достоверно повышен при дозах >5 мкг/мл. При 40, 80, 160 мкг/мл — p<0,0001. Дозазависимый рост LDH согласуется с CCK-8.

TNPs индуцируют воспаление

ELISA через 72 ч (рис. 2): IL-8uparrow во всех TNPs-группах. TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8 — единообразно повышены при дозах >5 мкг/мл (p<0,01), при >10 мкг/мл — p<0,0001. Воспаление дозазависимо. Для дальнейших экспериментов выбрали 80 мкг/мл, 72 ч.

Nec-1 смягчает нейротоксичность TNPs

Ко-обработка TNPs + Nec-1 (1–20 мкМ). Жизнеспособность (CCK-8): Nec-1 (10, 15, 20 мкМ) драматически восстанавливает жизнеспособность (p<0,0001). 15 и 20 мкМ не лучше 10 мкМ (p>0,05) → далее использовали 10 мкМ.

LDH: в группе TNPs+Nec-1 LDH намного ниже, чем при TNPs одних (p=0,0005). Nec-1 один не повышает LDH (p=0,99).

Цитокины (рис. 4): TNF-α (p=0,003), IL-1β (p=0,0013), IL-6 (p<0,0001), IL-8 (p=0,0004) — все достоверно ниже в группе TNPs+Nec-1. Nec-1 эффективно ингибирует цитопатогенный и воспалительный эффекты TNPs.

Глушение RIP1 предотвращает воспалительную повреждение от TNPs

Эффективно глушили RIP1 siRNA (рис. 5, p<0,0001). Сравнили мутантные (si-RIP1) и дикие (si-NC) клетки после TNPs (80 мкг/мл, 72 ч).

Жизнеспособность: si-RIP1 группа выше si-NC (p=0,0002). LDH: si-RIP1 ниже (p<0,0001). Цитокины (рис. 7): TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8 — все драматически ниже в si-RIP1 (p<0,0001 или p=0,0001). Вывод: TNPs индуцируют воспалительную повреждение через RIP1.

Обсуждение

Установлено: TNPs дозазависимо цитотоксичны для SH-SY5Y; некроптоз задействован в нейротоксичности. Nec-1 (ингибитор некроптоза) смягчает воспалительную повреждение. Поскольку Nec-1 подавляет активность RIP1, глушили RIP1 siRNA — подтвердили, что защитный эффект Nec-1 медиатирован RIP1. В si-RIP1 группе выше жизнеспособность, ниже LDH и цитокины после TNPs. Впервые показано, что некроптоз участвует в TNPs-индуцированной воспалительной повреждении.

Нейротоксичность TNPs переподтверждена: CCK-8 и LDH показывают дозазависимое снижение жизнеспособности и рост мембранного ущерба (p<0,001). Цитокины (TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8) значительно урегулированы (p<0,0001 при 20–160 мкг/мл). Согласуется с литературой: TNPs поглощаются нейронами, ингибируют пролиферацию, снижают жизнеспособность, повышают LDH.

Nec-1 (10 мкМ) значительно ингибирует снижение жизнеспособности, LDH-утечку и выработку всех четырех цитокинов. Это подтверждает нейропротекторный эффект Nec-1.

RIP1 — мишень Nec-1. Глушение RIP1 (si-RIP1) воспроизводит эффект Nec-1: выше выживаемость, ниже LDH и цитокины. RIP1 регулирует и гибель клеток, и воспаление.

Ограничения: 1) Токсичность наночастиц зависит от поверхностных свойств (могут отличаться от объемных), что объясняет противоречивые данные (например, увеличение жизнеспособности у Sebastián et al.). Нужен комплексный нанотоксикологический профиль (пролиферация, мембрана, оксидативный стресс, воспаление, митохондрии, клеточный цикл, цит скелет, эпигенетика). 2) RIP1 рекрутирует RIP3 → некрозом → MLKL. RIP3/MLKL могут участвовать в нейротоксичности TNPs — требует изучения. 3) РОС — основной механизм нейротоксичности TNPs и восходящий сигнал для RIP1. Связь РОС-RIP1 в контексте TNPs нуждается в изучении. 4) Хроническая токсичность: низкие дозы (<5 мкг/мл) длительное время (>72 ч). 5) Необходима проверка на других нейронных линейках и первичных нейронах человека/животных.

Заключение

Некроптоз выявлен как новый механизм программируемой гибели клеток, задействованный в нейротоксичности TNPs. TNPs дозазависимо индуцируют воспалительную повреждение в SH-SY5Y. Nec-1 (ингибитор некроптоза) амелиорирует эти эффекты. Глушение RIP1 (мишени Nec-1) siRNA эффективно предотвращает воспалительную повреждение от TNPs. Вывод: Nec-1 защищает SH-SY5Y от TNPs-индуцированной нейротоксичности, таргетируя путь RIP1. Восходящие (РОС?) и нисходящие (RIP3/MLKL?) сигнальные пути RIP1 в нейротоксичности TNPs требуют дальнейшего изучения.

Материалы и методы

Подготовка TNPs и культура клеток

TNPs характеризовали и готовили по опубликованному протоколу. TNPs растворили в RPMI-1640 (5–160 мкг/мл), стерилизовали, соницировали (300 Вт, 10 мин, комнатная температура) для предотвращения агрегации. Контроль — клетки в среде без TNPs. SH-SY5Y (Cell Bank, Shanghai Institutes for Biological Sciences, CAS) культивировали в RPMI-1640 + 10% ФСК, 100 Ед/мл пенициллин, 100 мкг/мл стрептомицин, 37 °C, 5% CO₂, влажность.

Оценка жизнеспособности и LDH-утечки

CCK-8 (Dojindo): 1×10⁴ клеток/колодец 96-колодчатой пластинки, 24 ч, затем TNPs (0–80 мкг/мл) 24 ч, CCK-8 2 ч, OD 450 нм. Жизнеспособность % = (OD_тр — OD_фон)/(OD_контр — OD_фон) × 100%.

LDH: коммерческий набор (Nanjing Jiancheng). После 72 ч экспозиции TNPs — анализ по инструкции.